抗腫瘤藥物篩選課件

1、抗腫瘤藥物篩選抗腫瘤藥物篩選 侯桂琴侯桂琴 鄭州大學(xué)藥學(xué)院鄭州大學(xué)藥學(xué)院內(nèi)容提要內(nèi)容提要一一 細(xì)胞篩選細(xì)胞篩選二二 微生物學(xué)篩選方法微生物學(xué)篩選方法三三 精原細(xì)胞法精原細(xì)胞法四四 利用分子靶點(diǎn)篩選利用分子靶點(diǎn)篩選五五 動(dòng)物模型動(dòng)物模型六六 基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)一一 細(xì)胞篩選細(xì)胞篩選篩選方法篩選方法1.1.四氮唑藍(lán)（四氮唑藍(lán)（mttmtt）還原法）還原法原理原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲

2、亞砜（dmsodmso）能）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的淺與所含的formazanformazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定定odod值值 實(shí)驗(yàn)組光吸收值（實(shí)驗(yàn)組光吸收值（a a）細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率= = 100% 對(duì)照組光吸收值（對(duì)照組光吸收值（a a）可用細(xì)胞存活率對(duì)劑量作圖求出可用細(xì)胞存活率對(duì)劑量作圖求出ic50ic50值值應(yīng)用：應(yīng)用：生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。感性測(cè)定等

3、。特點(diǎn)：特點(diǎn)：靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測(cè)。：產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測(cè)。步驟：步驟：（1 1）制備）制備單細(xì)胞懸液?jiǎn)渭?xì)胞懸液； (2)(2)對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于9696孔板，一般孔板，一般50005000個(gè)個(gè)/ /孔（可孔（可先做先做細(xì)胞倍增試驗(yàn)細(xì)胞倍增試驗(yàn)確定每孔中最佳細(xì)胞數(shù)）；確定每孔中最佳細(xì)胞數(shù)）；（3 3）將培養(yǎng)板放入）將培養(yǎng)板放入co2co2培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)；培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)；（4 4）24h24h后更換培養(yǎng)基，并在每孔細(xì)胞中加入不同濃后更換培養(yǎng)基，并在每孔細(xì)胞中加入不同濃度藥物，繼續(xù)培養(yǎng)；度藥物，繼續(xù)培養(yǎng)；（5

4、 5）2424或或48h48h以后，加入以后，加入mttmtt溶液，再培養(yǎng)溶液，再培養(yǎng)3-6h,3-6h,停止停止培養(yǎng)，棄取培養(yǎng)基培養(yǎng)，棄取培養(yǎng)基, ,加入加入dmsodmso，每孔，每孔150ul150ul，輕微震，輕微震蕩混勻；蕩混勻；（6 6）把）把9696孔板放入酶標(biāo)儀中，孔板放入酶標(biāo)儀中，490nm490nm測(cè)定吸光度。測(cè)定吸光度。 注意：設(shè)好對(duì)照注意：設(shè)好對(duì)照cck-8cck-8法法2.2.集落形成法：集落形成法：注意：適合貼壁細(xì)胞，細(xì)胞要分散均勻，操作注意：適合貼壁細(xì)胞，細(xì)胞要分散均勻，操作要柔和。要柔和。3.3.臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)特點(diǎn)：懸浮細(xì)胞較方便，貼壁細(xì)胞要特點(diǎn)：

5、懸浮細(xì)胞較方便，貼壁細(xì)胞要進(jìn)行消化，此步誤差大。進(jìn)行消化，此步誤差大。二二 微生物學(xué)篩選方法微生物學(xué)篩選方法 ( (抗腫瘤抗生素抗腫瘤抗生素) )1.1.噬菌體法噬菌體法2.2.細(xì)菌變種法細(xì)菌變種法3.3.抗代謝法抗代謝法1.1.噬菌體法噬菌體法噬菌體：是一類能感染微生物的病毒噬菌體：是一類能感染微生物的病毒（1 1）抗噬菌體法：）抗噬菌體法：干擾干擾dnadna代謝的抗生素如放線菌代謝的抗生素如放線菌素、博來霉素常能抑制噬菌體在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)，素、博來霉素常能抑制噬菌體在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)，從而不產(chǎn)生噬菌體顆粒而出現(xiàn)抗噬菌體的現(xiàn)象。從而不產(chǎn)生噬菌體顆粒而出現(xiàn)抗噬菌體的現(xiàn)象。（2 2）溶原性菌

