凍干蟾皮凝膠劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及初步藥效學(xué)研究

1、凍干蟾皮凝膠劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及初步藥效學(xué)研究摘要 目的 建立凍干蟾皮凝膠劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和初步藥 效學(xué)研究。方法 采用薄層色譜TLC法對制劑中的華蟾酥 毒基和酯蟾毒配基進行定性鑒別，高效液相色譜HPLQ法測定華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量， 色譜柱 kromasil C18 4.6 mm X 250 mm ,5 卩 m;流動相：乙腈A-水B 48?U52; 流速：1 mL/min ;檢測波長：296 nm;柱溫：30 C；進樣量： 10卩L。采用S180腹水型實體瘤小鼠進行初步抑瘤藥效學(xué)研 究。結(jié)果 硅膠 G 薄層板上， 在與對照品色譜對應(yīng)的位置上， 顯示相同顏色的熒光斑點，且斑點大小適中，別離度良好。 華蟾

2、酥毒基和酯蟾毒配基分別在4.48 p, g/mL ,10.24 p g/mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度存在良好的線性 關(guān)系、0.9996 。加樣回收率n=6為 100.27%、 101.68%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 1.56%、 1.67%。初步藥效學(xué)結(jié)果 顯示凍干蟾皮凝膠劑不同劑量組均有顯著抗腫瘤作用，且高 劑量組效果最正確，抑瘤率為48.03%。結(jié)論 建立了凍干蟾皮凝膠劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，初步藥效學(xué)說明凍干蟾皮凝膠劑具有顯著 抗腫瘤作用。關(guān)鍵詞 凍干蟾皮凝膠劑;質(zhì)量 ?俗跡豢怪琢觶換 ?蟾酥 毒基;酯蟾毒配基中圖分類號 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1673-7210(2021)04(a)-0029

3、-05Abstract Objective To establish the quality standard and preliminary pharmacodynamic study of Freeze-dried Toad Skin Gel. Methods TLC was used for the qualitative identification of Cinobufagin and Resibufogenin ， HPLC was adopted to determine content of Cinobufagin and Resibufogenin. Chromatograp

4、hic column : kromasil C18 (4.6 mm x 250 mm , 5 i m); flowing phase : acetonitrile (A)- water (B) (48 : 52)； flow rate ： 1 mL/min ； UV detection wavelength ： 296 nm ; column temperature : 30 C； the volume : 10 i L. S180 ascites solid tumor mice were used to study the pharmacodynamics of inhibition of

5、 tumor growth. Results The fluorescence spots of the same color were shown in the corresponding position of the Silica gel G thin layer ， and the spot size was moderate and the separation degree was good. Cinobufagin and Resibufogenin showed good linearity between the peak area and the concentration

6、 in the range of 0.056-4.48 i g/mL () and 0.256-10.24 i g/mL ()， respectively. The sample recovery rate(n=6) was 100.27%， 101.68%， RSD was 1.56% and 1.67%. The Preliminary pharmacodynamics study showed that all groups ofFreeze-dried Toad Skin Gel had significant anti-tumor effect ， and the high-dose

7、 group had the best effect ， with the inhibitory rate of 48.03%. Conclusion The quality standard of Freeze-dried Toad Skin Gel is established， and the preliminary pharmacodynamics shows that it has a significant anti-tumor effect.Key words Freeze-dried Toad Skin Gel； Quality standard ； Anti-tumor ；

8、Cinobufagin ； Resibufogenin蟾皮( Corium bofonis )，又稱蛤 ?M 皮(?醫(yī)方約說? )， 癩蟆皮(?中藥材手冊? )，蟾蜍皮、蛤蟆皮( ?中草藥學(xué)? )， 為蟾蜍科動物中華大蟾蜍( Bufo bufogargarizans Cantor )或 黑眶蟾蜍( Bufo melanostictus Schneider )的枯燥皮，自古至 今沿用，其性味辛、涼、微毒，主入胃經(jīng)，具有清熱解毒， 利水消脹的成效，近年來，用于多種癌癥的治療和配合放、 化療，不僅能夠有效抑制癌細(xì)胞的過度增殖，還具有改善血 象，減輕放、化療毒副作用的成效 1-3 。凍干蟾皮凝膠劑為

