實(shí)驗(yàn)1蔗糖密度梯度離心法提取葉綠體VIP

蔗糖密度梯度離心法提取葉綠體一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆帐止ぶ谱髅芏忍荻鹊募夹g(shù)，了解蔗糖密度梯度離心的原理及優(yōu)缺點(diǎn)。二 實(shí)驗(yàn)原理2.1 概述密度梯度區(qū)帶離心法（簡(jiǎn)稱區(qū)帶離心法）：是將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。此法的優(yōu)點(diǎn)是：分離效果好，可一次獲得較純顆粒；適應(yīng)范圍廣，能像差速離心法一樣分離具有沉降系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒；顆粒不會(huì)擠壓變形，能保持顆?；钚?，并防止已形成的區(qū)帶由于對(duì)流而引起混合。 此法的缺點(diǎn)是：離心時(shí)間較長(zhǎng)；需要制備惰性梯度介質(zhì)溶液；操作嚴(yán)格，不易掌握。 密度梯度區(qū)帶離心法又可分為兩種： （1）差速區(qū)帶離心法：當(dāng)不同的顆粒間存在沉降速度差時(shí)（不需要像差速沉降離心法所要求的那樣大的沉降系數(shù)差）。在一定的離心力作用下，顆粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介質(zhì)的不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法稱為差速區(qū)帶離心法。此法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒（20% 的沉降系數(shù)差或更少）或分子量相差3倍的蛋白質(zhì)，與顆粒的密度無(wú)關(guān)，大小相同，密度不同的顆粒（如線粒體，溶酶體等）不能用此法分離。 離心管先裝好密度梯度介質(zhì)溶液，樣品液加在梯度介質(zhì)的液面上，離心時(shí)，由于離心力的作用，顆粒離開(kāi)原樣品層，按不同沉降速度向管底沉降，離心一定時(shí)間后，沉降的顆粒逐漸分開(kāi)，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶，沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低，離心必須在沉降最快的大顆粒到達(dá)管底前結(jié)束，樣品顆粒的密度要大于梯度介質(zhì)的密度。梯度介質(zhì)通常用蔗糖溶液，其最大密度和濃度可達(dá)1.28 kg/cm3和60。 此離心法的關(guān)鍵是選擇合適的離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間 （2）等密度區(qū)帶離心法：離心管中預(yù)先放置好梯度介質(zhì)，樣品加在梯度液面上，或樣品預(yù)先與梯度介質(zhì)溶液混合后裝入離心管，通過(guò)離心從而形成梯度，這就是預(yù)形成梯度和離心形成梯度的等密度區(qū)帶離心產(chǎn)生梯度的二種方式。 離心時(shí)，樣品的不同顆粒向上浮起，一直移動(dòng)到與它們的密度相等的等密度點(diǎn)的特定梯度位置上，形成幾條不同的區(qū)帶，這就是等密度離心法。體系到達(dá)平衡狀態(tài)后，再延長(zhǎng)離心時(shí)間和提高轉(zhuǎn)速已無(wú)意義，處于等密度點(diǎn)上的樣品顆粒的區(qū)帶形狀和位置均不再受離心時(shí)間所影響，提高轉(zhuǎn)速可以縮短達(dá)到平衡的時(shí)間，離心所需時(shí)間以最小顆粒到達(dá)等密度點(diǎn)（即平衡點(diǎn)）的時(shí)間為基準(zhǔn)，有時(shí)長(zhǎng)達(dá)數(shù)日。 等密度離心法的分離效率取決于樣品顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越好，與顆粒大小和形狀無(wú)關(guān)，但大小和形狀決定著達(dá)到平衡的速度、時(shí)間和區(qū)帶寬度。 等密度區(qū)帶離心法所用的梯度介質(zhì)通常為氯化絕（CSCl），其密度可達(dá)1.7g/cm3。此法可分離核酸、亞細(xì)胞器等，也可以分離復(fù)合蛋白質(zhì)，但簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)不適用。