6、誘導(dǎo)法：）溶原性菌誘導(dǎo)法：除烈性噬菌體外，還有一種除烈性噬菌體外，還有一種噬菌體，其基因組直接螯合到細(xì)菌染色體噬菌體，其基因組直接螯合到細(xì)菌染色體dnadna，不復(fù)，不復(fù)制，因其大部分基因功能受到了制，因其大部分基因功能受到了“阻遏物阻遏物”阻抑，阻抑，這種帶前噬菌體的菌株稱溫和性或溶原性菌。但是這種帶前噬菌體的菌株稱溫和性或溶原性菌。但是當(dāng)當(dāng)“阻遏物阻遏物”的量由于細(xì)胞內(nèi)或環(huán)境因子（物理、的量由于細(xì)胞內(nèi)或環(huán)境因子（物理、化學(xué)）而降低時(shí)，溶原性就不能維持，前噬菌體開化學(xué)）而降低時(shí)，溶原性就不能維持，前噬菌體開始生長(zhǎng)，是細(xì)菌裂解，稱為誘導(dǎo)作用。一些抗腫瘤始生長(zhǎng)，是細(xì)菌裂解，稱為誘導(dǎo)作用。一些抗腫

7、瘤抗生素有誘導(dǎo)能力?？股赜姓T導(dǎo)能力。2.2.細(xì)菌變種法細(xì)菌變種法(1)(1)人工培育變種人工培育變種 如如: :使細(xì)菌模仿腫瘤細(xì)胞的某些代謝特點(diǎn)使細(xì)菌模仿腫瘤細(xì)胞的某些代謝特點(diǎn) 使使細(xì)菌細(xì)菌對(duì)核酸或蛋白合成抑制劑敏感對(duì)核酸或蛋白合成抑制劑敏感(2)(2)檢測(cè)突變作用檢測(cè)突變作用 如如: :依賴鏈霉素的菌株依賴鏈霉素的菌株3.3.抗代謝法抗代謝法 抗代謝物在無機(jī)氮源的合成培養(yǎng)基中顯抗代謝物在無機(jī)氮源的合成培養(yǎng)基中顯示抗菌作用，而在普通有機(jī)氮源的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)示抗菌作用，而在普通有機(jī)氮源的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中無抗菌作用（因?yàn)橛袡C(jī)氮源可將具有抗基中無抗菌作用（因?yàn)橛袡C(jī)氮源可將具有抗菌作用的物質(zhì)代謝），利用此特點(diǎn)

8、，選擇無菌作用的物質(zhì)代謝），利用此特點(diǎn)，選擇無機(jī)氮源試驗(yàn)有抗菌作用的物質(zhì)，作為抗代謝機(jī)氮源試驗(yàn)有抗菌作用的物質(zhì)，作為抗代謝的初篩方法。的初篩方法。三三 精原細(xì)胞法精原細(xì)胞法( (抗生素和植物藥抗生素和植物藥) )1.1.建立依據(jù)建立依據(jù) b b型精原細(xì)胞具有高度敏感性型精原細(xì)胞具有高度敏感性2.2.實(shí)驗(yàn)方法及判定實(shí)驗(yàn)方法及判定 222228g28g雄性小鼠，藥物直接注入睪丸，雄性小鼠，藥物直接注入睪丸，不同濃度，每一濃度用不同濃度，每一濃度用2 23 3只，注射只，注射3 3天，處天，處死動(dòng)物，睪丸固定，石蠟包埋切片，蘇木精死動(dòng)物，睪丸固定，石蠟包埋切片，蘇木精伊紅染色，顯微鏡觀察。伊紅染色，

9、顯微鏡觀察。四四 利用分子靶點(diǎn)篩選利用分子靶點(diǎn)篩選1.1.抑制血管生成的篩選模型抑制血管生成的篩選模型體外：血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體外：血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體內(nèi)：動(dòng)物眼角膜囊體內(nèi)：動(dòng)物眼角膜囊 地鼠頰囊地鼠頰囊 裸鼠外耳皮下裸鼠外耳皮下 雞胚絨毛尿囊膜雞胚絨毛尿囊膜雞胚絨毛尿囊膜模型雞胚絨毛尿囊膜模型 雞胚的生物學(xué)構(gòu)造雞胚的生物學(xué)構(gòu)造尿囊尿囊卵黃囊卵黃囊對(duì)照組低濃度藥物實(shí)驗(yàn)組中濃度藥物實(shí)驗(yàn)組高濃度藥物實(shí)驗(yàn)組操作步驟：操作步驟：（1 1）于實(shí)驗(yàn)前）于實(shí)驗(yàn)前72h72h孵育受精蛋孵育受精蛋（2 2）實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前以照蛋箱透照孵育的種蛋，凡已正常發(fā)育的）實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前以照蛋箱透照孵育的種蛋，凡已正常發(fā)育的種蛋可照見胚

