動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)PPT課件

1 動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 2 1 動物細(xì)胞的生長與培養(yǎng) 動物細(xì)胞的特點(diǎn)進(jìn)化程度高結(jié)構(gòu) 形態(tài) 成分復(fù)雜細(xì)胞間連接形式多樣生長相對緩慢功能全面 3 1 1培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特征 Hepatocytes 4 體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型 一 貼附型成纖維細(xì)胞型上皮型細(xì)胞游走細(xì)胞型多形型細(xì)胞 二 懸浮型 三 半貼壁型 5 一 貼附型 大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長 屬于貼壁依賴性細(xì)胞貼附 是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式結(jié)果 基于貼附特性 使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織 有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須貼附于一固相表面才能生存和生長 培養(yǎng)時(shí) 這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后 同樣需要貼附于某一固相表面才能生存和生長 因而屬于貼附型細(xì)胞貼附 錨定或錨著 依賴型 性 細(xì)胞 唯有貼附于固相表面才能生存的細(xì)胞 6 細(xì)胞在體內(nèi) 外的貼附方式 存在差異體內(nèi) 貼附是全方位 外形具有復(fù)雜的立體特征體外 多數(shù)情況 細(xì)胞只有一個(gè)附著平面 外形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同貼附的固相表面 玻璃 聚苯乙烯塑料按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài) 可分為幾大類型 7 1 成纖維細(xì)胞型 8 名稱 凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來源 由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如 真正的成纖維細(xì)胞 心肌 平滑肌 成骨細(xì)胞 血管內(nèi)皮形態(tài) 似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài) 胞體梭形或不規(guī)則三角形 胞質(zhì)向外伸出2 3個(gè)長短不等的突起 中有卵圓形核生長特點(diǎn) 排列成放射狀 漩渦狀 并不緊靠連成片 細(xì)胞 細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動 游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞 常有幾個(gè)伸長的細(xì)胞突起 9 2 上皮型細(xì)胞 10 名稱 僅形態(tài)上似體內(nèi) 實(shí)際上不完全相同來源 來源于外胚層 內(nèi)胚層細(xì)胞 如 皮膚及其衍生物 消化道 乳腺 肺泡 上皮性腫瘤形態(tài) 類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞 扁平 不規(guī)則多角形 中有圓形核生長特點(diǎn) 易相連成片 相靠 緊密相連 成薄層 鋪石狀生長時(shí)呈膜狀移動 很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動 11 3 游走細(xì)胞型 呈散在生長 一般不連成片 胞質(zhì)常突起 呈活躍游走或變形運(yùn)動 方向不規(guī)則 此型細(xì)胞不穩(wěn)定 有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別 4 多型細(xì)胞型 有一些細(xì)胞 如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài) 可統(tǒng)歸于此類 12 二 懸浮型 見于少數(shù)特殊的細(xì)胞 如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞 胞體圓形 不貼于支持物上 呈懸浮生長 這類細(xì)胞容易大量繁殖 概念 培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長來源 自血 脾或骨髓 血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞特點(diǎn) 在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形 單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點(diǎn) 生存空間大 提供數(shù)量大 傳代方便 不需消化 易于收獲 可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn) 純化不方便 不能通過離心將死 活細(xì)胞分離 13 14 無菌無毒害的環(huán)境 1 支持生長增殖的營養(yǎng) 2 其它類似體內(nèi)的環(huán)境 3 維持細(xì)胞性狀 4 1 2細(xì)胞培養(yǎng)總原則 15 一 細(xì)胞培養(yǎng)無菌無毒環(huán)境 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)合理常用設(shè)施及設(shè)備培養(yǎng)器皿 透明度好 無毒 利于細(xì)胞貼附和生長的材料 常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品 16 17 細(xì)胞培養(yǎng)無菌操作基本技術(shù) 工作環(huán)境及表面的處理細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理培養(yǎng)液與培養(yǎng)細(xì)胞的處理 18 二 細(xì)胞的營養(yǎng) 培養(yǎng)基 合適的細(xì)胞培養(yǎng)基是體外細(xì)胞生長增殖的最重要的條件之一 培養(yǎng)基不僅提供細(xì)胞營養(yǎng)和促使細(xì)胞生長增殖的基礎(chǔ)物質(zhì) 而且還提供培養(yǎng)細(xì)胞生長和繁殖的生存環(huán)境 血清 