毛細(xì)管電泳儀應(yīng)用於中藥成分之分析定量

毛細(xì)管電泳儀應(yīng)用於中藥成分之分析定量一前言中藥為我國重要的文化資產(chǎn)之一，原本就值得推廣與重視，近年來國內(nèi)許多大企業(yè)投入大筆經(jīng)費，致力於中藥新藥之研發(fā)。由於中藥材之成分複雜，且常因基原、產(chǎn)地、採收季節(jié)、炮製、儲存等種種因素，致使其成分有相當(dāng)大的差異，進而影響中藥材的品質(zhì)。因此，有關(guān)中藥成分之分析及品質(zhì)之管制，變得相當(dāng)?shù)闹匾Ｐ姓盒l(wèi)生署為了提昇中藥濃縮製劑的品質(zhì)，已於八十九年七月二十四日公告，自九十年一月一日起，凡申請葛根湯等十種中藥方劑之濃縮製劑，查驗登記新案及藥品許可證有效期間展延時，應(yīng)制訂指標(biāo)成分定量方法。美國藥物食品管理局FDA亦於八十九年八月公佈，GUIDANCEFORINDUSTRYDRAFTBOTANICALDRUGPRODUCTS美國FDA植物性藥物產(chǎn)品規(guī)範(fàn)草案，提出中草藥新藥研發(fā)，需以CMC即化學(xué)、製造、品質(zhì)加以管制。目前中藥成分之分析定量，以高效液相層析HPLC最普遍，然而HPLC分析時存在著若干變數(shù)及困難，例如通常分析時間長，且分析完成後管柱之清洗時間亦甚長；更換溶媒、管柱，清洗管柱需要時間，致使儀器自動化限制多；成分易殘留於管柱內(nèi)，清洗不易，使用之緩衝溶液等添加劑，則易損害管柱內(nèi)之填充物；管柱及溶劑費用高，尤其會產(chǎn)生大量含有有毒溶劑如乙月青、二氯甲烷之廢液。毛細(xì)管電泳CAPILLARYELECTROPHORESIS或HIGHPERFORMANCECAPILLARYELECTROPHORESIS，簡稱CE或HPCE，是最近十年來蓬勃發(fā)展的分析方法，電泳是電介質(zhì)中帶電粒子在電場作用下，以不同速度向電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象，利用這種現(xiàn)象對某些化學(xué)成分進行分析的技術(shù)。毛細(xì)管電泳的發(fā)展，在1967年HJERTEN等率先提出在高電場，直徑3MM毛細(xì)管中作自由溶液的毛細(xì)管區(qū)帶電泳CAPILLARYZONEELECTROPHORESIS，簡稱為CZE；1984年TERABE等建立一種重要的分離模式，即以各組成分特別是中性成分，在毛細(xì)管內(nèi)的膠束MICELLE及緩衝溶液之間的分配為基礎(chǔ)之膠束電動力學(xué)毛細(xì)管層析MICELLARELECTROKINETICCAPILLARYCHROMATOGRAPHY，簡稱為MECC或MEKC；1990年HONDA等最早將毛細(xì)管電泳應(yīng)用於芍藥中PAEONIFLORIN及OXYPAEONIFLORIN之定量，發(fā)現(xiàn)毛細(xì)管電泳之再現(xiàn)性佳，定量結(jié)果與HPLC相似。毛細(xì)管電泳的種種方法中以上述CZE及MEKC最常用，其中CZE是毛細(xì)管電泳中最簡單的一種方法，毛細(xì)管內(nèi)只充入緩衝溶液，分析之成分以不同的速率在分立的區(qū)帶內(nèi)進行遷移，正、負(fù)離子化合物即可分離，而中性化合物在電場中則不會移動。MEKC是毛細(xì)管電泳中應(yīng)用最廣的方法之一，既能分離中性成分，也能分離帶電成分，MEKC主要是在緩衝溶液中，加入一定濃度以上的界面活性劑，以形成膠束，其應(yīng)用範(fàn)圍包括維生素、大部分藥物及中藥成分。本文所舉之天麻及玄參兩個例子，皆為MEKC方法，且均以膽酸鈉作為界面活性劑，分析二種藥材中之不帶電荷高極性成分。毛細(xì)管電泳之分析方法，係利用不同樣品離子電荷泳動速度的差異，配合毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)在外加高電場下所產(chǎn)生的電滲流，形成各種樣品離子在毛細(xì)管中淨(jìng)移動速度不同，因而達(dá)到分離效果。與傳統(tǒng)的平板電泳或高效液相層析比較，毛細(xì)管電泳的分離效率極高，理論板數(shù)常在105107左右。另外，毛細(xì)管口徑小，散熱效果佳，因此可使用高電場進行電泳，大幅縮短樣品分離時間。毛細(xì)管電泳與高效液相層析皆屬液相分離技術(shù)，兩者之分離機制不同，各有其應(yīng)用的價值，惟就分離效率、分析速度、成本花費及樣品用量而言，毛細(xì)管電泳之理論板數(shù)較高，分析速度更快，幾乎不消耗溶劑，而樣品用量僅高效液相層析的數(shù)百分之一。毛細(xì)管電泳只要針對不同的分子性質(zhì)如分子大小、電荷數(shù)、疏水性等改變操作模式和緩衝溶液的成分，便可分離不同的樣品。相較之下毛細(xì)管電泳具有更大的選擇性，欲分析不同的樣品亦不需更換價格昂貴的管柱。