10、胎的影子，用鉛筆做記號(hào)，棄取未發(fā)育種蛋種蛋可照見胚胎的影子，用鉛筆做記號(hào)，棄取未發(fā)育種蛋（3 3）用碘酒、酒精消毒蛋殼。敲碎蛋殼把雞胚移入平皿中，）用碘酒、酒精消毒蛋殼。敲碎蛋殼把雞胚移入平皿中，加入加入eaglefseaglefs培養(yǎng)液培養(yǎng)液5-10ml5-10ml，然后，可選擇在雞胚尿囊膜血管，然后，可選擇在雞胚尿囊膜血管網(wǎng)的任何位置放置小塊明膠海綿作為篩選抗血管生成藥物的網(wǎng)的任何位置放置小塊明膠海綿作為篩選抗血管生成藥物的載體，然后加入不同濃度的血管生成抑制劑。載體，然后加入不同濃度的血管生成抑制劑。（4 4）于加藥后）于加藥后24h24h、48h48h和和72h72h分別在顯微鏡下觀察

11、藥物作用分別在顯微鏡下觀察藥物作用結(jié)果，并照相。結(jié)果，并照相。（5 5）血管計(jì)數(shù)。可結(jié)合自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)、攝像等技術(shù)完成）血管計(jì)數(shù)。可結(jié)合自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)、攝像等技術(shù)完成血管生成抑制率（對(duì)照組血管面積藥物組血管面積）血管生成抑制率（對(duì)照組血管面積藥物組血管面積）/ /對(duì)對(duì)照組血管面積照組血管面積1001002.2.以端粒酶為靶點(diǎn)的藥物篩選以端粒酶為靶點(diǎn)的藥物篩選端粒：真核細(xì)胞染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)。維端粒：真核細(xì)胞染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)。維持染色體穩(wěn)定性。持染色體穩(wěn)定性。 “生命的時(shí)鐘生命的時(shí)鐘” “” “有絲分裂的計(jì)數(shù)器有絲分裂的計(jì)數(shù)器”端粒酶功能：通過其逆轉(zhuǎn)錄酶活性復(fù)制和延端粒酶功能：通過其逆

12、轉(zhuǎn)錄酶活性復(fù)制和延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)端粒dnadna來穩(wěn)定染色體來穩(wěn)定染色體dnadna端粒的長(zhǎng)度。端粒的長(zhǎng)度。端粒酶活性測(cè)定方法端粒酶活性測(cè)定方法端粒酶抑制劑端粒酶抑制劑3.3.細(xì)胞凋亡通路靶點(diǎn)細(xì)胞凋亡通路靶點(diǎn) 細(xì)胞周期調(diào)控靶點(diǎn)細(xì)胞周期調(diào)控靶點(diǎn) 與侵襲相關(guān)的靶點(diǎn)與侵襲相關(guān)的靶點(diǎn) 耐藥相關(guān)的分子靶點(diǎn)耐藥相關(guān)的分子靶點(diǎn) 靶點(diǎn)選擇原則：特異性、有效性、綜合靶點(diǎn)選擇原則：特異性、有效性、綜合性、個(gè)性化性、個(gè)性化五五 動(dòng)物模型動(dòng)物模型 整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法是評(píng)價(jià)一個(gè)藥物是否有效整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法是評(píng)價(jià)一個(gè)藥物是否有效的最主要方法的最主要方法 整體動(dòng)物在腫瘤藥理學(xué)研究中的作用：整體動(dòng)物在腫瘤藥理學(xué)研究中的作用： 1.1.研

13、究新開發(fā)藥物對(duì)腫瘤的防治作用；研究新開發(fā)藥物對(duì)腫瘤的防治作用； 2.2.抗腫瘤藥物篩選及抗腫瘤機(jī)理探索；抗腫瘤藥物篩選及抗腫瘤機(jī)理探索； 3.3.探索藥物和目前常規(guī)腫瘤治療方法的探索藥物和目前常規(guī)腫瘤治療方法的 綜合應(yīng)用以提高療效。綜合應(yīng)用以提高療效。常用宿主動(dòng)物：常用宿主動(dòng)物： 裸小鼠裸小鼠（“活的試管活的試管”） 特點(diǎn)：特點(diǎn)：先天無毛，無胸腺，先天無毛，無胸腺，t t淋巴細(xì)胞功能淋巴細(xì)胞功能 完全缺失，對(duì)異種移植不產(chǎn)生排斥反應(yīng)。完全缺失，對(duì)異種移植不產(chǎn)生排斥反應(yīng)。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：費(fèi)用高，飼養(yǎng)條件高，不宜大量繁殖。費(fèi)用高，飼養(yǎng)條件高，不宜大量繁殖。 一般不用于初篩。一般不用于初篩。 應(yīng)用：應(yīng)用