血清是細(xì)胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一 含有細(xì)胞生長所需的多種生長因子及其它營養(yǎng)成分 其它成分 條件培養(yǎng)基 19 合成培養(yǎng)基的主要成分 氨基酸碳水化合物無機(jī)鹽維生素其它輔助物質(zhì) 培養(yǎng)基種類 RPMI 1640 標(biāo)準(zhǔn)型 DMEM 高糖 標(biāo)準(zhǔn)型 DMEM 低糖 標(biāo)準(zhǔn)型 McCoys5AM199F12 20 血清 牛血清 馬血清 人血清 1 儲存于 20 70 低溫冰箱中 2 一般廠商提供的血清為無菌 3 熱滅活是指56 30分鐘加熱已完全解凍的血清 目的是使血清中的補(bǔ)體成分 complement 滅活 4 血清中的沉淀物絮狀物 可用離心3000rpm 5分鐘去除 也可不用處理 21 其它常用液體試劑 Hank sD Hank sPBSNaHCO3 7 5 胰酶溶液 0 25 22 三 其它類似體內(nèi)的環(huán)境 溫度氣體滲透壓氫離子濃度 PH 其他 23 四 合理的計(jì)劃 維持細(xì)胞性狀 盡早凍存原代細(xì)胞 復(fù)蘇后狀態(tài)恢復(fù)的細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定存在的細(xì)胞需要做實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞要選對數(shù)生長期防止細(xì)胞污染 如遇污染 及時(shí)處理 24 一 細(xì)菌污染細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染 即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素 一般為預(yù)防劑量 也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴?最常見的有革蘭氏陽性菌 培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后 會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁 pH改變 也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變 只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染 所以 每天應(yīng)仔細(xì)觀察 污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變 胞內(nèi)顆粒增多 增粗 最后變圓脫落死亡 造成試驗(yàn)失敗和細(xì)胞株 系 丟失 25 二 真菌污染真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中最常見的一種 尤其在霉雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染 最常見的真菌有煙曲霉 黑曲菌 孔子霉 毛霉菌 白色念珠菌和酵母菌 培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后 可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn) 有的散在生長 培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁 倒置顯微鏡下可見絲狀 管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中 有的呈鏈狀排列 念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間 個(gè)體細(xì)小 有增多趨勢 鏡下看時(shí) 要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈 以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆 真菌污染后 細(xì)胞生長變慢 但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡 26 三 支原體污染支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物 最小直徑0 2 m 一般過濾除菌無法去除它 光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu) 開始不易發(fā)現(xiàn) 能在偏堿條件 pH7 6 8 0 下生存 對青霉素有抗藥性 多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間 電鏡下可見其有三層結(jié)構(gòu) 無細(xì)胞壁 中央有電子密度大的密集顆?；蚪z狀的中心囊 培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后 部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長增殖變慢 部分細(xì)胞變圓 從瓶壁脫落 但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化 或略有變化 若不及時(shí)處理 還會產(chǎn)生交叉污染 27 四 病毒污染采用組織細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗 如果沒有除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物 會產(chǎn)生病毒污染 目前 從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒 盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng) 但生產(chǎn)疫苗是不安全的 若二倍體細(xì)胞系有SV40或多發(fā)瘤病毒 B淋巴細(xì)胞含EB病毒 細(xì)胞會發(fā)生變異 轉(zhuǎn)化 形成異倍體的細(xì)胞系 28 五 非同種細(xì)胞污染由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開 操作不當(dāng) 往往會使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染 如 靈長類 細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類細(xì)胞的混合物 ERK KD細(xì)胞是從兔腎中分離出來的 而現(xiàn)在卻認(rèn)為是HeLa細(xì)胞 