毛細(xì)管電泳與高效液相層析之比較整理如下毛細(xì)管電泳高效液相層析分析速度較快較慢理論板數(shù)較高較低溶媒消耗無或少多樣品量低以NL計高L計管柱價格低高管柱清洗快、容易費時自動化高不容易二毛細(xì)管電泳應(yīng)用一麻藥材中PARISHIN、PARISHINB及PARISHINC之含量測定天麻，原名赤箭，別名明天麻，係蘭科ORCHIDACEAE植物天麻GASTRODIAELATA的乾燥根莖。PARISHINTRIS4DGLUCOPYRANOSYLOXYBENZYLCITRATE、PARISHINB及PARISHINC1,2及1,3BIS4DGLUCOPYRANOSYLOXYBENZYLCITRATE為自天麻分離得到之三種高極性成分，分別為帶有三個及二個葡萄糖之檸檬酸鹽，筆者建立了三種成分之毛細(xì)管電泳與高效液相層析之分析方法，其條件如下1高效液相層析之條件高效液相層析儀HITACHI廠牌HPLCL6200PUMP連接HITACHI廠牌L3000PHOTODIODEARRAY檢測器及SHIMAZU廠牌SIL9A自動注射器。分析柱COSMOSIL5C18AR，5M，內(nèi)徑46MMID150MM。檢測波長UV222NM。移動相A甲醇。B01磷酸溶液。時間分AB01585152575303070線性梯度條件403070流速10ML/MIN。內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品SULFAMETHOXYPYRIDAZINE。2毛細(xì)管電泳層析之條件毛細(xì)管電泳儀BECKMAN廠牌P/ACE5500。毛細(xì)管BECKMAN內(nèi)徑75MM67CMUNCOATEDCAPILLARY。檢測波長UV222NM。緩衝液20MMSODIUMTETRABORATE及20MMSODIUMDIHYDROGENPHOSPHATE調(diào)配為PH65含100MMSODIUMCHOLATE之溶液。溫度30。電壓15KV。內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品METHYLPARABEN。天麻三種成分之毛細(xì)管電泳分析，緩衝液用PH65四硼酸鈉及磷酸二氫鈉，加入膽酸鈉作界面活性劑，其圖譜如圖一所示，可在十七分鐘內(nèi)完成，並且有很好的回收率9481005及再現(xiàn)性同日內(nèi)之相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為123280；異日間之相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為172324，高效液相層析分析時間較長，如圖二所示，為毛細(xì)管電泳之二倍。比較二種方法之再現(xiàn)性如表一，毛細(xì)管電泳無論在三次分析成分時間或含量測定之相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，其結(jié)果均在2以下，與高效液相層析相當(dāng)。以二種方法定量分析四件市售天麻藥材，其結(jié)果相差不多如表二所示。表一天麻藥材中指標(biāo)成分分別以高效液相層析及毛細(xì)管電泳分離之再現(xiàn)性比較高效液相層析毛細(xì)管電泳相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,N3相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,N3指標(biāo)成分滯留時間含量測定遷移時間含量測定PARISHIN124048154118PARISHINB114020131201PARISHINC122175126159二玄參中23HYDROXY4METHOXYPHENYLETHYL1OLARABINOPYRANOSYL16FERULOYL14LRHAMNOPYRANOSYL13DGLUCOPYRANOSIDESNA、HARPAGOSIDESNB及CINNAMICACIDSNC之含量測定玄參，別名元參、黑參，係玄參科SCROPHULARIACEAE植物玄參SCROPHULARIANINGPOENSIS或SBUERGERIANA之乾燥根。SNA、SNB及SNC為自玄參分離得到之三種高極性成分，其中SNA為帶有阿拉伯膠糖、鼠李糖及葡萄糖之複雜化合物；SNB為帶有一個葡萄糖之化合物；SNC桂皮酸為小分子化合物，三種成分之分子量分別為784、494及148，其差異頗大，但因毛細(xì)管電泳之選擇性高，仍可在短時間內(nèi)完成分析。毛細(xì)管電泳與高效液相層析分析方法之條件如下1高效液相層析之條件高效液相層析儀與天麻相同。層析管COSMOSIL5C18AR,5MM,內(nèi)徑46MM150MM。表二四件市售天麻藥材分別以高效液相層析及毛細(xì)管電泳定量之結(jié)果指標(biāo)成分市售藥材毛細(xì)管電泳MG/G高效液相層析MG/GPARISHIN11256135121455151536866994645642PARISHINB1483464248845333313064246232PARISHINC1217225221720831381374125130檢測波長UV278NM。移動相A乙月青B10醋酸溶液。時間分AB01585線性梯度條件442773流速10ML/MIN。