2.2 梯度溶液的制備（1）梯度材料的選擇原則。作為一種理想的梯度材料應(yīng)具備以下幾點(diǎn)：與被分離的生物材料不發(fā)生反應(yīng)即完全惰性，且易與所分離的生物粒子分開(kāi)?？蛇_(dá)到要求的密度范圍，且在所要求的密度范圍內(nèi)，粘度低，滲透壓低，離子強(qiáng)度和pH變化較小。不會(huì)對(duì)離心設(shè)備發(fā)生腐蝕作用。容易純化，價(jià)格便宜或容易回收。濃度便于測(cè)定，如具有折光率。對(duì)于超速離心分析工作來(lái)說(shuō)，它的物理性質(zhì)、熱力學(xué)性質(zhì)應(yīng)該是已知的。這些條件是理想條件，完全符合每種性能的梯度材料幾乎是沒(méi)有的。下面介紹幾種基本上符合上述原則的梯度材料：糖類：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。無(wú)機(jī)鹽類：CsCl（氯化銫）、RbCl（氯化銣）、NaCl、KBr等。有機(jī)碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等。硅溶膠：如Percoll。蛋白質(zhì)：如牛血清白蛋白。重水。非水溶性有機(jī)物：如氟代碳等。（2）梯度材料的應(yīng)用范圍 蔗糖：水溶性大，性質(zhì)穩(wěn)定，滲透壓較高，其最高密度可達(dá)1.33g/ml，且由于價(jià)格低容易制備，是現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室里常用于細(xì)胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由于有較大的滲透壓，不宜用于細(xì)胞的分離。 聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相對(duì)分子重量為400000，F(xiàn)icoll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分離各種細(xì)胞包括血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、鼠肝細(xì)胞等。 氯化銫：是一種離子性介質(zhì)、水溶性大，最高密度可達(dá)1.91g/ml。由于它是重金屬鹽類，在離心時(shí)形成的梯度有較好的分辨率，被廣泛地用于DNA、質(zhì)粒、病毒和脂蛋白的分離，但價(jià)格較貴。 鹵化鹽類：KBr和NaCl可用于脂蛋白分離，KI和NaI可用于RNA分離，其分辨率高于銫鹽。NaCl梯度也可用于分離脂蛋白，NaI梯度可分離天然或變性的DNA。 Percoll：是商品名，它是一種SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮（PVP），滲透壓低，它對(duì)生物材料的影響小，而且顆粒穩(wěn)定，在冷卻和凍融情況下還是穩(wěn)定的，其粘度高，且在酸性pH和高離子強(qiáng)度下不穩(wěn)定。它可用于細(xì)胞、細(xì)胞器和病毒的分離。2.3 密度梯度區(qū)帶離心法圖解圖2-23 A速度沉降，B等密度沉降2.4 收集區(qū)帶的方法（1）用注射器和滴管由離心管上部吸出。（2）有針刺穿離心管底部滴出。（3）用針刺穿離心管區(qū)帶部份的管壁，把樣品區(qū)帶抽出。（4）用一根細(xì)管插入離心管底，泵入超過(guò)梯度介質(zhì)最大密度的取代液，將樣品和梯度介質(zhì)壓出，用自動(dòng)部分收集器收集。三 實(shí)驗(yàn)材料新鮮菠菜葉。四 實(shí)驗(yàn)器材組織搗碎器，高速冷凍離心機(jī)，普通離心機(jī)，離心管，Corex離心管，燒杯，漏斗，紗布，載玻片，蓋玻片。普通光學(xué)顯微鏡，剪刀，滴管，熒光顯微鏡。五 實(shí)驗(yàn)藥品5.1 勻漿介質(zhì)（0.25mol/L蔗糖、0.05mol/L Tris-Hcl緩沖液，pH7.4）配制方法： 稱取85.55g 蔗糖，6.05g Tris，溶解在近400ml蒸餾水中，加入約4.25ml 0.1mol/L的Hcl溶液，最后用蒸餾水定容至500ml。5.2 60% 蔗糖溶液，50蔗糖溶液，40% 蔗糖溶液，20%蔗糖溶液，15蔗糖溶液配制方法：配制80% 的蔗糖溶液，然后按照下表進(jìn)行稀釋，分別配制成50%，40%，20%，15% 的蔗糖溶液。