海豚鏈球菌研究進(jìn)展

1、第二章海豚鏈球菌研究進(jìn)展1976年P(guān)ier等從亞馬遜淡水海豚(Inia geoffrensis )皮下 高爾夫球”樣的化膿灶內(nèi)首次分離得到海豚鏈球菌(Streptococcus iniae , S.iniae)52。在隨后的二十年里在美國(guó)、以色列等地時(shí)有零星暴發(fā)，直至上世紀(jì)九十年代，海豚鏈球菌 在全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的危害逐漸凸顯，并被認(rèn)為是有鰭魚(yú)類(lèi)重要的病原菌。僅1997年由該菌引起的美國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的損失估計(jì)在1000萬(wàn)美元，全球的損失估計(jì)在1億美元53。到2001年時(shí)，全球范圍內(nèi)海豚鏈球菌感染造成的經(jīng)濟(jì)損失已 超過(guò)10億美元53。人類(lèi)感染海豚鏈球菌的臨床病例時(shí)有報(bào)道，全球至少有25 人感染海豚鏈

2、球菌并表現(xiàn)臨床病癥54-56。海豚鏈球菌作為一種潛在的人畜共患 病原開(kāi)始被人們熟悉。本章就海豚鏈球菌的分類(lèi)地位、生物學(xué)特性、宿主范 圍、臨床癥狀、致病機(jī)理、毒力因子、診斷方法以及防控措施進(jìn)行簡(jiǎn)介。1. 海豚鏈球菌的分類(lèi)及生物學(xué)特性海豚鏈球菌(Streptococcus iniae，曾用名 Streptococcus shiloi)，隸屬 于芽抱 桿菌綱(Bacilli)，乳 桿菌目(Lactobacillales )，鏈 球菌科 (Streptococcaceae )，鏈球菌屬(Streptococcus )。1976 年，最早由 Pier 和 Madin從美國(guó)舊金山市某水族館一頭亞馬遜淡水海

3、豚皮下膿腫中分離并定種 52，伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)第九版(1994年)中將其歸入化膿性鏈球菌， ATCC29178為模式菌株。海豚鏈球菌為圓形或近圓形、呈鏈狀或呈雙排列的革蘭氏陽(yáng)性球菌，直徑大小為0.20.8卩有時(shí)老齡菌呈革蘭氏陰性；呈鏈狀排列，鏈之長(zhǎng)短與菌株 和培養(yǎng)基有關(guān)，一般在液體培養(yǎng)集中鏈長(zhǎng)，固體培養(yǎng)基中鏈則短；無(wú)鞭毛、不形成芽胞。在綿羊血瓊脂平板上呈B溶血活性。大多數(shù)菌株最適生長(zhǎng)溫度37C57,在6.5%NaCI或45C時(shí)不生長(zhǎng)；在5C鹽水(0.85%)中，該菌可以存 活9d , 25 C時(shí)可以存活2d , 35 C時(shí)可以存活不超過(guò)24h58。2. 海豚鏈球菌的感染與病變癥狀1958年

4、日本首次證實(shí)鏈球菌侵襲危害養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)虹鱒(On corhychus mykiss) 59。此后的二十多年，更多的鏈球菌感染養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)或野生魚(yú)類(lèi)的臨床 病例被報(bào)道，病害集中在美國(guó)和日本60-64。此時(shí)，海豚鏈球菌也開(kāi)始為人們所 認(rèn)知52。從歷史上來(lái)看，鏈球菌屬并非魚(yú)類(lèi)的主要致病菌，直至上世紀(jì)90年代以后，包括海豚鏈球菌在內(nèi)的鏈球菌屬細(xì)菌對(duì)野生和養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的危害凸顯 65-67。1994年以后，海豚鏈球菌成為全球重要的魚(yú)類(lèi)病原菌之一。近年來(lái)，陸 續(xù)有關(guān)于海豚鏈球菌引起哺乳動(dòng)物甚至人類(lèi)的疾病報(bào)道68。2.1魚(yú)感染海豚鏈球菌1976年，一種新的鏈球菌種被認(rèn)為是引起舊金山捕獲的的亞馬遜淡水海豚(Inia ge

5、offrensis )皮下 高爾夫球”羊化膿灶的病原體，并命名為海豚鏈球菌52;1978年P(guān)ier等再次從紐約尼亞加拉大瀑布水族館養(yǎng)殖的一頭皮膚受損的淡水海 豚上分離到海豚鏈球菌69;第三次從海豚上分離是1987年在俄亥俄州，但是相 關(guān)的研究結(jié)果直至2003才報(bào)道70。在上世紀(jì)80年代，日本和新加坡的多篇報(bào)道最先對(duì)海豚鏈球菌的感染進(jìn)行了流行病學(xué)的描述60, 71-75。1986年，臺(tái)灣和以色列由Streptococcus shiloi感染 引發(fā)的虹鱒(Onchorynchus mykiss)和羅非魚(yú)(Oreochromis speices)的急 性腦膜炎，死亡率高達(dá)50%76，后來(lái)對(duì)S. sh

