登革熱試驗室檢測指引教材

1、附件 2登革熱實驗室檢測指南一、目的（一）及時發(fā)現(xiàn)、診斷病例。（二）及時了解伊蚊媒介攜帶登革病毒狀況。（三）病毒分型和溯源。（四）為登革熱流行趨勢的預測、 預警和制定防治對策、 措施提供科學依據(jù)。二、檢測對象（一）疑似和臨床診斷病例（按照登革熱診斷標準 WS216-2008）。（二）伊蚊成蚊和幼蟲。三、樣本采集、保存和運輸（一）臨床標本采集用無菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及時分離血清，分裝 2 份，保存于 帶螺旋蓋、內(nèi)有墊圈的凍存管內(nèi)， 標記清楚后低溫保存， 其中 1 份用于現(xiàn)場實驗 室檢測， 1 份用于上級預防控制機構(gòu)復核（附件 1，附表 1）。1. 登革熱臨床診斷病例及疑似病例，每次采

2、集血液標本 5mL 。2. 登革熱臨床診斷和疑似的住院病例（包括初篩陰性），應(yīng)采集雙份血液標 本，入院當天和出院前 1 天各一份。3. 疫點首發(fā)病例，必要時應(yīng)采集第二份血標本，距第一份血樣采集日期間隔 在 7 天以上。（二）蚊媒標本采集疫點內(nèi)采集的伊蚊成蚊及幼蟲， 分類鑒定后， 填寫媒介標本采集信息表， 按 照采集地點分裝，每管 10-20 只。（三）標本保存、運送標本應(yīng)-70以下保存，血液標本可 -20以下保存，但不超過 1 周。 標本運送時采用低溫冷藏運輸， 避免凍融，樣本運輸應(yīng)遵守國家相關(guān)生物安 全規(guī)定。四、檢測內(nèi)容（一）實驗室檢測 登革熱疑似病例發(fā)生所在地醫(yī)院和 / 或縣（市）疾控機構(gòu)

3、采集病例血清，檢 測登革病毒抗原、核酸或抗體，檢測流程參見圖 1。（二）復核檢測1. 送市或省級疾病預防控制機構(gòu)的臨床標本，抽樣 30%進行復核檢測，疫點 首發(fā)病例需采用病原學和 /或雙份標本血清學方法復核檢測，暴發(fā)疫情復核檢測 不少于 5 例，疫情少于 5 例者應(yīng)全部檢測，病毒核酸陽性標本應(yīng)分型檢測。2. 疫點首發(fā)病例，重癥病例、輸入病例急性期標本應(yīng)采用PCR 方法進行分型檢測，陽性者分離病毒，從臨床標本或所分離病毒中擴增 E 蛋白編碼基因， 完成序列分析。3. 每次暴發(fā)疫情應(yīng)開展病毒全基因組序列分析。4. 實驗室檢測陰性臨床病例以及重癥病例，應(yīng)對恢復期血清進行IgM 、IgG抗體和 /或中

4、和抗體檢測。（三）媒介標本檢測1. 核酸檢測 捕獲的伊蚊成蚊或幼蟲，進行核酸分型檢測，并擴增病毒 E 蛋白編碼基因， 完成序列分析。2. 病毒分離病毒核酸陽性的標本由國家、 省或有條件的市級疾病預防控制機構(gòu)進行病毒 分離、基因組序列分析圖 1 登革熱疑似病例實驗室檢測流程五、實驗室檢測方法（一）臨床標本檢測1、病原學檢測 病原學檢測主要適用于急性期血液標本。（1）抗原檢測：一般發(fā)病后 6 天內(nèi)血液標本 NS1 抗原檢出率高。標本中檢出 NS1 抗原可以確診病毒感染， 適用于現(xiàn)場快速檢測， 可用于早期診斷 （附件 2 ，3）。（2）核酸檢測：一般發(fā)病后 6 天內(nèi)血液標本病毒核酸檢出率高。在病人血

5、 清中檢出病毒核酸， 可確診而且能夠分型， 可用于早期診斷， 但核酸檢測容易因 污染而產(chǎn)生假陽性，因此要求嚴格分區(qū)操作（附件 4）。（3）病毒分離：一般發(fā)病后 5 天內(nèi)血液標本病毒分離率較高。將標本接種 于蚊源細胞（C6/36）或哺乳動物細胞 （BHK21 、Vero）進行分離培養(yǎng) （附件 5）， 出現(xiàn)病變以后，用檢測抗原或核酸的方法鑒定病毒。分離到登革病毒可以確診， 但其耗時長，不適于快速診斷。2. 血清學檢測血清學特異性抗體檢測主要適用于發(fā)病 5 天以后血液樣本，但需注意可能與 其他黃病毒感染發(fā)生交叉反應(yīng)。（1）血清特異性 IgM 抗體：采用 ELISA 、免疫層析等方法檢測。 IgM 抗