9、鮮蟾皮低溫冷凍枯燥后采用超微粉碎技術(shù)4 ，并輔以高分子材料為基質(zhì)制成的外用凝膠劑 5-7 ，該劑型劑量可控，透皮 吸收迅速 8-9 ，藥物吸收干擾因素小，防止藥物的肝臟首過 作用10-11 ，血藥濃度穩(wěn)定， 能夠有效提高藥物生物利用度， 并可反復(fù)敷貼，隨時停藥，使用方便，對皮膚無刺激性和致 敏性 12-14 。 2.2.8 重復(fù)性試驗 精密平行稱取同一 批凍干蟾皮凝膠劑 6 份，按照“ 項下供試品制備方法 制備，所得樣品按以上色譜條件連續(xù)平行進樣 6 次，分別測 定華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量。結(jié)果顯示，華蟾酥毒基和 酯蟾毒配基？舛？RSD均小于3% 表2,說明該方法重現(xiàn)性 良好。229穩(wěn)定性試

10、驗精密稱取凍干產(chǎn)品凝膠劑0.4 g,按照“供試品處理方法制備供試品溶液。 分別于 0、2、4、 8、16、24 h 時注入液相色譜儀，測定供試品溶液中華蟾酥 毒基和酯蟾毒配基含量，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果顯示：華蟾酥 毒基和酯蟾毒配基濃度RSD均小于2% 表3，說明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。2.2.10 回收率試驗 精密稱取對照品華蟾酥毒基和酯蟾毒配基適量，參加到濃度兩者含量的供試品中，在以上 色譜條件下，測定兩者含量，計算加樣回收率。結(jié)果顯示， 華蟾酥毒基和酯蟾毒配基平均回收率分別為100.27%、101.68%，RSD均小于2% 表4、5，說明該方法準(zhǔn)確性良 好。2.2.11 含量測定方法

11、 分別取批號 20210322、 20210327 和 20210411 共 3 批凍干蟾皮凝膠劑，按照“ 項下的 供試品制備方法處理， 平行制備 6份供試品溶液。按照“ 項下的色譜條件進樣10卩L,測定峰面積。測得樣品中華蟾 酥毒基分別為 、卩g/g ;酯蟾毒配基分別為、卩g/g。結(jié)果說明，即每I克凝膠所含華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量分別不得低于190卩g和180卩g,兩者總量不低于 370卩go2.3 初步藥效學(xué)研究2.3.1 S180荷瘤小鼠模型建立 自液氮罐中取出 S180腹 水型腫瘤細(xì)胞株1支，置于37 C電熱恒溫水浴鍋內(nèi)，輕輕搖動使其緩慢融化，取出凍存管，用酒精消毒后備用，吸出細(xì) 胞

12、懸液，注入離心管并滴加 15%胎牛血清 RPMI-1640 培養(yǎng)基， 制成腫瘤細(xì)胞混懸液，臺盼藍(lán)計數(shù)約為1 X 107/mL瘤細(xì)胞。消毒小鼠背臀部，取 0.2 mL 1X 1062X 106個瘤細(xì)胞接 種于皮下，傳代3次11-12。選擇接種8 d的S180荷瘤小鼠， 脫頸處死，抽取小鼠腹腔內(nèi)腹水，用生理鹽水適當(dāng)稀釋后， 計數(shù)， 調(diào)整濃度至 2X 107，用無菌注射器吸取瘤細(xì)胞混懸液 注射在小鼠背臀部，每只 0.2 mL， 46 d 后背臀部測量腫瘤 體積均達(dá) 5080 mm3o實驗分組和給藥 接種瘤細(xì)胞后的ICR小鼠60只， 稱重記錄體重，按體重和性別隨機分為 6 組，分別為凍干蟾 皮凝膠劑高