6、iloi的基因和表型鑒定認(rèn)為該菌為海 豚鏈球菌76, 77。從1992年起，每年夏天海豚鏈球菌都會(huì)引起澳大利亞海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的澳洲肺魚(yú)(barramundi )發(fā)病78, 79。在美國(guó)，海豚連球菌感染養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi) 首次報(bào)道是1994年在德克薩斯州57和1996年在馬薩諸塞州75。海豚鏈球菌也 感染亞洲、中東和哥倫比亞地區(qū)6，73, 80-83。為降低病害經(jīng)濟(jì)損失，以色列全球 率先實(shí)行了羅非魚(yú)的疫苗應(yīng)用計(jì)劃84。1995年到1997年，以色列將疫苗成功的 應(yīng)用到虹鱒的養(yǎng)殖，使得由海豚鏈球菌等引起的病害死亡率從50%降低到5%85。然而，在短期的療效后，大批海豚鏈球菌感染病害重新暴發(fā)，新分離株 與之前海

7、豚鏈球菌毒株生化特性存在差異，病理?yè)p傷上也表現(xiàn)出新變化85, 86。 據(jù)估計(jì)，在全球范圍內(nèi)每年由海豚鏈球菌感染造成的經(jīng)濟(jì)損失就超過(guò)10億美元53。由海豚鏈球菌引起的重大損失遍及美國(guó)，日本，以色列，南非，澳大利亞，菲律賓，臺(tái)灣，巴林等國(guó)。鏈球菌能感染包括淡水和海水在內(nèi)的多種野生或人工養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)30, 87-89，也可感染如斑馬魚(yú)，珍珠斑馬，小丑泥鰍，非洲麗魚(yú)等觀賞魚(yú)類(lèi)90, 91。羅非魚(yú) 感染海豚鏈球菌的概率要大大高于其他養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)92。美國(guó)羅非魚(yú)協(xié)會(huì)認(rèn)為海豚鏈球菌是影響羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的重要病害92-94。海豚鏈球菌感染主要表現(xiàn)癥狀為 魚(yú)類(lèi)的腦膜腦炎。被此菌感染后，病魚(yú)的臨床表現(xiàn)表現(xiàn)為單側(cè)或雙側(cè)眼球突

8、 出，體色發(fā)黑，缺乏活力，游動(dòng)緩慢；眼球充血，角膜混濁，肛門(mén)紅腫；鰓蓋 下緣、胸鰭基部、體表的其他部位有出血現(xiàn)象；臨死前出現(xiàn)間斷性狂游、翻滾 或轉(zhuǎn)圈。剖解病魚(yú)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其腦部充血，有出血點(diǎn)；肝臟淤血，出血，有的 有壞死灶；脾臟腫大，呈暗紅色；膽囊腫大；腸腔積水78, 95。并非所有的魚(yú) 類(lèi)感染海豚鏈球菌都會(huì)表現(xiàn)出癥狀。Bromage等(1999)從眼觀健康的肺魚(yú)(barramundi)大腦內(nèi)分離到了細(xì)菌，結(jié)果現(xiàn)實(shí)，具體可以在無(wú)病原癥狀的情 況下攜帶細(xì)菌。其他的研究也證實(shí)有攜帶細(xì)菌的感染魚(yú)群存在78, 94, 96。海豚鏈球菌也常?？梢苑蛛x自疾病暴發(fā)后的幸存魚(yú)體內(nèi)，這些幸存者很可能成為未來(lái)疾病暴

9、發(fā)的攜帶者。2.2人感染海豚鏈球菌1995年1996年在加拿大的多倫多地區(qū)報(bào)道四例人感染海豚鏈球菌感染人 的臨床病例，然而對(duì)于病原的傳播途徑人們不得而知97。在隨后的研究中，研究人員針對(duì)一群處理過(guò)魚(yú)的老年人感染的鏈球菌病進(jìn)行了描述后98，人們才開(kāi)始意識(shí)到人在有外傷的情況下接觸帶菌魚(yú)主要是羅非魚(yú)等易感魚(yú)類(lèi)后很容易 感染上鏈球菌。感染主要癥狀表現(xiàn)為手的蜂窩織炎，并伴有發(fā)熱反應(yīng)。若患有 心臟病、腎病、糖尿病和關(guān)節(jié)炎的病人感染鏈球菌，會(huì)繼發(fā)更嚴(yán)重的感染。后 續(xù)研究證實(shí)在加拿大、美國(guó)、香港和新加坡至少有25例感染被證實(shí)是海豚鏈球 菌感染所致54, 56, 98, 99。進(jìn)一步的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)感染海豚