6、體 陽性，提示患者可能新近感染登革病毒， 適用于登革熱早期診斷， 但單份標本不 能確診（附件 6）。（2）血清特異性 IgG 抗體：采用 ELISA 、免疫熒光（ IFA ）、免疫層析等 方法檢測。患者恢復期血清 IgG 抗體陽轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈 4 倍及以上升高可 以確診（附件 7，8）。（3）中和抗體：采用空斑減少中和實驗、微量中和實驗等方法檢測，可用 于分型?；颊呋謴推谘逯泻涂贵w陽轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈 4 倍及以上升高可以確 診。（二）媒介標本檢測1. 標本處理將分類后的伊蚊成蚊或幼蟲，按照采集地點，每 1020 只為一份進行研磨 處理（附件 9）。2. 病毒核酸檢測用 RT-PCR 的

7、方法進行登革病毒核酸檢測（見附件 4 ）。3. 病毒分離病毒核酸陽性的標本進行病毒分離（見附件 5）。六、實驗室質(zhì)量控制（一）標本采集、保存和運送采集的標本要做好標識， 并記錄標本的基本信息和流行病學信息， 按本指南 要求采集、保存和運送。（二）實驗室檢測1.根據(jù)發(fā)病時間，按本指南要求選擇不同的檢測方法。2.核酸檢測要防止各種污染，按操作規(guī)范設(shè)立相應(yīng)對照。3. 應(yīng)對檢測試劑開展質(zhì)控評價。（三）各級疾病預防控制機構(gòu)應(yīng)定期開展督導檢查、 實驗室技術(shù)人員培訓與 考核，及時發(fā)現(xiàn)問題。七、結(jié)果的報告和反饋疫點首發(fā)病例、重癥病例和輸入病例實驗室檢測結(jié)果 24 小時內(nèi)反饋標本送 檢單位。省級疾病防控機構(gòu)應(yīng)每

8、年 1 月將上一年登革熱實驗室病原學（包括核酸檢 測、病毒分離、序列測定）監(jiān)測結(jié)果，報國家疾病預防控制中心（見附表2），將結(jié)果發(fā)送至 denguetest。八、生物安全登革熱實驗室檢測應(yīng)按照 病原微生物實驗室生物安全管理條例 等相關(guān)規(guī) 定要求，做好生物安全工作。附件：1.血液標本采集 .血清分離 .運送 .保存標準化操作程序2.酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒 NS1 抗原標準操作程序3. 免疫層析法檢測登革病毒 NS1 抗原標準操作程序4. RT-PCR 法分型檢測登革病毒核酸標準操作程序5. 細胞培養(yǎng)分離登革病毒6.IgM 捕捉 ELISA 法( MacELISA )檢測登革熱 IgM 抗體7. 酶

9、聯(lián)免疫法檢測登革病毒 IgG 抗體標準操作程序8. 免疫熒光法檢測登革病毒 IgG 抗體標準操作程序9. 蚊媒標本處理標準操作程序 附表：1.疑似登革熱病人檢材送檢一覽表2.病原學檢測結(jié)果一覽表附件 1血液標本采集、血清分離、運送、保存標準化操作程序1 目的正確采集血液標本、分離血清、運送和保存。2 范圍 適用于有資質(zhì)的人采集登革熱患者或疑似患者血液標本、分離血清、編號、 分裝、保存和運送。3 操作步驟3.1 采血3.1.1 用 70%酒精擦拭靜脈穿刺部位待 30 秒鐘以上。3.1.2 然后用一根碘酊或碘伏棉簽消毒皮膚（ 1-2%碘酊 30 秒或 10%碘伏消 毒 60 秒），從穿刺點向外以

10、1.5-2cm 直徑畫圈進行消毒。3.1.3 用 70%酒精脫碘。3.1.4 嚴格執(zhí)行三步消毒后 （注意對碘過敏的患者，只能用 70%酒精消毒， 消毒 60 秒鐘），待穿刺部位酒精揮發(fā)干燥用無菌真空管， 采集患者非抗凝血 5mL。3.2 分離血清 3.2.1輕緩顛倒采血管數(shù)次，使血液與促凝劑混勻后靜置，待血塊完全凝固 （放置時間過長會造成溶血，避免留置過夜）。3.2.23000rpm離心， 5 分鐘，然后用無菌吸管小心取上清轉(zhuǎn)入 3支凍存管， 應(yīng)避免吸取血細胞。3.2.3 標記。用標簽紙或持久性標記筆在凍存管的側(cè)壁標記標本編號，頂端 標記序列號，標記清楚后將血清放進標本盒，保存于2-8冰箱待初

