宏基因組學概述VIP

宏基因組學概述王瑩，馬伊鳴（北京交通大學 土木建筑工程學院 環(huán)境1402班）摘 要：隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展及其在微生物生態(tài)學和環(huán)境微生物學研究中的廣泛應(yīng)用，促進了以環(huán)境中未培養(yǎng)微生物為研究對象的新興學科微生物環(huán)境基因組學(又叫宏基因組學、元基因組學，英文名Metagenomics)的產(chǎn)生和快速發(fā)展。宏基因組學通過直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA，構(gòu)建宏基因組文庫，利用基因組學的研究策略研究環(huán)境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能在短短幾年內(nèi)，宏基因組學研究已滲透到各個領(lǐng)域，包括海洋、土壤、熱液口、熱泉、人體口腔及胃腸道等，并在醫(yī)藥、替代能源、環(huán)境修復、生物技術(shù)，農(nóng)業(yè)、生物防御及倫理學等各方面顯示了重要的價值。本文對宏基因組學的主要研究方法、熱點內(nèi)容及發(fā)展趨勢進行了綜述關(guān)鍵詞：宏基因組宏基因組學環(huán)境基因組學基因文庫的構(gòu)建Macro summary of MetagenomicsWang Ying, Ma Yi-Ming （BeijingJiaotongUniversity, Institute of civil engineering,）Key words: Metagenome; Metagenomics; The environmental genomics宏基因組學（Metagenomics）又叫微生物環(huán)境基因組學、元基因組學。它通過直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA,構(gòu)建宏基因組文庫，利用基因組學的研究策略研究環(huán)境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。它是在微生物基因組學的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種研究微生物多樣性、開發(fā)新的生理活性物質(zhì)（或獲得新基因）的新理念和新方法。其主要含義是：對特定環(huán)境中全部微生物的總DNA（也稱宏基因組，metagenomic）進行克隆，并通過構(gòu)建宏基因組文庫和篩選等手段獲得新的生理活性物質(zhì)；或者根據(jù)rDNA數(shù)據(jù)庫設(shè)計引物，通過系統(tǒng)學分析獲得該環(huán)境中微生物的遺傳多樣性和分子生態(tài)學信息。1.起源宏基因組學這一概念最早是在1998年由威斯康辛大學植物病理學部門的Jo Handelsman等提出的，是源于將來自環(huán)境中基因集可以在某種程度上當成一個單個基因組研究分析的想法，而宏的英文是meta-，具有更高層組織結(jié)構(gòu)和動態(tài)變化的含義。后來伯克利分校的研究人員Kevin Chen和Lior Pachter將宏基因組定義為應(yīng)用現(xiàn)代基因組學的技術(shù)直接研究自然狀態(tài)下的微生物的有機群落，而不需要在實驗室中分離單一的菌株的科學。2 研究對象宏基因組學(Metagenomics)是將環(huán)境中全部微生物的遺傳信息看作一個整體自上而下地研究微生物與自然環(huán)境或生物體之間的關(guān)系。宏基因組學不僅克服了微生物難以培養(yǎng)的困難, 而且還可以結(jié)合生物信息學的方法, 揭示微生物之間、微生物與環(huán)境之間相互作用的規(guī)律, 大大拓展了微生物學的研究思路與方法, 為從群落結(jié)構(gòu)水平上全面認識微生物的生態(tài)特征和功能開辟了新的途徑。目前, 微生物宏基因組學已經(jīng)成為微生物研究的熱點和前沿, 廣泛應(yīng)用于氣候變化、水處理工程系統(tǒng)、極端環(huán)境、人體腸道、石油污染、生物冶金等領(lǐng)域, 取得了一系列引人矚目的重要成果。