第八章DNA甲基化檢測

第八章DNA甲基化檢測,第一節(jié)DNA甲基化概述一、DNA甲基化的分子機(jī)制二、DNA甲基化與疾病三、DNA甲基化檢測方法第二節(jié)DNA甲基化的預(yù)測第三節(jié)MeDIP-PCR檢測eif5a基因在脊髓損傷大鼠腓腸肌的DNA甲基化改變,第一節(jié)DNA甲基化概述一、DNA甲基化的分子機(jī)制,表觀遺傳學(xué)是一種可遺傳的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制。不同于經(jīng)典遺傳學(xué)，表觀遺傳學(xué)不涉及基因序列的改變，而且表觀遺傳修飾是可逆的，在基因調(diào)控中起重要作用。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)主要調(diào)控機(jī)制之一，在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變以及人類疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。DNA甲基化是指，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT)作用下以S-腺苷甲硫氨酸（SAM)作為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到DNA脫氧胞嘧啶的第五位C，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的化學(xué)修飾過程這一過程通常發(fā)生在二核苷酸CpG中的胞嘧啶，是最常見的哺乳動(dòng)物基因組DNA后天修飾。,CpG島（CGI）：CpG在基因中呈不均勻分布，富含CpG二核苷酸序列的片段成為CpG島哺乳動(dòng)物的DNMTs主要包括DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、和DNMT3L。DNMT1作用于僅有一條甲基化的DNA雙鏈。使其完全甲基化，保證甲基化方式在秦代和子代之間的傳遞。DNMT3A和DNMT3BB屬于從頭甲基化酶，可使非甲基化CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化，繼而使半甲基化的位點(diǎn)發(fā)生全甲基化。DNMT3L本身并不具有DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶活性，可能通過調(diào)節(jié)DNMT3A或DNMT3B的功能發(fā)揮作用。DNA去甲基化機(jī)制：TET蛋白家族是重要的去甲基化酶，具有催化5-mC羥基化的酶活性，使5-mC修飾成為5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC），5-hmC可被胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG)識(shí)別并切除，在通過堿基切除修復(fù)途徑最終將該位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為C，從而實(shí)現(xiàn)DNA去甲基化。,DNA甲基化雖未改變核苷酸順序及其組成，但普遍認(rèn)為可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá)，尤其是轉(zhuǎn)錄起始階段。一般來說，基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化可以使一些轉(zhuǎn)錄因子無法與DNA結(jié)合而抑制基因的轉(zhuǎn)錄，而該區(qū)域的去甲基化則可以激活基因的轉(zhuǎn)錄。另外，DNA甲基化還可能直接抑制RNA聚合酶活性而抑制基因的表達(dá)。此外，細(xì)胞內(nèi)還存在一些專門與甲基化序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，如果甲基化的轉(zhuǎn)錄元件被這樣的蛋白質(zhì)結(jié)合就抑制了轉(zhuǎn)錄因子的正常結(jié)合。,二、DNA甲基化與疾病,DNA甲基化在脊椎動(dòng)物胚胎早期發(fā)育中有重要作用，Dnmt基因的缺失會(huì)影響胚胎早期發(fā)育和多個(gè)器官的形成及分化。如胚胎早期致死、內(nèi)臟器官和神經(jīng)系統(tǒng)終末分化缺陷以及血液發(fā)生紊亂等。單基因水平及基因組范圍內(nèi)的甲基化改變在腫瘤發(fā)生發(fā)展中亦發(fā)揮重要作用。DNA甲基化的異常改變可能是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的早期標(biāo)志。長期酒精攝取可以導(dǎo)致神經(jīng)環(huán)路甲基化的改變。甲基化異?？赡芘c自身免疫性疾病相關(guān)。