11、篩檢測或運送保存。在編碼規(guī)則為“地區(qū)拼音首字母（ JH）年份（ 2位）月（ 2位） -序列號 （3位）”，如景洪市 2013年 8月份采集的第 12份血標本的血清編號為 JH1308-012，凍存管頂端分別標記 012-1， 012-2和 012-3。3.3 運送保存。3.3.1 如果 24 小時能夠完成初篩檢測， 并將標本運送至上級單位， 運送前應(yīng) 將標本保存于 2-8冰箱，運送時采用低溫冷藏運輸。3.3.2 如果不能及時運送，運送前應(yīng)將標本保存于 -20冰箱，運送時采用干 冰或低溫冷藏運輸。3.3.3 樣本長期保存應(yīng)記錄剩余血清量和盒中位置，保存于 -70以下冰箱。3.3.4 所有樣本運輸

12、和保存應(yīng)遵守國家相關(guān)生物安全規(guī)定。4 注意事項4.1 使用后的注射器和針頭應(yīng)放置于耐扎的容器中，最后集中高壓消毒，在 任何情況下均不應(yīng)試圖將針頭重新蓋帽。4.2 采血結(jié)束后脫掉手套并棄于耐高壓的廢棄袋中，以備集中高壓滅菌，并 立即用肥皂和水洗手。4.3 若發(fā)生針刺、皮膚破損或其它損傷，應(yīng)立即用肥皂和水清洗傷口，不要 立即止血。4.4 當血液污染了身體的任何地方或發(fā)生針刺等事故時， 均應(yīng)及時報告上級 并按醫(yī)療救護規(guī)程進行評估和救護。附件 2酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒 NS1 抗原標準操作程序1 目的 酶聯(lián)免疫法檢測患者血清中登革病毒 NS1 抗原。2 適用范圍 適用于患者血清或血漿中登革熱病毒 NS

13、1 抗原的快速檢測。3 實驗前準備3.1 核對被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號及檢測項目等。3.2 檢測前應(yīng)將待測樣品置于 2-8冰箱或冰上。4 檢測項目及參數(shù) 本方法檢測項目為檢測血清或血漿中登革熱病毒抗原。5 檢測儀器設(shè)備和材料加樣器、溫箱、洗板機、含波長 450nm 的酶標儀、登革病毒抗原檢測試劑 盒（酶聯(lián)免疫法）（萬泰公司）6 檢測的環(huán)境條件生物安全 二 級實驗室（ BSL-2）中進行 ,滅活后樣本在生物安全一級實驗室 （BSL-1）內(nèi)進行。7 操作步驟7.1 將試劑盒在冰箱中取出，放置室溫平衡 30 分鐘，使用前將試劑輕輕震 蕩混勻。7.2 配液：將試劑盒中濃縮洗滌液用蒸餾水

14、20 倍稀釋。7.3 編號：將樣品對應(yīng)微孔板編號，每板設(shè)陰性對照 3 孔，陽性對照 2 孔和 空白對照 1 孔。7.4 加稀釋液：每孔加稀釋液 50L ，空白孔除外。7.5 加樣：分別在相應(yīng)孔加入待測樣品或陰陽性對照各 50L，空白孔除外。7.6 溫育：用封板膜封板后，置 37溫育 60 分鐘。7.7 每孔加酶標試劑 50L ，空白孔除外，輕輕震蕩混勻7.8 溫育：用封板膜封板后，置 37溫育 30 分鐘。7.9 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌 5 遍，最后一次盡量扣干。7.10 顯色：每孔加入顯色劑 A 、B 液各 50L ，輕輕震蕩混勻， 37避光顯 色 15 分鐘。7.11 測定：每

15、孔加終止液 50L， 10 分鐘內(nèi)測定結(jié)果。設(shè)定酶標儀波長于 450nm 處（建議使用雙波長 450nm/600-650nm檢測），用空白孔調(diào)零后測定各孔 A 值。8 結(jié)果判定8.1 臨界值計算： 臨界值=0.10+陰性對照孔 A 值均值（陰性對照孔 A 值低于 0.05者以 0.05計算）。8.2 陰性對照的正常值范圍：陰性對照孔 A0.1（若1孔A 大于 0.1應(yīng)舍棄， 若兩孔或兩孔以上陰性對照大于 0.1，應(yīng)重復實驗）。8.3 陽性對照正常值范圍： A 0.8.8.4 陽性判定：樣品 A 值臨界值者為登革病毒抗原陽性。8.5 陰性判定：樣品 A 值臨界值者為登革病毒抗原陰性。9 意義結(jié)合