3 研究方法宏基因組學的研究過程一般包括樣品和基因(組)的富集；提取特定環(huán)境中的基因組 DNA；構(gòu)建宏基因組 DNA 文庫；篩選目的基因；目的基因活性產(chǎn)物表達(圖 1)五個步驟。 圖1 環(huán)境微生物宏基因組學研究過程Fig. 1 General process of metagenomic strategie3.1 環(huán)境樣品及目的基因組富集在宏基因組文庫篩選過程中目的基因僅占總 DNA 的一小部分, 對環(huán)境樣品的預富集可以大大提高目的基因的檢出幾率。目前預富集技術(shù)主要分為細胞水平富集和基因組水平富集。其中細胞水平富集主要是通過利用選擇培養(yǎng)基對目的微生物進行富集培養(yǎng), 最常用的方法是底物選擇, 此外還包括營養(yǎng)選擇及物理化學指標選擇。但是由于富集培養(yǎng)選擇性地富集了具有快速生長特性的菌群, 因此導致大部分物種多樣性信息丟失。目前可以通過先在嚴格脅迫條件下短期處理, 然后改為較溫和的處理條件, 可以從一定程度上克服這種方法的局限性?；蚪M水平富集常用的技術(shù)為穩(wěn)定同位素探針技術(shù)(SIP), 原理是采用穩(wěn)定同位素標記底物, 其中的“重”原子摻入到具有代謝活性的微生物核酸中, 采用密度梯度離心的方法將“重”的 DNA 與“輕”組分分離, 被標記的“重”核酸可以作為 PCR 的模板, 用來構(gòu)建宏基因組文庫。例如采用 C 標記的甲醇研究森林土壤宏基因組 DNA, 結(jié)果鑒定出變形細菌 -亞綱中所有已知的嗜甲基菌, 并在一種嗜酸菌中發(fā)現(xiàn)了新的甲醇還原酶基因。此外, 還有報道利用抑制性消減雜交技術(shù)、差異顯示技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、親和捕獲技術(shù)及 DNA 微陣技術(shù)等技術(shù)來富集目的基因。 3.2宏基因組 DNA 的提取獲得高濃度、大片段、無偏好的環(huán)境樣品總 DNA 是宏基因組文庫構(gòu)建的難點之一。近年已有多種宏基因組DNA的提取純化方法陸續(xù)建立起來, 大體可分為兩類: 一類是直接提取法, 又稱原位提取法。這類方法不經(jīng)過樣品中微生物的培養(yǎng)和分離, 通過化學法、酶解法或物理法直接破碎環(huán)境中的微生物細胞而使 DNA 得以釋放, 并對 DNA 進行純化。其中以 Zhou 法和 Tsai法最為常用。該法操作簡便、省時、成本低, 所獲得 DNA 具有較好的完整性, 并能夠代表某一生境的微生物群落多樣性。但該發(fā)放常會出現(xiàn)細胞裂解不完全或 DNA 與土壤雜質(zhì)成分產(chǎn)生共沉淀而無法有效地去除等問題, 所以一般需要進一步的DNA純化處理, 同時所提取獲得的 DNA 片段較小(1 kb50 kb), 主要適用于小片段文庫的構(gòu)建; 另一類是間接提取法, 即異位提取法, 是利用離心介質(zhì)或者梯度離心等方法先把微生物從環(huán)境樣品中分離出來, 再按處理純培養(yǎng)細胞的方法裂解微生物細胞提取 DNA。該法獲得的宏基因組 DNA 受到胞外雜質(zhì)污染干擾較少, 純度較高、DNA 完整性好(20 kb500 kb), 適合構(gòu)建大片段的宏基因組文庫。但該法操作較繁瑣、費時、成本高、偏差大、DNA 得率較低, 其產(chǎn)率只是直接裂解法的 1%10%且獲得的 DNA 往往不能完全代表樣品所在生境的生態(tài)學多樣性。本實驗室對溫泉淤泥、紙廠污泥、紅樹林淤泥、沼澤淤泥等 12 個環(huán)境樣品的總 DNA 提取方法進行了摸索, 研究工作表明，直接提取法提取效率較高, 不容易丟失物種信息, 能夠獲得 23 kb 左右的 DNA 片段。并首次加入漆酶來有效去處腐殖酸類物質(zhì), 比聚乙烯吡咯烷酮 (PVPP)處理效果更好, DNA 得率更高。而間接提取法 DNA 提取效率較低, 容易丟失物種信息。因此, 建議采用直接提取法獲得環(huán)境樣品的總 DNA, 以便分析環(huán)境樣品微生物群落多樣性信息。3.3 宏基因組文庫的構(gòu)建3.3.1 載體的選擇載體選擇在宏基因組技術(shù)中占有十分重要的地位。載體系統(tǒng)的選擇主要依賴于DNA 提取質(zhì)量、插入片段、質(zhì)?？