內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品SORBICACID。2毛細(xì)管電泳層析之條件毛細(xì)管電泳儀與天麻相同。毛細(xì)管BECKMAN內(nèi)徑75MM67CMUNCOATEDCAPILLARY。表三玄參藥材中指標(biāo)成分分別以高效液相層析及毛細(xì)管電泳分離之再現(xiàn)性高效液相層析毛細(xì)管電泳相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,N3相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,N3指標(biāo)成分滯留時間含量測定遷移時間含量測定SNA006100022111SNB001172028280SNC004172021122檢測波長UV280NM。緩衝液20MMSODIUMTETRABORATE及20MMSODIUMDIHYDROGENPHOSPHATE調(diào)配為PH75含120MMSODIUMCHOLATE及12甲醇之溶液。溫度25。電壓25KV。內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品PROPYLPARABEN。玄參三種成分之毛細(xì)管電泳分析，緩衝液用PH75四硼酸鈉及磷酸二氫鈉，加入膽酸鈉作界面活性劑、甲醇作修飾劑，其圖譜如圖三所示，可在十九分鐘內(nèi)完成，也有很好的回收率10241035及再現(xiàn)性同日內(nèi)之相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為055171；異日間之相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為136383，高效液相層析分析時間較長，如圖四所示，亦為毛細(xì)管電泳之二倍。比較二種方法之再現(xiàn)性如表三，毛細(xì)管電泳在三次分析成分時間，其結(jié)果均在03以下，含量測定之相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，其結(jié)果均在30以下，與高效液相層析相當(dāng)。以二種方法定量分析七件市售玄參藥材，其結(jié)果亦相差不多如表四所示。三結(jié)語毛細(xì)管電泳具有高選擇性、分析時間短、管柱清洗時間短、再現(xiàn)性佳、可自動化等特性，適合用於大量品管分析之用。由上述所舉例之二個研究觀之，毛細(xì)管電泳可用於中藥成分之分析，其回收率及再現(xiàn)性均不亞於高效液相層析，運用毛細(xì)管電泳從事中藥成分之分析確屬可行。表四七件市售玄參藥材分別以高效液相層析及毛細(xì)管電泳定量之結(jié)果指標(biāo)成分市售藥材毛細(xì)管電泳MG/GHPLCMG/G117017922092003197191411210651671636070065SNA71451451045046SNB206006031461424122122514414160330347067070101601620320323011011402802950270276007007SNC7027028圖二天麻之高效液相層析分析圖譜。1PARISHINB；2PARISHINC；3PARISHIN。IS內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品SULFAMETHOXYPYRIDAZINE圖一天麻之毛細(xì)管電泳分析圖譜。1PARISHINB；2PARISHINC；3PARISHIN。IS內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品METHYLPARABEN。圖三玄參之毛細(xì)管電泳分析圖譜。IS內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品PROPYLPARABEN。圖四玄參之高效液相層析分析圖譜。IS內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品SORBICACID。參考文獻(xiàn)1BEALESC,1998,CAPILLARYELECTROPHORESISANALTICALCHEMISTRY70279R300R2MCLAUGHLINGM,NOLANJA,LINDAHLJL,PALMIERIRH,ANDERSONKW,MORRISSC,MORRISONJAANDBRONZERTTJ,1992,PHARMACEUTICALDRUGSEPARATIONSBYHPCEPRACTICALGUIDELINESJOURNALOFLIQUIDCHROMATOGRAPHY1596110213劉英玫,許順吉,1993,毛細(xì)管電泳在中藥分析上的應(yīng)用,藥物食品分析,421311404顧祐瑞,劉宜祝,郝景平,溫國慶,林哲輝,黃文鴻,1995,天麻藥材中指標(biāo)成分PARISHIN,PARISHINB及C之高效液相層析定量法之探討,藥物食品分析,342