16、臨床信息， 陽性結(jié)果可以診斷為登革病毒感染， 但陰性結(jié)果并不排除登 革病毒感染的可能附件 3膠體金免疫層析法檢測登革病毒 NS1 抗原標準操作程序1 目的檢測患者血液中登革病毒抗原。2 適用范圍檢測患者血清、 血漿、 全血中登革熱病毒抗原水平， 主要用于登革病毒感染 的輔助診斷。3 實驗前準備3.1 核對被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號及檢測項目等。3.2 檢測前應(yīng)將待測樣品置于 2-8冰箱或冰上。4 檢測項目及參數(shù) 本方法檢測項目為檢測血清或血漿中登革熱病毒抗原。5 檢測儀器設(shè)備和材料 加樣器、登革熱病毒抗原檢測試劑盒（膠體金法）6 檢測的環(huán)境條件生物安全 二 級實驗室（ BSL-2）

17、中進行 ,滅活后樣本在生物安全一級實驗室 （BSL-1）內(nèi)進行。7 檢測步驟7.1 將試劑盒和待檢樣本自冰箱中取出平衡至室溫。7.2 當準備好測試時， 打開密封的鋁箔袋， 取出檢測卡， 平放于水平桌面上。7.3 在檢測卡上標記病人的樣本號。7.4 加樣：用滴管從樣本中取 1 滴（約 30-45 L）血清或血漿標本，加于檢 測卡/條上的加樣區(qū)內(nèi)，另外加 1滴（約 30-45L）稀釋液，保證操作過程中沒有 氣泡產(chǎn)生。（如果加樣后 30 秒鐘，沒有看到樣本移動，可能是由于樣本太黏稠， 可在樣本加樣孔內(nèi)再加 1 滴樣本稀釋液。7.5 加入樣本后 20-25 分鐘內(nèi)判讀結(jié)果，并將結(jié)果拍照。8 結(jié)果解釋8

18、.1 陰性結(jié)果：僅質(zhì)控線 C 出現(xiàn)肉眼可見條帶。8.2 陽性結(jié)果：質(zhì)控線 C和檢測線 T 均出現(xiàn)肉眼可見條帶。8.3 無效結(jié)果：未肉眼可見的質(zhì)控線 C8.4 質(zhì)量控制：如遇下列情況，請按上述操作步驟使用實驗室備用的陽性和 陰性樣本對該批產(chǎn)品進行質(zhì)量控制：8.4.1 新檢驗員使用本產(chǎn)品。8.4.2 使用新批號產(chǎn)品。8.4.3 試劑卡儲存溫度在 2-30以外。8.4.4 測試區(qū)溫度在 2-30以外。9 意義陽性結(jié)果說明檢測到登革病毒抗原， 結(jié)合臨床可以診斷為登革病毒感染； 陰 性結(jié)果說明沒有檢測到登革病毒抗原，但不能排除登革病毒感染。附件 4RT-PCR 法分型檢測登革病毒核酸標準操作程序1 目的

19、 登革熱患者和 /或媒介伊蚊標本中病毒核酸的提取及 PCR 分型檢測。2 適用范圍 適用于患者血標本及其傳播媒介標本的檢測。3 檢測的環(huán)境條件在標本中提取登革病毒 RNA 的實驗要求在 BSL-2 實驗室操作， PCR分型檢 測在專門 PCR 室或區(qū)域操作。4 實驗步驟4.1 實驗準備4.1.1在標本中提取登革病毒 RNA 要求在 BSL-2 實驗室， PCR分型在綜合 實驗室獨立區(qū)域或?qū)ｉT PCR 室操作。4.1.2 進入實驗場所之前，要事先準備好所需試劑，樣品。預約實驗場所， 并看前一位實驗者是否已經(jīng)清場。4.2 RNA 的提取4.2.1 使用QIAampViral RNA Mini 試劑