截悢?shù)、宿主菌及篩選方法。根據(jù)克隆載體的不同宏基因組文庫可分為質(zhì)粒文庫、細菌/酵母人工染色體文庫、噬菌體類載體文庫。早期宏基因組文庫主要以質(zhì)粒載體和大腸桿菌宿主細胞構(gòu)建而成的小片段(15 kb)文庫。該文庫操作簡便、拷貝數(shù)高、對 DNA 質(zhì)量要求不高, 適合純度低或剪切較嚴重的 DNA 模版。但插入片段小, 篩選量大, 活性比率低, 對大基因簇無能為力, 主要適用于分析新的基因序列信息及篩選編碼代謝相關(guān)的單一基因或小操縱子。然而, 很多微生物活性物質(zhì)是其次生代謝產(chǎn)物, 代謝途徑由多基因簇調(diào)控, 因此盡量插入大片段DNA以獲得完整的代謝途徑多基因簇是很有必要的, 目前已有報道能容納15 kb40 kb外源DNA的 Fosmid 文庫和Cosmid 文庫, 同時已經(jīng)成功構(gòu)建了容量高達 200 kb350 kb 外源 DNA 的細菌人工染色體文庫和酵母人工染色體文庫。該文庫不僅擁有巨大的插入片段載量, 而且穩(wěn)定性好、篩選效率高、克隆表達能力強, 可獲得基因簇表達活性物質(zhì)。主要用于分析某一生境中微生物群落多樣性及篩選由基因簇或多個基因控制表達的活性物質(zhì)。但其操作較復雜繁瑣、對 DNA 純度要求較高, 且拷貝數(shù)低, 擴增較困難。此外, -噬菌體和其他病毒也可以作為構(gòu)建宏基因組克隆文庫的載體。噬菌體展示庫是一種十分有效的高通量篩選技術(shù), 該技術(shù)通過對表面展示表達產(chǎn)物的親和選擇分離相應(yīng)的 DNA 序列，能夠從宏基因組中富集稀有 DNA 序列，但其局限性在于只能表達分子量小于50kD蛋白。3.3.2宿主細胞的選擇不同的微生物種類所產(chǎn)生的活性物質(zhì)類型有明顯差異。宿主菌株的選擇主要考慮轉(zhuǎn)化效率、重組載體在宿主細胞中的穩(wěn)定性、宏基因的表達、目標性狀(如抗菌)缺陷型等因素。其中 E. coli是最為常用的宿主細胞，其優(yōu)點是操作簡單、繁殖迅速、培養(yǎng)代謝易于控制。但是由于環(huán)境樣品的總 DNA 有很大一部分為真核基因組 DNA, 其在細菌宿主中往往不能表達, 大大限制了這部分基因的篩選。最近已有報道利用鏈霉菌、假單胞菌等真菌作為受體來鑒定有關(guān)新抗生素生物合成的基因。但是最近的生物信息學研究表明, 對于一個插入子(10 kb)的文庫, 為尋找一個目的基因需要篩選 105106 個克隆, 這表明從復雜的宏基因組中篩選目的基因在技術(shù)上還存在著其特殊的困難。因此, 宿主系統(tǒng)的進一步探索是更有效的開發(fā)宏基因組資源的關(guān)鍵技術(shù)之一。3.4宏基因組文庫篩選由于宏基因組文庫容量較大, 目標克隆子的篩選一直是宏基因組學技術(shù)中的瓶頸。近年來, 各種宏基因組文庫篩選方法相繼建立起來, 根據(jù)篩選原理大體分為兩大類: 序列依賴性篩選法和非序列依賴性篩選法。 1)序列依賴性篩選法, 是根據(jù)文庫中的已知序列或保守序列來設(shè)計雜交探針或 PCR 引物, 從宏基因組文庫中篩選目標序列。該法克服了功能篩選法中必須依賴表達后的活性產(chǎn)物進行檢測, 效率較高。其中已知功能基因 PCR 擴增技術(shù)是最為常用的序列依賴性篩選法。此外, DNA 微陣技術(shù)和整合子系統(tǒng)技術(shù)也可以作為序列依賴性篩選法。例如 Wagner 等應(yīng)用 DNA 微陣列技術(shù)對活性污泥中微生物的群落結(jié)構(gòu)進行了研究, 獲得了大量新的信息, Stokes 等利用整合子系統(tǒng)技術(shù)成功篩選到與 DNA 糖苷酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶和甲基轉(zhuǎn)移酶同源的新基因。但是該篩選法存在 2 個主要的缺陷: (1) 引物的設(shè)計依賴于已有的序列信息, 共同進化的 2 個功能相似的基因難于用“族特異性”引物區(qū)分開來, 因此很難發(fā)現(xiàn)新的功能基因; (2) 通過 PCR擴增功能基因, 一般只能獲得結(jié)構(gòu)基因的一個片段, 而不能獲得完整的功能基因。 