13、劑量組4 g/kg 蟾皮高劑量組、凍干蟾皮凝膠劑 中劑量組2 g/kg 蟾皮中劑量組、凍干蟾皮凝膠劑低劑量組 1 g/kg 蟾皮低劑量組、蟾酥凝膠劑中劑量組 0.054 g/kg 蟾 酥中劑量組 、空白凝膠劑組陰性組、環(huán)磷酰胺組 0.5 mg/20 g 陽性組，每組10只，每只均單籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫為22 2C，濕度為50 10 %。所有小鼠均于 12 h光照和12 h黑暗環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)數(shù)天，自由飲食飲水。 給藥之前禁食12 h，全程不禁水。2.3.3 數(shù)據(jù)收集 除陽性組腹腔注射外，其余組別均采用背臀部涂抹給藥連續(xù) 20 d，觀察記錄小鼠的一般情況外觀、 毛色、飲食、行為、分泌物、排泄物

14、、中毒表現(xiàn)和死亡情況 等，每日稱荷瘤小鼠重量，停藥后第 2 天記錄體重，處死 后解剖，剝?nèi)∧[瘤組織、脾臟、胸腺，電子天平精密稱重。2.3.4 檢測指標(biāo) 抑瘤率% = 1-實驗組平均瘤重 /陰性 對照組平均瘤重x 100%；脾指數(shù)=脾重量mg /體重g; 胸腺指數(shù) =胸腺重量 mg /體重 g。2.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用 SPSS 版統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理， 計量資料數(shù)據(jù) 以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差x s表示，多組數(shù)據(jù)間比擬采用方差分 析，兩兩比擬米用 LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用x 2檢驗。以 P 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義2.5 實驗結(jié)果在觀察期間小鼠的一般情況總體良好，由于腫瘤接種于 小鼠背臀部

15、， 該部位血管分布較少， 導(dǎo)致腫瘤生長相對緩慢， 對小鼠活動能力無顯著影響，實驗過程中無小鼠死亡。在接 種后57 d,肉眼可見實體瘤生成，各組小鼠給藥后的抑瘤 率情況比擬，所有給藥組均與陰性組比擬，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 P 。見表 6。3 討論本品性狀為深灰色半固體， pH值介于57之間，與人體皮膚值相近，有利于延長藥物在皮膚外表的滯留時間。在 定性定量測定中，均采以甲醇為溶劑將凝膠劑溶解分散后加 熱回流，過膜、測定，使主藥盡可能溶出，同時可去除輔料 的干擾。薄層色譜鑒別參照?中國藥典? 2021 年版四部 通那么 0502 薄層色譜法試驗華蟾酥毒基和酯蟾毒配基采用環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮4 : 3

16、 : 3展開，10%硫酸乙醇溶液顯 色，紫外 365 nm 處分別顯示黃色和藍(lán)紫色熒光，陰性無干 擾。采用HPLC測定制劑中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量， 色譜條件為色譜柱：kromasil C18 4.6 mm x 250 mm ,5 卩 m瑞典 ；流動相：乙腈 A -水 B 48?U52 ；流速： 1 mL/min；柱溫：30C ；檢測波長：296 nm。在上述實驗條件下，測得 凍干蟾皮凝膠劑中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基總量不低于 380 卩g/g，該測定方法簡便易行，精密度、重現(xiàn)性良好。蟾酥中以華蟾酥毒基和酯蟾毒配基為代表的脂溶性成分，具有較強的抗腫瘤活性，本課題采用蟾皮和蟾酥分別制 成凝膠劑

17、給藥后，發(fā)現(xiàn)在相同含量的有效成分下，兩者對腫 瘤的抑制率不存在顯著性差異。腹腔注射陽性藥環(huán)磷酰胺抑 瘤率較差，可能原因為本課題采用背部皮下接種，腹腔注射 為全身作用，對于局部治療效果較差。脾臟和胸腺是機體重 要的免疫器官，二者對細(xì)胞毒藥物敏感性較高，在化療藥物 作用下明顯萎縮，其組織結(jié)構(gòu)發(fā)生器質(zhì)性損傷，是評價藥物 療效的重要免疫指標(biāo)。 本實驗由于條件限制未對凝 膠劑微生物限定和皮膚刺激性進行研究，課題組將繼續(xù)完善 制劑的相關(guān)研究，同時僅完成初步藥效學(xué)研究，后續(xù)將進行 細(xì)胞水平和整體水平完整的藥效學(xué)研究，為后續(xù)的新藥研發(fā) 奠定根底。參考文獻(xiàn) 1 張振海，王晉艷，陳彥，等 .不同品種及產(chǎn)地蟾皮中

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