10、鏈球菌通常是由于傷口接觸到帶菌 的魚(yú)體所致100，且感染海豚鏈球菌的人群平均年齡在69歲，感染者主要是通過(guò)手上的傷口或劃傷而感染，也有的感染者是由于過(guò)度疲勞操作而使得抵抗力 低下而易感；健康人感染的風(fēng)險(xiǎn)非常低101。調(diào)查顯示羅非魚(yú)是海豚鏈球菌最常 見(jiàn)的細(xì)菌傳播者102。因此，對(duì)于有外傷或免疫力低下人群，在接觸羅非魚(yú)等鏈 球菌易感水產(chǎn)品過(guò)程中需要提高警惕，避免海豚鏈球菌感染。最簡(jiǎn)單有效的措施是戴手套并及時(shí)用抗菌性藥皂清洗手。Lauskp等(2003)認(rèn)為亞洲人吃生魚(yú)片的飲食習(xí)慣加大了海豚鏈球菌的感染風(fēng)險(xiǎn)56。然而也有學(xué)者指出海豚鏈球菌對(duì) 公共健康并不存在重大的威脅，其感染人群受條件限制有限且易于

11、預(yù)防。但人類(lèi)感染海豚鏈球菌的報(bào)道，使得近年來(lái)對(duì)于海豚鏈球菌的關(guān)注和研究開(kāi)始逐漸 深入97, 103。人類(lèi)感染海豚鏈球菌主要表現(xiàn)為菌血癥、蜂窩織炎、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎56, 102, 104。3. 海豚鏈球菌致病機(jī)理以及毒力因子與水產(chǎn)上的大多數(shù)條件致病菌如嗜水氣單胞菌等不同，海豚鏈球菌是非條件致病菌，其侵襲能力更強(qiáng)。但并非所有海豚鏈球菌都是致病株，也存在不致 病的共生菌株。目前，有關(guān)海豚鏈球菌致病機(jī)制的研究主要包括動(dòng)物感染模型 的建立105, 106，感染后海豚鏈球菌在各組織的分布情況95, 107，以及個(gè)別毒力因 子的研究108, 109。Zlotkin等（2003）認(rèn)為海豚鏈球菌的感染首先是同一

12、水系中 相關(guān)疾病的暴發(fā)，使得水環(huán)境中或宿主胃腸道中寄生的海豚鏈球菌侵襲魚(yú)體，進(jìn)入魚(yú)類(lèi)的血液循環(huán)系統(tǒng)；宿主自身免疫系統(tǒng)不能有效的吞噬殺滅細(xì)菌，細(xì)菌在宿主體內(nèi)大量繁殖從而導(dǎo)致疾病的一個(gè)復(fù)雜多步驟的過(guò)程87, 110。而致病株與非致病株P(guān)FGE圖譜的不同，預(yù)示著由一個(gè)或幾個(gè)特異性基因編碼的毒力因子是 海豚鏈球菌致病性有無(wú)的決定因素。致病性海豚鏈球菌能夠黏附并侵襲宿主細(xì) 胞，對(duì)宿主吞噬細(xì)胞具有親和性，在吞噬細(xì)胞中不僅能對(duì)抗吞噬細(xì)胞的氧化殺 滅作用111, 112，而且能在吞噬細(xì)胞中存活繁殖，并利用吞噬細(xì)胞的保護(hù)逃避宿 主免疫系統(tǒng)，進(jìn)入深層組織、血液以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)113, 114。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的 感染

13、程度與在血液中的細(xì)菌濃度有關(guān)，以及細(xì)菌溶血時(shí)間有關(guān)。致病性海豚鏈 球菌能夠分泌細(xì)胞毒素直接破壞上皮細(xì)胞進(jìn)入血管，并向其他組織擴(kuò)散。Fibrinogen圖2-1海豚鏈球菌(Streptococcus iniae )毒力因子模式圖115Fig 2-1 Virule nee factor ideograph of Streptococcus iniae已有研究的海豚鏈球菌的毒力見(jiàn)圖(2-1 ) 115。圖中海豚鏈球菌胞內(nèi)毒力因子表達(dá)基因和胞外毒力因子按順時(shí)針?lè)较蛞来问牵砂麅?nèi)mgx基因調(diào)控表達(dá)的SiM蛋白(simA)，它包括免疫球蛋白(Ig)和纖維蛋白原(Fibrinogen )； C5a肽酶和白細(xì)