2)非序列依賴性篩選法, 其不依賴于任何已知序列信息, 僅根據(jù)文庫克隆子產(chǎn)生的活性物質(zhì)進行篩選。其中以功能篩選法最為常用, 原理是直接對目的克隆表達的性狀在選擇培養(yǎng)基上進行篩選, 已有報道成功篩選出產(chǎn)生木聚糖酶、纖維素酶、脂肪酶及抗菌活性的克隆子。該法篩選能夠發(fā)現(xiàn)全新的活性物質(zhì)或全長基因, 但工作量大、效率低, 生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物僅在少數(shù)情況下具有可見性狀, 酶活性的檢測受到研究方法的限制。此外, 由于受到酶活檢測方法的限制, 大多數(shù)寶貴的酶資源不能通過上述基于活性的方法發(fā)掘出來, 近期基因陷阱技術(shù)篩選法倍受研究學者們的關(guān)注。其中, (1) 利用目的基因缺失的突變體宿主菌株, 轉(zhuǎn)化后在選擇性培養(yǎng)基上進行功能互補的生長特征來篩選。例如 Majernik 等通過缺陷型大腸桿菌為宿主菌構(gòu)建土壤宏基因組文庫, 篩選出了與 Na+/H+反向轉(zhuǎn)運通道相關(guān)新基因; (2) 將宏基因組 DNA 隨機克隆到無啟動子的綠色熒光蛋白基因(GFP)前面, 然后通過熒光激活細胞分離(FACS)技術(shù), 在添加特定底物的條件下對表達庫進行富集, 就能夠選擇出對該底物具有代謝活性的克隆。如 Uchiyama 等利用底物誘導基因表達法從環(huán)境宏基因組文庫中篩選到新的生物代謝相關(guān)基因; Williamson 等利用底物誘導基因表達法從泛洪區(qū)土壤宏基因組文庫中篩選到新的生物小分子物質(zhì)。該法優(yōu)點在于它為高通量篩選提供了保障, 而且不需要對底物進行修飾, 尤其適合于工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用。但也存在一些問題: (1) 無法利用不能進入細胞質(zhì)的底物; (2) 熒光激活細胞分離儀(FACS)對進樣設(shè)備的要求也比較高; (3) 建立高度耐受“超相容性”表達系統(tǒng), 以表達任意來源的編碼蛋白和酶具有一定難度。4 應(yīng)用采用宏基因組技術(shù)及基因組測序等手段，來發(fā)現(xiàn)難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)微生物中的天然產(chǎn)物以及處于沉默狀態(tài)的天然產(chǎn)物。宏基因組不依賴于微生物的分離與培養(yǎng)，因而減少了由此帶來的瓶頸問題。隨著新一代測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，研究宏基因組的方法也已經(jīng)發(fā)生了翻天覆地的變化:傳統(tǒng)的方法是測定微生物基因組上的16S rRNA基因，這些基因的長度通常在1500個堿基左右，廣泛分布于原核生物，既能提供足夠的信息，而且具有相對緩慢的進化過程;其保守性與特異性并存，通過保守區(qū)和特異區(qū)來區(qū)別微生物的種屬?；谶@些特性，科學家們通過選擇這些基因區(qū)域，方便地研究環(huán)境中物種的組成多樣性，但是還不能全面分析環(huán)境中的基因功能。而現(xiàn)在，新一代高通量低成本測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，科學家們可以對環(huán)境中的全基因組進行測序，在獲得海量的數(shù)據(jù)后，全面地分析微生物群落結(jié)構(gòu)以及基因功能組成等。短短幾年來，宏基因組學的研究已經(jīng)滲透到各個領(lǐng)域，從海洋到陸地，再到空氣，從白蟻到小鼠，再到人體，從發(fā)酵工藝到生物能源，再到環(huán)境治理等。4. 1在生態(tài)學方面的應(yīng)用 當今微生物生態(tài)學研究的主要目的之一是將微生物與其所在環(huán)境中的代謝過程相聯(lián)系。在研究的早期 ,科學家利用宏基因組研究探索海洋中未培養(yǎng)的以浮游生物為食的原核微生物,發(fā)現(xiàn)古菌螺旋狀 RNA 和谷氨酸半醛轉(zhuǎn)氨酶，并首次揭示了基因組織形態(tài)，這些信息都顯示了非培養(yǎng)系統(tǒng)的生物潛能。