20、盒提取血清標本中病毒 RNA4.2.1.1 吸取560包l含載體 RNA的AVL 緩沖液至 1.5ml的離心管中。4.2.1.2 向上述的液體中加入 140樣l品，脈沖渦旋式混勻 15秒，室溫孵育 10 分鐘，簡單離心使離心管頂端液體落到底部。4.2.1.3 在樣品中加入 560 l 96100的乙醇，混勻 15秒，再簡單離心。4.2.1.4 小心將 630液l體加入未浸濕的 QIAamp小柱中，蓋好蓋，離心 8000rpm/min 1min,棄去收集管，將柱子置于一新的 2ml收集管上。4.2.1.5 打開 QIAamp小柱的蓋子，重復步驟 6，直至樣品全部離心。4.2.1.6 打開蓋子，向

21、柱中加入 500l AW1 緩沖液，蓋好蓋，離心8000rpm/min 1min，棄去收集管，將柱子置于一新的 2ml收集管上。4.2.1.7 打開蓋子，加入 500lAW2 緩沖液，蓋好蓋，離心 14，000rpm/min 3min。4.2.1.將柱子置于一新的 2ml收集管上，空離 1min。h.將柱子置于一新的 1.5ml離心管上，加入 50l AVE 洗脫緩沖液，室溫孵育 1min,離心 8000rpm/min 1min。4.2.2 RNeasy Mini Kit 提取媒介組織標本或血液標本病毒 RNA4.2.2.1 從 Kit 中取出 RLT 液，根據(jù)標本數(shù)量分裝適量 RLT 液按照

22、 1：100 體積比分別加入 -巰基乙醇，分裝至相應(yīng)的預先標記好的微量離心管中，每管 600L 。4.2.2.2 將 150 l 組織研磨混懸液分別加入相應(yīng)的 RLT 液管中，充分混勻。4.2.2.3 混勻后依次加入 750l 70的乙醇，充分混勻。4.2.2.4 從 Kit 中取出帶收集管的濾柱，打開包裝將其做好標記。取步驟 2 中的混合液 750l 加入濾柱中， 12000rpm，離心 15s，棄收集管中的離心液。4.2.2.5 濾柱仍放回收集管上，將步驟 2 剩余的混合液全部轉(zhuǎn)入濾柱中， 12000rpm，離心 15s，棄離心液；4.2.2.6 于濾柱中加入 700l Wash Buff

23、er RW1 液， 12000rpm，離心 15s。4.2.2.7 從 QIAGEN RNeasy Mini Kit 中取一支干凈的 2mL 收集管，將離心 后的濾柱移到新的收集管上，加入 500l Wash Buffer RPE液， 12000rpm，離心 15s。4.2.2.8 棄收集管中的離心液，再于濾柱中加入 500l Wash Buffer RPE 液，1300014000rpm，離心 2min。4.2.2.9 將濾柱移到一個無 RNA 酶的干凈的 1.5mL eppendorf 管上，向濾柱 中加入 3050l 的 RNase-free Water室, 溫靜置 13min。4.2.

24、2.10 12000rpm，離心 1min，離心液即為病毒 RNA ，立即檢測或 -70以 下保存。4.3 常規(guī)半套式 RT-PCR 方法檢測登革病毒核酸4.3.1 引物：引物序列見下表引物 序列 片段大小D15-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAAC511CG-3D25-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGT511TC-3482 (D1+TS1)119 (D1+TS2)290 (D1+TS3)392 (D1+TS4)TS1 5-CGTCTCAGTGATCCGGGGG- 3TS2 5-CGCCACAAGGGCCATGAACAG- 3TS3 5-TAACATCATC

25、ATGAGACAGAGC- 3TS4 5-CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA- 34.3.2 PCR擴增根據(jù)實驗室內(nèi)所使用病毒核酸 PCR擴增試劑盒特點，正向引物 D1 和反向 引物 D2 配置第一輪 PCR體系，進行第一輪 PCR擴增。推薦反應(yīng)條件為94預變性 2min，然后 94變性 30秒，55退火 30秒， 72延伸 1分鐘， 反應(yīng) 40循環(huán)，最后 72延伸 10分鐘。第二輪分型 PCR擴增體系配置采用正向引物 D1 與反向引物 TS1、TS2、TS3 和 TS4。推薦反應(yīng)條件為94預變性 2min，然后 94變性 30秒， 55退火 30秒， 72延伸 1分鐘，反應(yīng) 30循