,三、DNA甲基化檢測方法,總DNA甲基化定量試劑盒試驗(yàn)中，DNA被固定在聯(lián)管中，這些聯(lián)管已經(jīng)被處理過，具備高DNA親和力。DNA甲基化的部分能夠通過5-甲基胞嘧啶抗體辨識(shí)并通過ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))之類反應(yīng)進(jìn)行定量。DNA甲基化的量同OD強(qiáng)度成一定比例。手動(dòng)或者高通量分析整個(gè)操作僅需要4小時(shí)。高效液相色譜是根據(jù)DNA或蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量和構(gòu)象的不同而使其加以分離。由于在動(dòng)態(tài)相和靜態(tài)相下分子的光吸收度并不相同而加以定量，隨著系統(tǒng)的壓強(qiáng)的增加，其分辨率增高，故而能夠定量測定基因組整體水平DNA甲基化水平。過程是將DNA樣品先經(jīng)鹽酸或氫氟酸水解成堿基，水解產(chǎn)物通過色譜柱，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品比較，用紫外光測定吸收峰值及其量，計(jì)算5mC/(5mC+5C)的積分面積就得到基因組整體的甲基化水平。高效毛細(xì)管電泳法是一種利用窄孔熔融石英毛細(xì)管來從復(fù)合物中分離不同化學(xué)組分的技術(shù)。其基礎(chǔ)是在強(qiáng)電場下不同分子的由于其所帶電荷、大小、結(jié)構(gòu)以及疏水性等不同而相互分開。用這種方法處理DNA水解產(chǎn)物來確定5mC水平,簡便、經(jīng)濟(jì)且敏感性高。,甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶方法是經(jīng)典的甲基化分析方法，主要根據(jù)一些限制性內(nèi)切酶不能切開甲基化的DNA序列。由于在真核DNA或者哺乳動(dòng)物DNA中，只有CG相連的胞嘧啶能夠被甲基化，因此在酶切位點(diǎn)內(nèi)包含CG序列的限制性內(nèi)切酶就會(huì)遇到問題。這種方法所使用的兩個(gè)經(jīng)典酶對(duì)是HPa-Msp(CCGG）。兩個(gè)酶都識(shí)別CCGG序列，而當(dāng)其中的胞嘧啶甲基化時(shí)，HPa不能夠?qū)⑵淝虚_，利用HPa-Msp的這種屬性處理DNA，這就使得HPa-Msp能夠作為快速甲基化分析的工具，隨后進(jìn)行Southern或PCR擴(kuò)增分離產(chǎn)物明確甲基化狀態(tài)。單鏈DNA在亞硫酸氫鈉存在的條件下,能有效地將未甲基化的脫氧胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)化為脫氧尿嘧啶(U),隨后作PCR擴(kuò)增。此過程進(jìn)一步將模板上的尿嘧啶(U),進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為脫氧胸腺嘧啶(T),而甲基化的胞嘧啶(mC)不受亞硫酸氫鈉影響保持不變。使DNA片段甲基化狀態(tài)的差異轉(zhuǎn)化為堿基序列的差異，根據(jù)這種差異即可以獲得目的片段的甲基化信息.MSP法的原理是用亞硫酸氫鹽處理目的DNA,然后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后通過瓊脂糖凝膠電泳確定與引物互補(bǔ)的序列的甲基化狀態(tài)。,高分辨率熔解是一種不需要PCR產(chǎn)物后續(xù)操作的簡單且靈敏的檢測基因甲基化水平的方法。采用重亞硫酸鹽處理DNA模板后在PCR反應(yīng)前，在非CpG島位置設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后DNA鏈的引物，這對(duì)引物中間包含有意義的甲基CpG島，一旦這些CpG島發(fā)生甲基化，胞嘧啶不發(fā)生變化而未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶。樣品中的GC含量發(fā)生了變化，最終被轉(zhuǎn)化成了熔解Tm值之間的差異CpG位點(diǎn)在小的擴(kuò)增片段內(nèi)的相對(duì)位置也會(huì)對(duì)熔解峰的形狀產(chǎn)生影響，因此，根據(jù)Tm值和熔解峰的形狀可以檢測出樣本的甲基化位點(diǎn)和甲基化程度。甲基化DNA免疫沉淀法是一種高效富集甲基化DNA的方法。在該方法中，可與5mC特異性結(jié)合的抗體加入到變性的基因組DNA片段中，從而使甲基化的基因組片段免疫沉淀，形成富集，通過與已有DNA微芯片技術(shù)相結(jié)合，從而進(jìn)行大規(guī)模DNA甲基化分析。該方法簡便、特異性高，適合DNA甲基化組學(xué)的分析。高密度的甲基化芯片是研究全基因甲基化狀態(tài)的有力工具。