非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生 大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致 29 常用的排除微生物污染的方法 抗生素排除法 采用5 10倍于常用量的沖擊法 加入高濃度抗生素后作用24 48h 再換入常規(guī)培養(yǎng)物 有時(shí)可能奏效 加溫除菌 根據(jù)支原體不耐熱的特點(diǎn) 可將受支原體污染的細(xì)胞至于41攝氏度作用5 10h 最長可達(dá)18h 以殺滅支原體 動物體內(nèi)接種 受污染的腫瘤細(xì)胞可接種在同種動物皮下或腹腔內(nèi) 利用動物的免疫功能消滅污染的微生物 而腫瘤細(xì)胞卻能在動物體內(nèi)繼續(xù)生長 待一定時(shí)間后從體內(nèi)取出腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng) 巨噬細(xì)胞在體外可存活7 10天 并保持吞噬 消化微生物的能力 利用這一特點(diǎn) 可將少量的污染細(xì)胞與足夠量的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng) 從而消除污染 30 1 3培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程 幼齡動物 取動物器官和組織 剪碎組織 胰蛋白酶處理 細(xì)胞培養(yǎng) 單個(gè)細(xì)胞 31 如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng) 遺傳物質(zhì)改變 遺傳物質(zhì)未改變 32 原代培養(yǎng) 從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞 培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞培養(yǎng) 傳代培養(yǎng) 將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出 配制成細(xì)胞懸浮液 分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng) 稱為傳代培養(yǎng) 有關(guān)概念 33 細(xì)胞的原代培養(yǎng) 將動物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出 經(jīng)各種酶 常用胰蛋白酶 螯合劑 常用EDTA 或機(jī)械方法處理 分散成單細(xì)胞 置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 使細(xì)胞得以生存 生長和繁殖 這一過程稱原代培養(yǎng) 34 組織塊直接培養(yǎng)法 機(jī)械法 1 取材 將小鼠拉頸椎致死 置75 酒精泡2 3秒鐘 時(shí)間不能過長 以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi) 再用碘酒消毒腹部 將鼠帶入超凈臺內(nèi)解剖取肝臟 置平皿中 2 用Hank s液洗滌三次 并剔除脂肪 結(jié)締組織 血液等雜物 3 用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊 1 2mm 再用Hank s液洗三次 轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中4 將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶 貼附與瓶底面5 翻轉(zhuǎn)瓶底朝上 將培養(yǎng)液加至瓶中 培養(yǎng)液勿接觸組織塊 入37 靜置3 5小時(shí) 輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶 使組織浸入培養(yǎng)液中 勿使組織漂起 37 繼續(xù)培養(yǎng) 35 胰酶消化法 1 取材 將小鼠拉頸椎致死 置75 酒精泡2 3秒鐘 時(shí)間不能過長 以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi) 再用碘酒消毒腹部 將鼠帶入超凈臺內(nèi)解剖取肝臟 置平皿中 2 用Hank s液洗滌三次 并剔除脂肪 結(jié)締組織 血液等雜物 3 用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊 1mm2 再用Hank s液洗三次 轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中 4 視組織塊量加入5 6倍的0 25 胰酶液 37 中消化20 40分鐘 每隔5分鐘振蕩一次 5 加入2ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用 或加入胰酶抑制劑 用吸管吹打 沖散細(xì)胞 6 靜置 使未分散的組織塊下沉 7 吸取上層細(xì)胞懸液 轉(zhuǎn)移到兩個(gè)培養(yǎng)皿中 補(bǔ)加適量培養(yǎng)液 37 下培養(yǎng) 36 一 培養(yǎng)細(xì)胞生命期在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時(shí)間 37 1 原代培養(yǎng)期 從體內(nèi)取出組織 接種培養(yǎng)到第一次傳代階段 初代培養(yǎng) 特點(diǎn) 1一4周 細(xì)胞呈活躍的移動 可見細(xì)胞分裂 形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上與體內(nèi)原組織相似性 多呈二倍體核型細(xì)胞群是異質(zhì)的 細(xì)胞克隆形成率很低 即細(xì)胞獨(dú)立生存性差 38 2 傳代期 初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系 在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長 在培養(yǎng)條件較好情況下 細(xì)胞增殖旺盛 并能維持二倍體核型 呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系 為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì) 細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存 一般情況下當(dāng)傳代10 50次左右 細(xì)胞增殖逐漸緩慢 以至完全停止 細(xì)胞進(jìn)入第三期 39 3 衰退期 此期細(xì)胞仍然生存 但增殖很慢或不增殖 細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng) 