26、環(huán)，最后 72延伸 10分鐘4.3.3 1.5%濃度瓊脂糖電泳分析，確定病毒型別。4.3.4 結(jié)果判讀4.3.4.1 陽性：500 bp的 DNA 片段100bp的DNA 片段。300bp的DNA 片段。400bp的DNA 片段。1型：電泳顯示略小于2型：電泳顯示略大于3型：電泳顯示略小于4型：電泳顯示略小于4.3.4.2 陰性：無特異性核酸片段擴增。4.3.5 意義 陽性結(jié)果可以確診登革病毒感染，可用于登革熱早期診斷。4.4實時定量 RT-PCR 法分型檢測登革病毒核酸 4.4.1引物與探針引物/探針序列熒光標記DEN-1 8973FCAAAAGGAAGTCGTGCAATACTGAGTGAA

27、TTCTCTCTACTGDEN-1 9084CAACCDEN-1 8998probeCATGTGGTTGGGAGCACGCFAM/BHQ-1DEN-2 1443FCAGGTTATGGCACTGTCACGATDEN-2 1518CCCATCTGCAGCAACACCATCTCDEN-2 1469probeCTCTCCGAGAACAGGCCTCGACTTCAAHEX/BHQ-1DEN-3 740FGGACTGGACACACGCACTCADEN-3 813CCATGTCTCTACCTTCTCGACTTGTCTDEN-3 762probeACCTGGATGTCGGCTGAAGGAGCTTGTesasRe

28、d/BHQ-2DEN-4 904FTTGTCCTAATGATGCTGGTCGDEN-4 992CTCCACCTGAGACTCCTTCCADEN-4 960probeTTCCTACTCCTACGCATCGCATTCCGCy5/BHQ-34.4.2 實時熒光定量 RT-PCR 擴增實時熒光定量 RT-PCR 擴增反應(yīng)配置體系，參考如下：RNA 模板 5l，酶 0.5 l，緩沖液 12.5 l，引物各 0.5 l（共 4對,8條），探針各 0.25 l，加水至總體積 25l。推薦反應(yīng)條件為 5030min，952min，9515s、6030s反應(yīng) 40個循環(huán)4.4.3 結(jié)果判斷以熒光 PCR 反應(yīng)的

29、前 315個循環(huán)的熒光信號作為本底信號，以本底信號 標準差的 10 倍作為熒光閾值，標本擴增產(chǎn)生的熒光信號達到熒光閾值時所對應(yīng) 的循環(huán)數(shù)為循環(huán)閾值（ Ct 值），以 Ct35熒光信號數(shù)據(jù)線性化處理后對應(yīng)循環(huán) 數(shù)生成的曲線圖成“ S”形的標本，可判斷為相應(yīng)的登革病毒核酸檢測陽性。4.4.4 意義是一種靈敏、特異、低污染的登革病毒 RNA 檢測方法，可以定性或定量檢 測登革熱患者血清或蚊媒標本中的登革病毒。附件 5細胞培養(yǎng)分離登革病毒1 目的分離登革病毒。2 適用范圍2.1 無菌采集發(fā)病后 5 日內(nèi)的登革患者血標本。2.2 經(jīng)研磨處理的媒介蚊標本（參見附件 11）。4 實驗前準備4.1 核對被檢樣

30、品：患者標本應(yīng)核對患者的姓名、性別、年齡、編號及檢測 項目等。蚊媒標本應(yīng)核對標本種類、編號、性狀等。4.2生長狀態(tài)良好的單層登革病毒敏感細胞 C6/36，BHK21，VERO 等4.3 待測樣品在檢測前應(yīng)放置于 2-8冰箱或置于冰上。5、操作步驟5.1取 10L 患者血清或蚊懸液 20L 用 Hanks液稀按 1： 10稀釋至 0.1mL 或 0.2mL 備用。5.2將在 24孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)好的單層細胞上清棄掉， 用 Hanks液洗滌 2 遍。5.3將稀釋好的標本接種細胞， 接種C6/36細胞在 28吸附 1小時， BHK21 細胞在 37吸附 1小時，補加維持液至 1mL ，C6/36細

31、胞在 28培養(yǎng)， BHK21 細胞在 37培養(yǎng)。5.4第二天開始觀察細胞病變情況。如果沒有細胞病變，則盲傳 3 代（每次 取細胞懸液 0.1ml）接種細胞傳代。5.4 免疫熒光法鑒定登革病毒5.4.1細胞抗原片的制備：出現(xiàn)“ +”細胞病變的細胞倒去維持液（若盲傳無細胞病變出現(xiàn)，仍然按 此方法制備），用 pH7.2 PBS洗滌2次，加 PBS用滴管把細胞從管壁上吹下， 吹散， 1000轉(zhuǎn)/分鐘離心 5 分鐘，棄去 PBS，細胞沉淀用 0.2mlPBS 吹散，滴加 在抗原片上，吹干，冷丙酮固定 10 分鐘， PBS沖洗 2次，蒸餾水漂洗 1 次，吹干備用；5.4.2按順序滴加熒光標記單克隆抗體 2