隨著微生物治理的深入發(fā)展，研究者越來越趨向于應(yīng)用菌群對廢水進行生物治理。宏基因組在生態(tài)方面的研究方法主要有宏基因組快照測序法、隨機鳥槍測序法和熒光原位雜交法等。宏基因組在生態(tài)學上的應(yīng)用主要是土壤與水體。目前宏基因組學在土壤微生物研究中的應(yīng)用主要包括兩方面：一是進行土壤微生物及其資源的挖掘，目前的研究工作已經(jīng)得到大批新基因 ,特別是在一些極端環(huán)境中的微生物宏基因組的研究中得到了一些具有特殊應(yīng)用價值的功能酶基因；另一方面是揭示土壤微生物的多樣性及其與環(huán)境之間的關(guān)系。海洋蘊涵著非常豐富的微生物資源，目前已應(yīng)用宏基因組技術(shù)研究了多種海洋次生代謝產(chǎn)物合成途徑，其中最為經(jīng)典的是研究海洋聚酮類和非核糖體肽類的生物合成基因簇。宏基因組技術(shù)在分析環(huán)境微生物復雜群落結(jié)構(gòu)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。如 Martn 等構(gòu)建地中海深層水體微生物宏基因組文庫, 通過序列分析和 16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育比對, 發(fā)現(xiàn)該水體的微生物種群與太平洋阿羅哈水域中層水體的微生物種群具有一定的相似性, 并提出在無光的條件下, 溫度是影響微生物種群在水體中分布的主要因素。Zhang 等構(gòu)建紅樹林淤泥宏基因組文庫, 通過 PCR 擴增及變性梯度凝膠電泳(DGGE) 對該區(qū)域固氮菌的多樣性進行分析, 結(jié)果揭示紅樹林地區(qū)固氮菌的生物多樣性特征, 其結(jié)果表明多數(shù)為變形菌, 也含少數(shù)的固氮菌屬、除硫單胞菌屬、德克斯氏菌屬和根瘤菌等。張薇等采用宏基因組技術(shù)對西北黃土高原檸條種植區(qū)土壤微生物多樣性進行分析, 發(fā)現(xiàn)變形桿菌綱是根表土壤區(qū)系中的有優(yōu)勢微生物菌群(70.3%), 尤其存在大量能夠誘導植物形成根瘤的根瘤菌和對植物有促生長作用的 -Proteobacteria 類微生物, 說明了植物根系和土壤環(huán)境微生物菌群具有相互選擇性; 2008 年肖凱等以宏基因組 DNA 為模板, 采用不同的 PCR 引物對溫泉的高溫水底沉積物微生物多樣性進行分析, 發(fā)現(xiàn)了一株新的菌株 JS-X2 與在美國黃石公園溫泉發(fā)現(xiàn)的未培養(yǎng)細菌有 95%的相似性, 并且與嗜熱藍細菌聚球藻有 89%的相似性。近年來宏基因組技術(shù)在環(huán)境病毒及噬菌體的多樣性分析方面也被廣泛應(yīng)用。例如 Fierer 等通過構(gòu)建牧場、沙漠、雨林土壤宏基因組文庫對環(huán)境中細菌、古生菌、真菌及病毒多樣性進行了研究, 并揭示了土壤環(huán)境中包含著大量不可培養(yǎng)的新病毒種類, 其基因型特征與常規(guī)培養(yǎng)獲得的病毒具有很大的差異性; Kim 等通過構(gòu)建稻田土壤宏基因組文庫, 利用多重置換擴增 (MDA)技術(shù)對土壤樣品中病毒基因多樣性進行了研究, 結(jié)果表明擴增得到的病毒基因序列與目前報道的病毒序列具有很大的差異性, 進一步說明了土壤環(huán)境中包含著大量不可培養(yǎng)的病毒種類; Sabet 等通過構(gòu)建宏基因組文庫對美國莫諾湖水體中噬菌體的多樣性進行了研究, 研究發(fā)現(xiàn)不可培養(yǎng)的噬菌體才是該特殊生境中的優(yōu)勢群體, 揭示了海洋是一個巨大的未知 RNA 病毒庫60; Breitbart 等通過構(gòu)建海水及海底沉積物宏基因組文庫對該地區(qū)不可培養(yǎng)病毒的多樣性進行分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴增得到的病毒基因型中 65%為新的基因型, 其中包含一類海藻病毒, 多數(shù)病毒具有新的基因型, 與節(jié)肢動物和高等植物病毒存在很大的序列差異性61; 2003 年 Breitbart 等首次通過構(gòu)建宏基因組文庫對人體排泄物中的未培養(yǎng)病毒多樣性進行研究, 經(jīng)過擴增及鳥槍測序鑒定, 結(jié)果表明獲得的病毒大約有 1200 種基因型, 其基因序列與先前報道的病毒序列具有很大的差異性, 多為新的基因型病毒, 并揭示存在人體中的新病毒與人類疾病可能具有一定的相互性; 2005年 Cann等通過構(gòu)建宏基因組文庫對馬排泄物中的未培養(yǎng)病毒多樣性進行研究, 經(jīng)過測序鑒定, 獲得 233 種不同基因型的病毒, 其中 52%為長尾噬菌體科, 26%為未分類的噬菌體, 17%為肌病毒科; 4%為短尾病毒科; 2%為脊椎動物正痘病毒?？