14、胞介素-8 (IL-8)蛋白酶它們能降解各自對(duì)應(yīng) 的化學(xué)激化物，從而損壞吞噬細(xì)胞；由sivS/R系統(tǒng)調(diào)節(jié)產(chǎn)生的溶血素S( sag;SLS)，能夠溶解淋巴細(xì)胞(lymphocytes, L)，紅細(xì)胞(erythrocytes, E)和白細(xì)胞(neutrophils, N)；同樣受sivS/R系統(tǒng)調(diào)節(jié)的CAMP因子(cfi)與免疫 球蛋白的Fc區(qū)域結(jié)合，以及莢膜多糖(cps; CPS)合成，EPS形成高度粘稠狀的 莢膜；此外，a-烯醇酶能降解纖維層促進(jìn)細(xì)菌傳播。以下對(duì)研究較多的幾個(gè)重 要毒力因子作一介紹。3.2 細(xì)胞溶素 S (cytolysin streptolysin S, sag)溶血素(h

15、emolysins ),或稱(chēng)細(xì)胞溶素(cytolysins )，是包括鏈球菌在內(nèi)的 多數(shù)致病菌的毒力因子。鏈球菌的細(xì)胞溶素包括溶血素0 (streptolysin 0,SLO), GAS 的溶血素 S(streptolysin S，SLS)，B 群鏈球菌(Group B streptococcus , GBS)的伕溶血素/細(xì)胞溶素，以及肺炎鏈球菌的肺炎鏈球菌溶 血素(pneumolysin ),這些溶血素都與致病毒力有關(guān)119-122 研究顯示海豚 鏈球菌具有溶解紅細(xì)胞和損傷宿主細(xì)胞膜的溶細(xì)胞素123。海豚鏈球菌在血瓊脂平板上形成溶血環(huán)，顯示出很強(qiáng)的溶血活性。 Kawahara等(1989)對(duì)

16、海豚鏈球菌溶血素的產(chǎn)生進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示在pH7.0的Todd-Hewitt 肉湯中 25 C孵育15h時(shí)，溶血活性最高。Fuller等(2002)研究表明海豚鏈球菌溶細(xì)胞素是一種鏈球菌溶血素 S (SLS)的功能性 同系物。用從GAS提取sag (表達(dá)SLS的操縱子)探針與HindHI酶切得海豚鏈 球菌基因組DNA進(jìn)行Southern雜交，結(jié)果顯示海豚鏈球菌中存在于 GAS sag 操縱子中九個(gè)基因同源的序列。研究顯示海豚鏈球菌分泌的細(xì)胞溶素由 sag操縱子上的9個(gè)基因功能編碼形成，與GAS的SLS同源性高達(dá)73%。其中sagA 基因編碼的多肽與GAS sagA編碼蛋白相似度達(dá)73% ;

17、sagB編碼的蛋白相似性為77% ； sagC-F基因與GAS對(duì)應(yīng)基因相似，此外sagG-I基因均編碼三磷酸腺苷結(jié)合盒(ATP binding cassette-type, ABC )轉(zhuǎn)運(yùn)體。sagDbag尸zgHgiloscinpr propeptideUnknown(membrane)7 Immiinily protein? Modifying nzymUnknown Un knownAl P band mg 匚 a石 &召 tL 曰 ti m kspoi圖2-2 A群鏈球菌的溶血素S生物合成sag操縱子的9個(gè)基因124Fig. 2-2 sag operon of streptolysin

18、 S in GASFuller等（2002）用小鼠皮下感染模型檢測(cè)了海豚鏈球菌溶細(xì)胞素的致病 機(jī)理。對(duì)一株SLS缺失突變株進(jìn)行小鼠實(shí)驗(yàn)證明，突變株與野生株接種相同劑 量，致病力無(wú)明顯差異；而進(jìn)行壞死性潰瘍形成情況的觀察發(fā)現(xiàn)野生株能夠引 起小鼠60%壞死性潰瘍，而突變株不能引起相應(yīng)部位的細(xì)胞損害。研究結(jié)果表 明海豚鏈球菌SLS與局部組織損害有關(guān)，但與敗血癥的建立和菌株對(duì)吞噬細(xì)胞 的抗清楚無(wú)關(guān)123。Nizet等（2000）研究顯示海豚鏈球菌SLS能損傷紅細(xì)胞， 中性白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等125。Locke等（2006）研究證實(shí)海豚鏈球菌SLS毒性 與吞噬細(xì)胞的清除和上皮細(xì)胞的粘附侵襲無(wú)關(guān)126。圖4

19、-1不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，a菌襪在THA平板上形成的白色圓形菌落局鹹大圖片b.菌株在兔血平板上形尿的透明溶血環(huán)曲士觀亂SB則也曲宓加鼬皿J3曲収斗 widte round tolonies ouIHApUte （drawing of partial enlaicraent）; b. transpareiit zone of hemolysis on rabbit blood agar plates.和Referenee :52 P ier G B, M adin S H. Streptoeoeeus iniae sp. nov., a betahemolytie Streptoeoeeus

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