32、 孔，對照 2 孔（加 PBS），置濕盒 內(nèi) 37水浴 30 分鐘；5.4.3取出，用 PBS沖洗 3 次，蒸餾水漂洗 1次，吹干； 5.4.4熒光顯微鏡觀察結(jié)果。5.5 其他檢測病毒抗原或核酸鑒定登革病毒參見附件 2、4、5。5.6 結(jié)果判斷：免疫檢測有特異性黃綠色顆粒狀熒光，檢測出病毒 NS1 抗原或病毒核酸可 確定病毒分離成功。5.7 意義：從病人血清或蚊媒中分離出登革病毒，可確診登革感染。6 廢棄物處理 所有實驗用品都應(yīng)嚴格按照有關(guān)傳染病處理方法高壓處理。附件 6IgM 捕捉 ELISA 法（ MacELISA ）檢測登革熱 IgM 抗體1 目的 檢測出登革病毒特異性 IgM 抗體。2

33、 適用范圍 適用于人血清或血漿中登革病毒特異性 IgM 抗體的快速檢測。3 樣品接收和準備3.1 核對被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號及檢測項目等。3.2 待測樣品在檢測前應(yīng)放置于 2-8冰箱或置于冰上。4 檢測項目及參數(shù) 本方法檢測項目為檢測血清或血漿中病毒特異性 IgM 抗體5 檢測儀器設(shè)備和材料加樣器、溫箱、洗板機、含波長 450nm 的酶標儀、登革病毒 IgM 抗體檢測 試劑盒，或?qū)嶒炇易詡洳牧希?.1 抗原： 陽性抗原：采用 C6/36 細胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽性抗原。 陰性抗原：未接種病毒的正常 C6/36 細胞為陰性抗原對照。5.2 抗人 IgM （鏈）單克隆抗體或多克隆

34、抗體；5.3 登革病毒 IgM 陽性、陰性對照血清；5.4 辣根過氧化物酶標記登革病毒單克隆抗體；5.5 緩沖液：洗滌液： pH7.4 PBST（0.05吐溫 20）；稀釋液： pH7.4 PBS（5牛血清）；封閉液： pH9.6 碳酸緩沖液（ 1牛血清白蛋白）；5.6顯色液： A/B 液5.7終止液： 4N H2SO46 檢測的環(huán)境條件生物安全 二 級實驗室（ BSL-2）中進行 ,滅活后樣本在生物安全一級實驗室 （BSL-1）內(nèi)進行。7 檢測原理本方法采用抗人 鏈捕獲人血清 IgM 抗體，加辣根過氧化物酶標記的病毒 抗原物，用以檢測出血熱特異性 IgM 抗體。具有較高的敏感性、特異性和重復

35、 性。適用于出血熱的早期特異性診斷及其它實驗性研究。8 檢測步驟8.1 用稀釋液按效價稀釋抗人 鏈單克隆抗體， 100l/孔，加蓋， 4過夜；8.2 棄去抗人 鏈，用洗滌液重復洗 3 次，甩干，加封閉液， 100l/孔，置 37水浴孵育 2 小時；8.3 棄封閉液，用洗滌液重復洗 3 次，甩干。8.4 將待檢血清用稀釋液從 1：10 開始作 2 或 4 倍連續(xù)稀釋，加入酶標板孔 中， 100l/孔，同時加入已 1：10 稀釋的陽性血清、陰性血清對照各 4 孔，100 l/孔，置 37水浴孵育 2 小時；8.5 棄去血清，用洗滌液重復洗 3次，甩干，分別加 4個型 DV 抗原及陰性 抗原對照，

36、100l/孔， 4過夜；8.6 棄抗原，用洗滌液重復洗 3 次，甩干，加用稀釋液稀釋至工作濃度的相 應(yīng)的登革熱酶標單克隆抗體，正常抗原加 4 個型混合的酶標單克隆抗體， 100 l/孔， 37水浴 2 小時；8.7 棄去標記物，用洗滌液重復洗 3 次，甩干，于各反應(yīng)孔內(nèi)加 A/B 液各一 滴， 37，避光 35 分鐘；8.8 加終止液于每反應(yīng)孔，一滴 /孔。9 結(jié)果判斷（1）目測方法：陽性對照孔呈明顯藍色， 陰性對照孔呈無色， 對照成立； 若待檢血清孔呈明 顯淡藍色或深藍色（ TMB ），則標本為登革熱 IgM 抗體陽性，反之陰性。（2）酶聯(lián)免疫檢測儀檢測：于 450nm（ TMB ）陽性對照