偟膩碚f, 宏基因組技術(shù)為微生物多樣性研究提供了巨大的平臺。4. 2在新型生物催化劑中的應(yīng)用 宏基因組學技術(shù)最引人注目的貢獻主要集中在新型生物酶制劑的探索和開發(fā)領(lǐng)域。近年來研究者們已成功構(gòu)建了土壤、海底淤泥、溫泉淤泥、油廠污泥、動物瘤胃內(nèi)容物、動物糞便等宏基因組文庫, 并篩選到脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、乙醇氧化酶、木聚糖酶、纖維素酶及脫羧酶等酶制劑, 并且在此基礎(chǔ)上獲得新酶的許多特征信息(表 1)。所采用的載體種類十分廣泛, 包括 Fosmid、Cosmid、BAC、 噬菌體以及各種穿梭載體, 所采用的宿主系統(tǒng)為常用的大腸桿菌、鏈霉菌和假單胞菌等。 通過宏基因文庫篩選得到的生物分子大多數(shù)與已知的基因產(chǎn)物相似性差或者完全是新的分子, 這些新的生物分子主要來源于環(huán)境未培養(yǎng)微生物的基因和其多樣的代謝物。環(huán)境樣品 DNA 的克隆和篩選只是所有環(huán)境遺傳信息多樣性的一小部分, 環(huán)境微生物和宏基因組的多樣性仍舊是發(fā)現(xiàn)新的天然活性產(chǎn)物的豐富廣闊資源, 為研究者們探索開發(fā)新的生物催化劑提供了巨大的資源空間。新型催化劑主要是酶。傳統(tǒng)的新型酶的篩選方法限制了篩選的廣泛性和有效性。宏基因組學則克服了這一限制，有效地提高了新酶的篩選效率，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了抗生素及維生素生物合成相關(guān)基因簇的克隆 ,以及水解酶類和氧化還原酶類編碼的基因。 宏基因組技術(shù)通過對環(huán)境的直接克隆，為研究和利用占微生物 99%以上的非培養(yǎng)微生物提供了新的途徑，為微生物的研究和發(fā)展提供了全新的策略。但此技術(shù)的開發(fā)利用還有許多亟待解決的問題：如上面提及的兩種 DNA的提取方法各有其缺陷，使獲得的 DNA不能完全代表樣品DNA組成，這就需要進一步優(yōu)化樣品 DNA的提取方法。另外，應(yīng)根據(jù)篩選目的選用合適的載體和宿主菌。再者，文庫的篩選方法有待進一步完善，對于序列篩選法來說主要是測序的速度和費用問題，功能篩選法則需克服從幾萬到幾十萬個克隆中只能篩選到幾個有活性的基因的狀況，應(yīng)建立更為敏感的高通量篩選方法。宏基因組學技術(shù)克服了傳統(tǒng)新型酶的篩選方法在篩選的廣泛性和有效性不足這一缺點,在新型生物酶制劑的開發(fā)應(yīng)用上有著長 足的進步。目前已經(jīng)從構(gòu)建的宏基因組文庫(如海底淤泥、溫泉淤泥、動物糞便、動物瘤胃內(nèi)容物等)成功篩選到蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、 木聚糖酶、纖維素酶、水解酶類和氧化還原酶類等酶制劑。4.3 宏基因組學在醫(yī)學上的應(yīng)用 宏基因組技術(shù)的出現(xiàn)為新藥物的探索和發(fā)現(xiàn)提供了可能的技術(shù)支持, 并擴大了微生物代謝產(chǎn)物及分子活性物質(zhì)篩選平臺。例如早在 2000 年, Wang 等構(gòu)建土壤宏基因組文庫 , 通過文庫篩選獲得 TerragineA 及其相關(guān)成分, 目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學治療領(lǐng)域, 證明了自然環(huán)境中的豐富微生物代謝產(chǎn)物可以通過宏基因組技術(shù)為人們所利用; 同年 Brady 等從土壤宏基因組文庫中篩選發(fā)現(xiàn)一種長鏈 N-酰氨基酸抗生素物質(zhì); 并在 2004 年構(gòu)建鳳梨科植物樹莖流出液宏基因組文庫, 篩選鑒定獲得了抗菌物質(zhì) PalmitoylPutrescine。