六 實(shí)驗(yàn)步驟6.1 洗凈菠菜葉，盡可能使它干燥，去除葉柄、主脈后，稱取50g，剪碎。6.2 加入預(yù)冷到近0的勻漿介質(zhì)100ml，在組織搗碎機(jī)上選高速檔搗碎2min。6.3 搗碎液用雙層紗布過(guò)濾到燒杯中。6.4 濾液移入普通玻璃離心管，在普通離心機(jī)上500r/min離心5min，輕輕吸取上清液。6.5 在Polyallomer離心管內(nèi)依次加入50蔗糖溶液和15 蔗糖溶液 (或依次加入60%，40%，20%，15% 的蔗糖溶液)，注意要用滴管吸取15 蔗糖溶液沿離心管壁緩緩注入，不能攪動(dòng)50 蔗糖液面，一般兩種溶液各加12ml （如果是四個(gè)梯度則每個(gè)梯度加6ml）。加液完成后，可見(jiàn)兩種溶液界面處折光率稍不同，形成分層界面，這樣密度梯度便制好了.6.6 在制好的密度梯度上小心地沿離心管壁加入1ml上清夜。6.7 嚴(yán)格平衡離心管，份量不足的管內(nèi)輕輕加入少量上清夜。6.8 用甩平轉(zhuǎn)頭離心18000r/min，90min。6.9 取出離心管，可見(jiàn)葉綠體在密度梯度液中間形成帶，用滴管輕輕吸出滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察。還可在暗室內(nèi)用熒光顯微鏡觀察。七 結(jié)果與分析結(jié)果如圖所示，葉綠體在由兩種不同濃度的蔗糖溶液組成的混合液中，形成一條帶，聚集在密度梯度交界處；而在由四種不同濃度的蔗糖溶液組成的混合液中，葉綠體可形成兩條帶，聚集在密度梯度交界處。沉降系數(shù)較大的細(xì)胞組份則沉到離心管底部。吸出葉綠體制成臨時(shí)裝片，暗室內(nèi)用熒光顯微鏡觀察，視野中可見(jiàn)到許多的小紅點(diǎn)，這是由于葉綠體被熒光激發(fā)而產(chǎn)生的。結(jié)果證明，該方法可以較好的分離出葉綠體。八 離心操作的注意事項(xiàng)高速與超速離心機(jī)是生化試驗(yàn)教學(xué)和生化科研的重要精密設(shè)備，因其轉(zhuǎn)速高，產(chǎn)生的離心力大，使用不當(dāng)或缺乏定期的檢修和保養(yǎng)，都可能發(fā)生嚴(yán)重事故，因此使用離心機(jī)時(shí)都必須嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。8.1 使用各種離心機(jī)時(shí)，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，平衡時(shí)重量之差不得超過(guò)各個(gè)離心機(jī)說(shuō)明書(shū)上所規(guī)定的范圍，每個(gè)離心機(jī)不同的轉(zhuǎn)頭有各自的允許差值，轉(zhuǎn)頭中絕對(duì)不能裝載單數(shù)的管子，當(dāng)轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時(shí)，管子必須互相對(duì)稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負(fù)載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。8.2 裝載溶液時(shí)，要根據(jù)各種離心機(jī)的具體操作說(shuō)明進(jìn)行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無(wú)蓋，液體不得裝得過(guò)多，以防離心時(shí)甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕，而制備性超速離心機(jī)的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時(shí)塑料離心管的上部凹陷變形。每次使用后，必須仔細(xì)檢查轉(zhuǎn)頭，及時(shí)清洗、擦干，轉(zhuǎn)頭是離心機(jī)中須重點(diǎn)保護(hù)的部件，搬動(dòng)時(shí)要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉(zhuǎn)頭長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)，要涂上一層上光臘保護(hù)，嚴(yán)禁使用顯著變形、損傷或老化的離心管。8.