MTT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中藥物濃度篩選詳解.doc

（一）實(shí)驗(yàn)前應(yīng)明確的問(wèn)題1. 選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)約有105個(gè)細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長(zhǎng)曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過(guò)滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。2. 藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個(gè)比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時(shí)間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時(shí)間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時(shí)間。3. 時(shí)間點(diǎn)的設(shè)定。在不同時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定OD值，輸入excel表，最后得到不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫(huà)出變化的曲線，曲線什么時(shí)候變得平坦了（到了平臺(tái)期）那個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該就是最好的時(shí)間點(diǎn)（因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）。4. 培養(yǎng)時(shí)間。200ul的培養(yǎng)液對(duì)于10的45次方的增殖期細(xì)胞來(lái)說(shuō)，很難維持68h，如果營(yíng)養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會(huì)由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48h換液的。5. MTT法只能測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。做MTT時(shí)，盡量無(wú)菌操作，因?yàn)榧?xì)菌也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的升高。6. 理論未必都是對(duì)的。要根據(jù)自己的實(shí)際情況調(diào)整。7. 實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對(duì)照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對(duì)照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對(duì)照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。8. 避免血清干擾。用含15胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，高的血清物質(zhì)會(huì)影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會(huì)試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于10胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。（二）實(shí)驗(yàn)步驟貼壁細(xì)胞：1. 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無(wú)菌PBS填充）。2. 5%CO2，37孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況.3. 5%CO2，37孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。4. 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5. 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6. 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。7. 同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）懸浮細(xì)胞：1）收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1106/ml，按次序?qū)⒀a(bǔ)足的1640（無(wú)血清）培養(yǎng)基40ul；加ActinomycinD（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋l?g/ml，需預(yù)試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；需檢測(cè)物10ul；細(xì)胞懸液50ul（即5104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無(wú)菌水填充）。每板設(shè)對(duì)照（加100?(儲(chǔ)存液1001640）。2）置37，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。3）每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4h后可跳過(guò)步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值）4）離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值。5）同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。（三）MTT的配制MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過(guò)濾后4避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒(méi)必要一下子配那么多,尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對(duì)不能再用了。MTT有致癌性，用的時(shí)候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無(wú)菌，MTT對(duì)菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒(méi)有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉。配制MTT時(shí)用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60水浴助溶。PBS配方:Nacl8g，Kcl0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，調(diào)ph7.4，定容1L。（四）關(guān)于細(xì)胞的接種(鋪板)細(xì)胞過(guò)了30代以后就不要用了,因?yàn)闋顟B(tài)不好了;培養(yǎng)板要用好的（最好進(jìn)口板），不好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)實(shí)驗(yàn)。接種時(shí)最好按照預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出的密度接種,因?yàn)榧?xì)胞密度在10000/ml左右時(shí)，所測(cè)得的OD值的區(qū)間即細(xì)胞抑制率（或者增值率）的所呈現(xiàn)的線性關(guān)系最好，結(jié)果最可信。如果鋪的太稀細(xì)胞的殺傷不會(huì)很明顯，太密細(xì)胞可能都會(huì)凋亡，因?yàn)榧?xì)胞長(zhǎng)的太快營(yíng)養(yǎng)會(huì)不夠，最后導(dǎo)致死亡。且而細(xì)胞過(guò)密或者過(guò)少，增殖都會(huì)過(guò)快或者過(guò)慢，其增值率線性關(guān)系不佳。故而MTT細(xì)胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。細(xì)胞密度要根據(jù)不同細(xì)胞的特點(diǎn)來(lái)定.如果你做的藥品對(duì)細(xì)胞具有刺激作用那么取小點(diǎn)的細(xì)胞濃度，如果你做的藥品對(duì)細(xì)胞具有抑制作用那么取大點(diǎn)的細(xì)胞濃度，這樣與對(duì)照的區(qū)別更明顯，數(shù)據(jù)更好。懸浮細(xì)胞每孔的細(xì)胞數(shù)可達(dá)到105,貼壁細(xì)胞可為103-104.（五）加入MTT個(gè)人認(rèn)為MTT最關(guān)鍵的是你的細(xì)胞數(shù)目和你加入真正起作用的的MTT的適當(dāng)比例，具體細(xì)胞數(shù)目和真正起作用的的MTT之間的關(guān)系確實(shí)不好確定，我認(rèn)為MTT多加一些比少加好一些MTT的量各家報(bào)道不同，一般是過(guò)量的，所以10ul即夠了。如果不使用96孔板，培養(yǎng)基超過(guò)100ul，MTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振蕩一下讓MTT與培養(yǎng)基混勻，不過(guò)這個(gè)應(yīng)該關(guān)系不大。如加入MTT后都有個(gè)別孔立即變?yōu)樗{(lán)黑色，則污染的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細(xì)胞前還是需要以過(guò)濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前可以先在鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的。因?yàn)檠逯邪椎鞍讓?duì)大部分的藥物都有結(jié)合效應(yīng)，所以可以單獨(dú)將藥物和MTT加在一起，看會(huì)不會(huì)起反應(yīng)。如果不起反應(yīng)，就不用去除含藥物的培液，直接加MTT即可。首先說(shuō)說(shuō)我的一點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)：1. 吹打時(shí)懸液總量不能太多，達(dá)到吸管吸液量的3到4倍，可能比較容易混勻。10ml的離心管里面最好裝34ml的懸液：懸液太少容易吹起很多氣泡，懸液太多又不容易吹成單細(xì)胞懸液。2. 吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量過(guò)多的話，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過(guò)少，吹打的力度就不夠，吹打就會(huì)不均勻。如果是吸液量1ml多的吸管，總液量在5ml左右為益3. 吸的時(shí)候要在懸液底部，然后提起來(lái)一點(diǎn)，但是吹下去的時(shí)候不要離開(kāi)液面，否則容易吹打出氣泡。4. 吹打次數(shù)100左右，就可以吹打均勻了（有人認(rèn)為加細(xì)胞前吹打3050次基本就差不多均勻了。加細(xì)胞的時(shí)候每接種2孔反復(fù)吹打3次，每吹打3次后槍頭垂懸與細(xì)胞懸液中5秒鐘，然后再以一定的速度吸取懸液。）5. 向每孔中用槍頭加入細(xì)胞時(shí)不要太快，否則你會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在加入的瞬間會(huì)由于槍頭的沖力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周邊很少，這種不均勻的分散會(huì)產(chǎn)生接觸抑制，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。所以速度不能太快也不能太慢。我習(xí)慣每塊板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回復(fù)3下移動(dòng)，目的是使得細(xì)胞能分散的均勻些。（鋪板技術(shù)是MTT實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，也是基礎(chǔ)，一定要練好。曾經(jīng)有同學(xué)用漩渦振蕩器混勻細(xì)胞，最后細(xì)胞全死了，建議不要采用這種方法混勻細(xì)胞。其它的聲音：1. 首先細(xì)胞的接種密度一定不能過(guò)大，一般每孔1000個(gè)左右就夠了，我認(rèn)為寧少勿多。尤其是對(duì)于腫瘤細(xì)胞。10000/孔是太高了，這樣即使藥物有作用，MTT方法也是表現(xiàn)不出的，最佳點(diǎn)板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會(huì)很大。2. MTT本身就是比較粗的實(shí)驗(yàn)，增殖率10%左右的波動(dòng)都不算奇怪。特別是新手，20的波動(dòng)也是常見(jiàn)的，所以很可能是技術(shù)原因引起的，特別是種板技術(shù)一定要過(guò)關(guān)。3. 我做的是腫瘤細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn),這種細(xì)胞長(zhǎng)的很快一開(kāi)始我是用100000/ML的濃度來(lái)接種的,結(jié)果細(xì)胞長(zhǎng)的太滿結(jié)果是沒(méi)有梯度也沒(méi)有線性關(guān)系.后來(lái)調(diào)整濃度,用過(guò)4000080000/ML的濃度都做過(guò)MTT實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)做的結(jié)果比較好點(diǎn)的是6000070000/ML的濃度組的.用40000/M的濃度的組,由于細(xì)胞少,藥物作用的梯度還