2001 年 Macneil 等構(gòu)建了土壤宏基因組 BAC 文庫, 通過序列分析篩選獲得 5 個能產(chǎn)生抗菌小分子物質(zhì)靛玉紅并對其相關(guān)成分進行研究; 2002 年 Gillespie 等構(gòu)建土壤宏基因組文庫篩選獲得兩種抗菌物質(zhì) Turbomycin A 和 B, 并且發(fā)現(xiàn) Turbomycin A 和 B 對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌具有廣譜抗菌活性; 2003 年 DiazTorres 等通過構(gòu)建人唾液宏基因組文庫, 篩選獲得一種新的四環(huán)素抗性基因 Tet(37), 該活性物質(zhì)對四環(huán)素具有很好的抗性; 2008 年 Mori 等通過活性污泥宏基因組文庫篩選獲得兩種不同的博來霉素抗性基因, 經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)于來源放射菌類基因差異較大, 可能為新的博來霉素抗性基因。國內(nèi)在利用宏基因組技術(shù)獲取新型藥物的研究較少, 尚處于萌芽階段, 趙晶等從南極中山站排污口采集污泥, 構(gòu)建宏基因組文庫, 并通過差異性 DNA 修復實驗 (DDRT)篩選得到具有抗腫瘤效應(yīng)的物質(zhì)。同時利用宏基因組技術(shù)研究探討人類腸道中不可培養(yǎng)微生物多樣性也有了很大進展。如 Kurokawa 等利用宏基因組技術(shù)對 13 個處于不同年齡層的健康人體糞便微生物種群進行了研究，結(jié)果分析表明未斷奶嬰兒的腸道微生物種群在系統(tǒng)發(fā)育和基因組成上具有較大個體差異性，而在成人及已斷奶兒童則呈現(xiàn)出高度的功能一致性，并對成人及嬰兒腸道內(nèi)編碼該生境微生物主要功能的基因家族的特性進行分析，發(fā)現(xiàn)了一個新的人類腸道微生物基因家族和一個共扼轉(zhuǎn)座子。2003 年 Breitbart 等通過構(gòu)建宏基因組文庫對人體排放物中的未培養(yǎng)病毒多樣性進行研究，經(jīng)過鳥槍測序法鑒定, 獲得的病毒大約有 1200 種基因型，結(jié)果比對表明其基因序列與先前報道的病毒具有很大的差異性，大多數(shù)為新病毒, 并證明這些病毒極有可能與人類的疾病有著密切的關(guān)系。2008 年 Finkbeiner 等通過構(gòu)建 12 個腹瀉小孩腸道內(nèi)容物宏基因組文庫，來觀察病人腸道中病毒的生物多樣性，發(fā)現(xiàn)擴增得到的病毒序列與 GenBank 病毒庫中的已知序列同源性很低, 并推斷這些病毒極有可能與人類的腹瀉疾病有著密切的關(guān)系。隨著宏基因組技術(shù)的成熟，必將加快宏基因組技術(shù)在醫(yī)學中的應(yīng)用。在人體微生物抗藥性的研究, 人體與不可培養(yǎng)病原菌的相互關(guān)系的探索等方面將做出重大貢獻。宏基因組技術(shù)突破了大量微生物無法通過純培養(yǎng)方法而進行研究的束縛，為新藥的開發(fā)和利用提供了技術(shù)支持,相信隨著宏基因組技術(shù)的成熟，該技術(shù)在發(fā)現(xiàn)新基因、研究人體微生物抗藥性以及與不可培養(yǎng)病原微生物的相互關(guān)系方面做出重大貢獻。4.4宏基因組學在氣候變化中的應(yīng)用 由人類活動引起的全球氣候變化問題一直備受關(guān)注。其中, 溫室氣體特別是CO2濃度的上升引起的全球變暖問題尤其受到關(guān)注。氣候變暖將對地球碳氮等物質(zhì)循環(huán)、陸地及海洋生態(tài)系統(tǒng)功能等產(chǎn)生重大影響。同時, 地球化學物質(zhì)循環(huán)(如碳、氮、磷、硫等)也是生態(tài)系統(tǒng)響應(yīng)氣候變化的關(guān)鍵過程, 而微生物是該循環(huán)過程的主要驅(qū)動力。近年來, 宏基因組學的運用為微生物對氣候變化響應(yīng)和反饋的研究提供了全新的視角, 并取得了相當大的進展。