14、：觀察藥物對(duì)癌細(xì)胞逆轉(zhuǎn)作用，觀察藥物對(duì)癌細(xì)胞逆轉(zhuǎn)作用， 抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用。抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用。c57bl/6c57bl/6小鼠小鼠 特點(diǎn)特點(diǎn)：黑毛，體型小，性情溫順，：黑毛，體型小，性情溫順， 易飼養(yǎng)，藥敏性好，為研究易飼養(yǎng)，藥敏性好，為研究 lewislewis肺癌首選。肺癌首選。 應(yīng)用：應(yīng)用：藥物體內(nèi)初篩。藥物體內(nèi)初篩。模型建立方法模型建立方法實(shí)體瘤建立實(shí)體瘤建立1.1.小塊瘤體接種法小塊瘤體接種法2.2.腫瘤細(xì)胞懸液接種法腫瘤細(xì)胞懸液接種法3.3.培養(yǎng)細(xì)胞移植法培養(yǎng)細(xì)胞移植法治療方案：治療方案：接種后生長(zhǎng)至接種后生長(zhǎng)至可觸及可觸及即可治療，依藥物即可治療，依藥物特性及研究目的確

15、定方案，可給藥一次，或連續(xù)特性及研究目的確定方案，可給藥一次，或連續(xù)幾次，或一周幾次連續(xù)幾周。幾次，或一周幾次連續(xù)幾周。療效評(píng)價(jià)：療效評(píng)價(jià)：腫瘤抑制率（對(duì)照組瘤重給藥組瘤重）腫瘤抑制率（對(duì)照組瘤重給藥組瘤重）/ /對(duì)照組對(duì)照組瘤重瘤重100100腹水瘤建立及評(píng)價(jià)：腹水瘤建立及評(píng)價(jià)：評(píng)價(jià)：對(duì)照組通常評(píng)價(jià)：對(duì)照組通常2-32-3周內(nèi)死亡，治療組一般觀察周內(nèi)死亡，治療組一般觀察50d50d左右，計(jì)左右，計(jì)算生命延長(zhǎng)率。算生命延長(zhǎng)率。生命延長(zhǎng)率（治療組平均存活天數(shù)對(duì)照組平均存活天數(shù)）生命延長(zhǎng)率（治療組平均存活天數(shù)對(duì)照組平均存活天數(shù)）/ /對(duì)照組平均存活天數(shù)對(duì)照組平均存活天數(shù)100100注意事項(xiàng)：注意事

16、項(xiàng)：1.1.取材時(shí)取實(shí)質(zhì)部位，不要取壞死、液化部位，防止污染。取材時(shí)取實(shí)質(zhì)部位，不要取壞死、液化部位，防止污染。2.2.試驗(yàn)前先飼養(yǎng)裸鼠一周，以適應(yīng)新環(huán)境，若死亡超過試驗(yàn)前先飼養(yǎng)裸鼠一周，以適應(yīng)新環(huán)境，若死亡超過10%10%不不可用，一般可用，一般18-22g18-22g，4-64-6周齡。周齡。3.3.飼養(yǎng)環(huán)境及鼠籠、墊料、飼料嚴(yán)格消毒飼養(yǎng)環(huán)境及鼠籠、墊料、飼料嚴(yán)格消毒4.4.保持恒溫，一般保持恒溫，一般252511，濕度，濕度40-60%40-60%，每天，每天10h10h光照、光照、14h14h黑暗。黑暗。 1 3 5 7 9 11 13 15dayst u m o r valume (

17、mm3)acabcdba b六六 基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)1.1.原理原理 是一種建立在雜交測(cè)序基本理論上的全新是一種建立在雜交測(cè)序基本理論上的全新技術(shù)，它利用固定在芯片上的幾萬至幾十萬技術(shù)，它利用固定在芯片上的幾萬至幾十萬條探針與樣品進(jìn)行雜交，在一步實(shí)驗(yàn)中獲取條探針與樣品進(jìn)行雜交，在一步實(shí)驗(yàn)中獲取大量的信息。大量的信息。2.2.基本技術(shù)路線基本技術(shù)路線基因的選擇與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)基因的選擇與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫選擇根據(jù)表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫選擇5000-100005000-10000個(gè)與發(fā)育及疾病相關(guān)的基因，制備藥個(gè)與發(fā)育及疾病相關(guān)的基因，制備藥物篩選芯片。物篩選芯片。芯片的制備芯片的制備細(xì)胞的培養(yǎng)與藥物刺激細(xì)胞的培養(yǎng)與藥物刺激根據(jù)目的藥物及表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)庫中細(xì)胞根據(jù)目的藥物及表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)庫中細(xì)胞表達(dá)譜選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系，用適當(dāng)計(jì)量的藥物表達(dá)譜選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系，用適當(dāng)計(jì)量的藥物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，不同的時(shí)間取樣，抽提刺加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，不同的時(shí)間取樣，抽提刺激前后的激前后的mrnamrna。大白鼠飼養(yǎng)與藥物刺激大白鼠飼養(yǎng)與藥物刺激用常規(guī)方法飼養(yǎng)大白鼠，用適當(dāng)劑量的