最后衰退凋亡 在細(xì)胞生命期階段 少數(shù)情況下 在以上三期任何一點(diǎn) 由于某種因素的影響 細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性或惡性性 40 細(xì)胞永生性也稱不死性 即細(xì)胞獲持久性增殖能力 這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系 也稱連續(xù)細(xì)胞系 無限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末 或第三期初階段 細(xì)胞獲不死性后 核型大多變成異倍體 細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā) 轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì) 細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀 41 二 組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期 所謂細(xì)胞 一代 一詞 系指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間 這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法 它與細(xì)胞倍增一代非同一含義 如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞 即指該細(xì)胞系已傳代153次 它與細(xì)胞世代或倍增不同 在細(xì)胞一代中 細(xì)胞能倍增3 6次 細(xì)胞傳一代后 一般要經(jīng)過以下三個(gè)階段 潛伏期指數(shù)生長期停滯期 42 1 潛伏期 43 過程 游離 懸浮 胞質(zhì)回縮 全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形吸附 貼附底物 一般24小時(shí)內(nèi)貼壁潛伏期 可有運(yùn)動活動 基本無增殖 少見分裂相 44 影響因素 潛伏期的長短與 細(xì)胞種類接種的細(xì)胞密度培養(yǎng)條件 45 1 細(xì)胞類型傳代培養(yǎng)的細(xì)胞之潛伏期比原代培養(yǎng)的細(xì)胞短 傳代培養(yǎng)期的細(xì)胞6 24h 原代24 96h或更長單個(gè)細(xì)胞快 細(xì)胞大團(tuán)慢 組織塊慢連續(xù)細(xì)胞系與發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞 6 24h 比有限細(xì)胞系與正常二倍體細(xì)胞的短來源 胚胎組織 短 2天可見細(xì)胞生長 成體 長 46 2 細(xì)胞密度密度越大 數(shù)量越多 細(xì)胞群體越容易適應(yīng)體外環(huán)境 潛伏期就短 相反 即便是在很小的培養(yǎng)空間內(nèi) 如接種的細(xì)胞數(shù)量不夠大 潛伏期仍會較長3 培養(yǎng)條件培養(yǎng)液 pH底物 污染 有毒 47 2 指數(shù)增生期 這是細(xì)胞增值最旺盛的階段 細(xì)胞分裂相增多 指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志 一般以細(xì)胞分裂指數(shù)表示 即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù) 一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0 1 0 5 初代細(xì)胞分裂指數(shù)低 連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3 5 48 特點(diǎn) 是細(xì)胞增生最活躍 活力最旺盛的階段培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長 細(xì)胞群體均一是理想的實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞 接觸抑制密度抑制 49 3 停滯期 細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后 細(xì)胞遂停止增殖 進(jìn)入停滯期 此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加 故也稱平臺期 Plateau 停滯期細(xì)胞雖不增殖 但仍有代謝活動 繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡 代謝產(chǎn)物積累 pH降低 此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代 否則細(xì)胞會中毒 發(fā)生形態(tài)改變 重則從底物脫落死亡 50 特點(diǎn) 1 細(xì)胞數(shù)量 細(xì)胞達(dá)飽和密度 出現(xiàn)密度抑制 2 細(xì)胞活動小 3 生長組分下降 4 及時(shí)傳代 細(xì)胞已中毒 即使傳代 也會影響下一代細(xì)胞的功能狀況 51 潛伏期 指數(shù)生長期 停滯期 52 細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測定 培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好 所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù) 結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示 在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞 總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力 由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力 以了解分離的過程對細(xì)胞是否有損傷作用 復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力 了解凍存和復(fù)蘇的效果 53 細(xì)胞計(jì)數(shù)原理 54 細(xì)胞計(jì)數(shù)操作步驟 1 將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦試干凈 并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上 2 將細(xì)胞懸液吸出少許 滴加在蓋片邊緣 