37、孔 OD值/陰性對照孔 OD 值，即 P/N2.1，對 照成立；若待檢血清孔 OD 值與陰性對照孔 OD 比值 2.1，則標本為登革熱 IgM 抗體陽性，反之陰性。 （陰性對照孔 OD值小于 0.05按 0.05記，若大于 0.05按 實際數(shù)值計算）10 意義 陽性結(jié)果，提示患者新近登革病毒感染，用于登革熱早期臨床診斷。附件 7 酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒 IgG 抗體標準操作程序1 目的 檢測出登革病毒特異性 IgG 抗體。2 適用范圍 適用于人血清或血漿中登革病毒特異性 IgG 抗體的快速檢測。3 實驗前準備 （1）核對被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號及檢測項目等。 （2）待測樣品在檢測

38、前應(yīng)放置于 2-8冰箱或置于冰上。4 檢測項目及參數(shù) 本方法檢測項目為檢測血清或血漿中病毒特異性 IgG 抗體5 檢測儀器設(shè)備和材料加樣器、溫箱、洗板機、含波長 450nm 的酶標儀、登革病毒 IgG 抗體檢測 試劑盒，或?qū)嶒炇易詡洳牧希?.1 抗原： 陽性抗原：采用 C6/36 細胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽性抗原。 陰性抗原：未接種病毒的正常 C6/36 細胞為陰性抗原對照。5.2 辣根過氧化物酶標記的抗人 IgG 抗體；5.3 緩沖液：包被液： pH9.6 碳酸緩沖液；稀釋液： pH7.4 PBS（含 5%脫脂奶）洗滌液： pH7.4 PBST（0.05吐溫 20）；5.4 顯色液： A/B

39、 液5.5 終止液： 4NH2SO45.6 酶標板、酶標儀。6 檢測的環(huán)境條件生物安全 二 級實驗室（ BSL-2）中進行 ,滅活后樣本在生物安全一級實驗室BSL-1）內(nèi)進行7 檢測步驟7.1 用包被液按工作濃度稀釋抗原， 100l/孔， 4過夜；7.2 棄去包被液，用 PBS-T 重復洗滌 35 次，甩干；7.3 將待檢血清用稀釋液從 1：100開始作 2或 4倍連續(xù)稀釋，加入抗原孔， 100l/孔，同時設(shè)陰、陽性對照， 37水浴 1 小時；7.4 棄去血清，用洗滌液洗滌 56 次；7.5 加酶結(jié)合物，用稀釋液按工作濃度稀釋， 100l/孔， 37水浴 1 小時；7.6 棄去酶標抗體，用洗滌

40、液洗滌 6 次，甩干；7.7 加顯色液：于各反應(yīng)孔內(nèi)加 A/B 液各一滴， 37，避光 35 分鐘；7.8 加終止液于每反應(yīng)孔， 100l /孔。8 結(jié)果判斷于 450nm（ TMB ）陽性對照孔 OD值/陰性對照孔 OD 值，即 P/N2.1，對 照成立；若待檢血清孔 OD 值與陰性對照孔 OD 比值 2.1，則標本為登革熱 IgG 抗體陽性，反之陰性。 （陰性對照孔 OD值小于 0.05按 0.05記，若大于 0.05按 實際數(shù)值計算）9 意義陽性結(jié)果，表明曾受到 DV 感染；恢復期血清抗體陽轉(zhuǎn)，或抗體滴度比急性 期抗體滴度有 4 倍及以上升高則可確診。附件 8免疫熒光法檢測登革病毒 Ig

41、G 抗體標準操作程序1 目的 免疫熒光法（ IFA）檢測抗登革病毒 IgG 抗體。2 適用范圍 適用于人血清或血漿中登革熱病毒特異性 IgG 抗體的快速檢測。3 實驗前準備（1） 核對被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號及檢測項目等。 （2）待測樣品在檢測前應(yīng)放置于 2-8冰箱或置于冰上。5 檢測項目及參數(shù) 本方法檢測項目為檢測血清或血漿中抗登革熱病毒 IgG 抗體6 檢測儀器設(shè)備和材料6.1 DV14型抗原片： DV 標準毒株感染 VERO或BHK21細胞制備，低溫 干燥保存；6.2 對照：登革熱患者恢復期血清（陽性對照） ，非登革熱患者血清陰性對 照）；6.3 羊抗人（或兔抗人） IgG 熒光素標記抗體；6.4 常用稀釋液： pH7.