例如, Danovaro等的研究表明, 海洋中病毒的結(jié)構(gòu)、功能以及病毒與宿主的相互作用都受到全球氣候變化的影響, 并反作用于全球氣候變化和物質(zhì)循環(huán)。另外, Simister等研究了珊瑚礁微生物群落對升溫的響應(yīng), 發(fā)現(xiàn)處于生長狀態(tài)的珊瑚礁上的微生物群落不受溫度升高的影響, 而壞死珊瑚礁上的微生物的群落結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生了改變。上述研究結(jié)果都說明微生物群落的復雜性, 不同的種群有不同的反應(yīng)機制, 因此微生物群落的結(jié)構(gòu)與功能需要進一步深入探討。 Zhou等基于功能基因芯片的長期增溫實驗表明, 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在增溫條件下發(fā)生了顯著改變, 分解易降解碳的基因變得活躍, 而分解難降解碳的基因并沒有顯著改變, 保證了土壤碳存儲的相對穩(wěn)定。通過構(gòu)建微生物的分子生態(tài)學網(wǎng)絡(luò), Deng等發(fā)現(xiàn)不同氣溫條件下, 微生物基因在網(wǎng)絡(luò)中扮演的角色以及相互作用規(guī)律發(fā)生了明顯改變。另外, 功能基因芯片也被用于研究CO2濃度升高的效應(yīng)。CO2濃度升高刺激了調(diào)節(jié)重要物質(zhì)循環(huán)過程基因的活性, 其中碳固定基因、易降解碳基因以及氮循環(huán)基因的數(shù)量明顯增多。另一方面, He(2012)基于系統(tǒng)發(fā)育芯片的實驗發(fā)現(xiàn), CO2濃度升高導致微生物可操作分類單元operational taxonomic unit，OTU)的豐度顯著增加。將上述兩種芯片分別進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建后發(fā)現(xiàn)微生物基因間的相互作用受到CO2濃度的顯著影響, 且不同CO2濃度下發(fā)揮關(guān)鍵作用的特征基因和模塊的核心基因均不同。4.5宏基因組學在水處理工程系統(tǒng)中的應(yīng)用對水處理工程系統(tǒng)的微生物群落組成和功能研究, 尤其是對活性污泥中微生物的研究, 不僅有助于深入了解反應(yīng)器處理污染物的作用機理, 更可以指示反應(yīng)器的性能, 為系統(tǒng)運行提供預警和管理措施。Ye等基于Illumina高通量測序的研究揭示了不同反應(yīng)器中微生物整體新陳代謝路徑相似, 但參與特定糖類代謝和膜運輸?shù)幕蝻@著不同。在不同污水處理反應(yīng)器和不同采樣時間條件下, 微生物的降解基因豐度和多樣性有顯著差異, 這一結(jié)果為監(jiān)測和評估活性污泥降解有機污染物和凈化廢水能力提供了重要依據(jù)。此外, Illumina技術(shù)的應(yīng)用還包括對飲用水氯消毒的微生物研究。研究發(fā)現(xiàn), 微生物群落結(jié)構(gòu)顯著受到氯消毒的影響, 抗性微生物和微生物的抗性基因都得到濃縮, 其中變形菌(Proteobacteria)是優(yōu)勢抗性微生物。Ye和Zhang利用羅氏454測序技術(shù)也有效揭示了活性污泥中微生物的優(yōu)勢種群為研究活性污泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)組成提供了重要信息。4.6宏基因組學在石油污染中的應(yīng)用如果原油或其他石油制品在開采、煉制、貯運和使用過程中進入環(huán)境, 則容易造成環(huán)境污染, 嚴重影響土壤和水的生態(tài)環(huán)境和質(zhì)量, 甚至危害人類健康。目前, 利用微生物降解對石油污染進行生物修復越來越受到關(guān)注, 其主要思路是通過調(diào)控土壤或水體的微生物生態(tài)環(huán)境, 改變微生物群落結(jié)構(gòu), 以提高微生物降解石油的活性和能力。對此學者已開展了對石油污染的土壤或水體中微生物群落特征的研究, 希望能夠找到在降解污染過程中起作用的關(guān)鍵微生物或功能基因。 Kostka等利用高通量測序技術(shù)研究了2