使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間 3 靜置3分鐘 4 鏡下觀察 計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù) 壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的 然后按下式計(jì)算 細(xì)胞數(shù) ml 4大格細(xì)胞總數(shù) 4 10000注意 鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán) 應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算 若細(xì)胞團(tuán)占10 以上 說明分散不好 需重新制備細(xì)胞懸液 55 請計(jì)算一下 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)需要效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例為20 1且靶細(xì)胞需要1x104 TEST 現(xiàn)有效應(yīng)細(xì)胞10ml 取100ul效應(yīng)細(xì)胞加入900ulPBS中 混勻后記數(shù) 細(xì)胞濃度為2x104 ml 靶細(xì)胞也有10ml 經(jīng)記數(shù) 細(xì)胞濃度為1x105 ml 效應(yīng)細(xì)胞共有多少 靶細(xì)胞共有多少 以現(xiàn)有的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn) 能做幾個(gè)TEST 56 細(xì)胞活力測定步驟 1 將細(xì)胞懸液以0 5ml加入試管中 2 加入0 5ml0 4 臺盼蘭染液 染色2一3分鐘 3 吸取少許懸液涂于載玻片上 加上蓋片 4 鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù) 計(jì)細(xì)胞活力 死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色 鏡下可見深蘭色的細(xì)胞 活細(xì)胞不被染色 鏡下呈無色透明狀 活力測定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來進(jìn)行 但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用 57 哺乳動物細(xì)胞冷凍保存 主要目的 1 保存種子細(xì)胞 以便隨時(shí)取用 2 降低人力和物力 3 減少細(xì)胞被微生物污染的危險(xiǎn)性 4 避免有限細(xì)胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)變 5 減少細(xì)胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變 58 冷凍保存要點(diǎn) 1 冷凍過程要緩慢 有條件的地方 可用程控降溫儀 按每分鐘 1到 3 速度降溫 一直到 80 以下 然后直接放入液氮中長期保存 2 凍存細(xì)胞必須處在對數(shù)生長期 活力大于90 無微生物污染 3 細(xì)胞濃度控制在 1 106 1 107 ml 4 使用高濃度血清 30 5 使用合適的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑 DMSO 甘油 細(xì)胞冷凍保存液主要成分 冷凍保護(hù)劑 5 10 培養(yǎng)基 60 血清 30 59 細(xì)胞凍存實(shí)用程序 收集細(xì)胞凍存液重懸分裝入凍存管106 107 mL4 40min 20 30 60min 30 30min 80 過夜液氮罐保存并記錄 60 冷凍保存細(xì)胞的解凍與復(fù)蘇 1 快速解凍 2 解凍操作過程動作要輕特別注意 解凍時(shí)務(wù)必注意安全 預(yù)防冷凍管爆裂 要帶手套 用鑷子將細(xì)胞冷凍管從液氮中取出 放入37 水浴中 切不可直接用手 以免凍傷冷凍管在水浴中解凍時(shí) 液面不可超過凍存管蓋面 否則 易發(fā)生污染 61 解凍冷凍保存細(xì)胞的離心方法 從液氮中取出凍存的細(xì)胞 立即放入37 水浴中快速解凍 將1 2ml凍存細(xì)胞液加入到25ml新鮮完全細(xì)胞生長培養(yǎng)液中 輕輕混勻 用80g離心2 3分鐘 800 1000rpm5min 棄上清液 用完全生長培養(yǎng)液輕輕懸浮細(xì)胞團(tuán) 并計(jì)數(shù)細(xì)胞 接種細(xì)胞到培養(yǎng)瓶中 起始密度不低于3 105 ml 24 48h后換液 62 1 4體外培養(yǎng)細(xì)胞的種類 細(xì)胞系細(xì)胞株二倍體細(xì)胞遺傳缺陷細(xì)胞腫瘤細(xì)胞 63 一 細(xì)胞系初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞 即稱之為細(xì)胞系 如細(xì)胞系的生存期有限 則稱之為有限細(xì)胞系已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系 稱連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系 64 二 細(xì)胞株從一個(gè)經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法 由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群 稱細(xì)胞株 再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群 亦可稱之為亞株 65 三 二倍體細(xì)胞細(xì)胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細(xì)胞染色體數(shù)相同或基本相同 2n細(xì)胞占75 或80 以上 的細(xì)胞群 稱二倍體細(xì)胞 如僅數(shù)目相同 而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為假二倍體 為保持二倍體細(xì)胞能長期被利用 一般在初代或2 5代即大量凍存作為原種 66 四 遺傳缺陷細(xì)胞從有先天遺傳缺陷者取材 主要為成纖維細(xì)胞 培養(yǎng)的細(xì)胞 或用人工方法誘發(fā)突變的細(xì)胞 都屬遺傳缺欠細(xì)胞 這類細(xì)胞可能具有二倍體核型 也可呈異倍體 67 五 腫瘤細(xì)胞系或株這是現(xiàn)有細(xì)胞系中最多的一類 我國已建細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成 多呈類上皮型細(xì)胞 常已傳幾十代或百代以上 并具有不死性和異體接種致瘤性 68 