,第二節(jié)DNA甲基化的預(yù)測,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康念A(yù)測大鼠基因eif5a(geneID;287444)啟動(dòng)子區(qū)域甲基化CpG島分布。二、實(shí)驗(yàn)原理使用ensembl查找eif5a基因的序列信息，再使用MethPrimer進(jìn)行甲基化CpG島的預(yù)測,三、實(shí)驗(yàn)方法,（一）使用ensembl查找eif5a基因的序列信息（1）打開ensembl（2）輸入種屬：rat基因名稱eif5a點(diǎn)擊“GO”開始搜索,（3）在搜索結(jié)果中點(diǎn)擊第一個(gè)“eif5a（ratgene）”，進(jìn)入該基因信息界面。（4）點(diǎn)擊左側(cè)的sequence得到DNA序列信息（5）點(diǎn)擊左側(cè)的configurethispage進(jìn)行設(shè)置。在彈出的對(duì)話框中將5flankingsequence(upstream)改為3000。即可得到eif5a基因上游3000bp序列信息。設(shè)置完成點(diǎn)擊對(duì)話框右上角的對(duì)勾即可。,（6）從開始選擇一個(gè)序列一直到第一個(gè)外顯子后。復(fù)制這一段序列。（二）使用MethPrimer進(jìn)行甲基化CpG島的預(yù)測（1）打開網(wǎng)址將上述復(fù)制的序列信息粘貼在對(duì)話框中，pickprimerfor和pickMSPprimers選項(xiàng)默認(rèn)。點(diǎn)擊submit即可。,（2）得到預(yù)測的CpG島為圖中藍(lán)色區(qū)域。在預(yù)測圖下方會(huì)有具體的文字信息，從該信息表我們可以看到軟件預(yù)測得到兩個(gè)CpG島。從預(yù)測圖可見第二個(gè)島過大，我們將對(duì)第一個(gè)島甲基化水平進(jìn)行檢測。根據(jù)表格中的信息得到我們復(fù)制得到的序列從2541-2747bp為CpG島。,第三節(jié)MeDIP-PCR檢測eif5a基因在脊髓損傷大鼠腓腸肌的DNA甲基化改變,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹拔覀兪褂肕ethPrimer軟件成功預(yù)測到大鼠eif5a基因在啟動(dòng)子區(qū)域存在甲基化CpG島。現(xiàn)在，我們使用ChIP-qPCR技術(shù)對(duì)大鼠脊髓損傷后腓腸肌eif5a基因甲基化狀態(tài)進(jìn)行鑒定。二、實(shí)驗(yàn)原理ChIP技術(shù)利用甲基化DNA特異性抗體富集被甲基化修飾的DNA片段；qPCR技術(shù)使用SYBR熒光染料，非特異性的摻入DNA雙鏈，發(fā)射熒光，保證熒光信號(hào)的增加與產(chǎn)物的增加完全同步，最后利用Ct值對(duì)富集得到的甲基化DNA片段進(jìn)行相對(duì)定量分析。ChIP-qPCR能夠?qū)Ｒ弧㈧`敏、快速、高重復(fù)地定量生物樣品中甲基化修飾的DNA。,三、實(shí)驗(yàn)材料與方法,（一）實(shí)驗(yàn)材料1、所需設(shè)備,2、所需試劑（二）實(shí)驗(yàn)具體方法和操作步驟1、DNA提取2、超聲破碎DNA和電泳檢測3、甲基化DNA的富集4、熒光定量PCR檢測eif5a基因甲基化水平改變,四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）對(duì)超聲后的DNA進(jìn)行電泳，與陽性對(duì)照（Hela）類似，樣品DNA被成功打斷成250bp左右的片段(圖8-1）()同時(shí)對(duì)甲基化DNA富集前的inputDNA和甲基化富集DNA進(jìn)行PCR,擴(kuò)增片段如圖8-2。擴(kuò)增曲線在20-30循環(huán)起跳，表示樣本含量處于合理范圍內(nèi)。溶解曲線單峰，表示擴(kuò)增特異性較好。,(）TotalinputDNA樣品作為模板，用待測基因特異性引物進(jìn)行qPCR檢測得到Ct值(Input）。ChIPDNA樣品作為模板，用待測基因特異性引物進(jìn)行qPCR檢測得到Ct值(ChIP）。樣品甲基化相對(duì)量（ChIP/Totalinput）通過以下公式計(jì)算:ChIP/Totalinput=2Ct(Input)-Ct(ChIP)通過結(jié)果可見脊髓損傷后,大鼠腓腸肌eif5a基因DNA甲基化水平降低。此結(jié)果與我們之前得到的eif5a在脊髓損傷大鼠腓腸肌中高表達(dá)結(jié)果相吻合(圖8-3）。,五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng),該實(shí)驗(yàn)需要注意，DNA一定要斷裂為250bp左右的小片段。如果片段過大，會(huì)導(dǎo)致抗體富集甲基化DNA時(shí)，將甲基化和非甲基化區(qū)域全部富集出來，最后的PCR定量時(shí)會(huì)導(dǎo)致甲基化水平無法分辨出