細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名 HeLa 為供體患者的姓名 來源于宮頸癌 CHO 中國地鼠卵巢細(xì)胞 ChineseHamsterOvary 宮 743 宮頸癌上皮細(xì)胞 1974年3月建立NIH3T3 美國國立衛(wèi)生研究院 NationalInstituteofHealth 建立 每3天傳代 每次接種3 105細(xì)胞 毫升 69 細(xì)胞系或株的鑒定 管理和使用 ATCC入庫細(xì)胞要求檢測項(xiàng)目如下 http www atcc org培養(yǎng)簡歷 組織來源日期 物種 組織起源 性別 年齡 供體正常或異常健康狀態(tài) 細(xì)胞已傳代數(shù)等凍存液 培養(yǎng)基和防凍液名稱細(xì)胞活力 融解前后細(xì)胞接種存活率和生長特性培養(yǎng)液 培養(yǎng)基種類和名稱 一般要求不含抗生素 血清來源和含量 70 細(xì)胞形態(tài) 類型 如為上皮或成纖維細(xì)胞等 融解后細(xì)胞生長特性核型 二倍體或多倍體 標(biāo)記染色體的有無無污染檢測 包括細(xì)菌 真菌 支原體 原蟲和病毒等物種檢測 檢測同工酶 以證明細(xì)胞有否交叉污染以及反轉(zhuǎn)錄酶檢測免疫檢測 一兩種血清學(xué)檢測細(xì)胞建立者 建立者姓名 檢測者姓名 71 72 73 74 75 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡 是能量依賴的細(xì)胞內(nèi)死亡程序活化而致的細(xì)胞自殺 由基因控制的細(xì)胞自主有序的主動死亡過程 細(xì)胞程序性死亡 programmedcelldeath PCD 指生理性細(xì)胞死亡 描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個(gè)體發(fā)育中的一個(gè)預(yù)定的 并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分 76 細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別 壞死凋亡 1 性質(zhì)病理性 非特異性 非遺傳性生理性或病理性 特異性遺傳性2 誘導(dǎo)因素強(qiáng)烈刺激 極端環(huán)境 隨機(jī)發(fā)生較弱刺激 非隨機(jī)發(fā)生3 生化特點(diǎn)被動過程 無新蛋白合成 主動過程 有新蛋白合成 不耗能耗能4 形態(tài)變化細(xì)胞結(jié)構(gòu)全面溶解 破壞 胞膜及細(xì)胞器相對完整細(xì)胞腫脹細(xì)胞皺縮 核固縮5 DNA電泳彌散性降解 電泳呈均一DNA片段化 180 200bp DNA片狀電泳呈 梯 狀條帶6 炎癥反應(yīng)溶酶體破裂 局部炎癥反應(yīng)溶酶體相對完整 局部無炎癥反應(yīng)7 凋亡小體無有8 基因調(diào)控?zé)o有 77 78 常用細(xì)胞凋亡檢測方法 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測磷脂酰絲氨酸外翻分析 AnnexinV法 線粒體膜勢能的檢測DNA片斷化檢測TUNEL法Caspase 3活性的檢測凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析 79 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測 80 磷脂酰絲氨酸外翻分析 AnnexinV法 磷脂酰絲氨酸 Phosphatidylserine PS 正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè) 但在細(xì)胞凋亡的早期 PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面 暴露在細(xì)胞外環(huán)境中 Annexin V是一種分子量為35 36KD的Ca2 依賴性磷脂結(jié)合蛋白 能與PS高親和力特異性結(jié)合 碘化丙啶 propidineiodide PI 是一種核酸染料 它不能透過完整的細(xì)胞膜 但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞 PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染 因此將Annexin V與PI匹配使用 就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來 81 AnnexinV FITCFluorescence PIFluorescence TimecourseofapoptosisinTF 1cellsculturedinGM CSF freemedium 82 83 線粒體膜勢能的檢測 線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著樞紐作用 多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細(xì)胞發(fā)生凋亡 而線粒體跨膜電位的下降 被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件 它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征 染色質(zhì)濃縮 DNA斷裂 出現(xiàn)之前 一旦線粒體跨膜電位崩潰 則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn) 線粒體跨膜電位的存在 使一些親脂性陽離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì) 其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低 84 DNA片斷化檢測 細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂 形成50 300kbp長的DNA大片段 或180 200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜 DNAladder 85 TUNEL法 細(xì)胞凋亡中 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3 OH末端 可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶 TdT 的作用下 將脫氧核糖核苷酸和熒光素 過氧化物酶 堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3 末端 從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測 這類方法稱為脫氧核