Western+實(shí)驗(yàn)操作程序.doc

Western blot 實(shí)驗(yàn)操作程序一、儲(chǔ)存液的配制：1. )1.5M Tris-HCl（PH8.8）：100mlTris 18.15g去離子水 50 ml緩慢加濃鹽酸調(diào)PH至8.8（約4 ml），冷卻至室溫后再加去離子水至100 ml.2.) 0.5M Tris-HCl（PH6.8）：100ml Tris 6.05g去離子水 50 ml緩慢加濃鹽酸調(diào)PH至6.8（約8ml），冷卻至室溫后再加去離子水至100 ml.3. )10%SDS（W/V）：100mlSDS 10g去離子水 100 ml溶解后，室溫下保存。4.)50%（v/v）甘油：100ml100%甘油 50 ml去離子水 50 ml 混勻后，室溫下保存。5. )1%溴酚藍(lán)：10 ml溴酚藍(lán) 100mg去離子水 10ml攪拌至完全溶解，經(jīng)過(guò)濾后使用6. )麗春紅S(Ponceau S)儲(chǔ)存液：100 ml麗春紅S 2g三氯乙酸 30g磺基水楊酸 30g去離子水 100ml混勻后，室溫下保存。7. )10轉(zhuǎn)膜液：1000 ml甘氨酸 90gTris 19.3g加去離子水至1000 ml，PH在8.3-8.4左右.二、工作液的配制：1. 組織（或細(xì)胞）裂解液：3 ml 或 5 ml 試劑初始濃度終濃度3 ml5 mlNaCl 1 mol/L0.1 mol/L300l500lTris-HCl1mol/L0.01mol/L 30l50lEDTA0.5mol/L0.001mol/L 6l 10lAprotinin1mg/ml 0.001mg/ml3l 5lPMSF 10mg/ml0.01mg/ml30l50lTritonX-100 3%1%1 ml1.6ml去離子水1.64ml2.8mlPMSF（苯甲基磺酰氟）：可抑制蛋白酶的降解作用，有較強(qiáng)的毒性，可嚴(yán)重?fù)p害呼吸道黏膜、眼睛及皮膚，使用時(shí)需戴手套操作。它在水溶液中不穩(wěn)定，使用時(shí)需新鮮配制（可先配成10 mg/ml的儲(chǔ)存液，需用異丙醇溶解）。Aprotinin（抑肽酶）：可抑制組織裂解后釋放出的蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解作用。2. 5變性loading:10 ml1M Tris-HCl（PH6.8）0.6 ml60mM50%甘油5ml25%10%SDS2ml2%1%溴酚藍(lán)1 ml0.1%去離子水0.9ml混勻，在4oC下可保存數(shù)月。3. 丙烯酰胺儲(chǔ)存液（30%）：100 ml 丙烯酰胺 29 g 雙丙烯酰胺 1g去離子水 100 ml丙烯酰胺和雙丙烯酰胺單體均具有強(qiáng)神經(jīng)毒性，其作用具有累加性，配制時(shí)必須戴手套，防止皮膚接觸。攪拌至完全溶解，在4oC下可保存數(shù)月。4. 4分離膠緩沖液：100 ml2M Tris-HCl（PH6.8） 75 ml 1.5M10%SDS 4ml 0.4%去離子水 21ml 混勻后可在4oC下保存數(shù)月，配分離膠時(shí)使用，注意用時(shí)不需再稀釋,直接用4的緩沖液即可5. 4堆積膠緩沖液: 100 ml1M Tris-HCl（PH6.8） 50 ml 0.5M10%SDS 4ml 0.4%去離子水 46ml 混勻后可在40C保存數(shù)月，配堆積膠時(shí)使用，注意用時(shí)不需再稀釋,直接用4的緩沖液即可6. 10%過(guò)硫酸胺(APS)：5 ml過(guò)硫酸胺 0.5g去離子水 5ml分裝后，保存于-200C7. 電泳緩沖液:1000 mlTris 3g 25 mM甘氨酸 14.4g 192 mMSDS 1g 0.1%加去離子水至1000 ml，PH在8.3左右。8. 考馬斯亮藍(lán)染色液: 1000 ml考馬斯亮藍(lán)R-250 1.0g甲醇 450 ml冰醋酸 100 ml去離子水 450 ml需過(guò)濾后使用，可用來(lái)染蛋白質(zhì).9. 考馬斯亮藍(lán)凝膠脫色液: 1000 ml甲醇 100 ml冰醋酸 100 ml去離子水 800 ml可使染色的凝膠脫色,以減低背景。10. 麗春紅S工作液： 100 ml麗春紅S儲(chǔ)存液 10 ml去離子水 90 ml可用來(lái)染蛋白質(zhì).11. 1轉(zhuǎn)移緩沖液： 1000 ml10轉(zhuǎn)移緩沖液 100 ml甲醇 200 ml去離子水 700ml可回收利用三、操作步驟：1. 組織（或細(xì)胞）的裂解：取所需的組織，如：腦、脊髓或其他組織，操作時(shí)動(dòng)作要快且最好在冰上進(jìn)行。將其轉(zhuǎn)移到已清洗干凈并烘干后的勻漿器中，加裂解液進(jìn)行勻漿（裂解液的量根據(jù)組織塊的大小確定），勻漿時(shí)需將勻漿器置于碎冰塊中，且勻漿時(shí)間不能太長(zhǎng)（約3-5分鐘，或勻漿器抽拉30-40次），抽拉時(shí)動(dòng)作要慢，以減少氣泡的產(chǎn)生。若要裂解細(xì)胞，所加的裂解液量不能太多，以免蛋白質(zhì)濃度太低，不易檢測(cè)。若取培養(yǎng)基收集蛋白質(zhì)，則不須裂解2. 離心：先啟動(dòng)離心機(jī)預(yù)冷，將溫度降至4，將裂解后的溶液轉(zhuǎn)移至小管中，（根據(jù)溶液的量選取大小合適的小管），速度要快，以免蛋白質(zhì)降解，將小管平衡好之后，放入離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速30005000轉(zhuǎn)/分為宜，離心時(shí)間15分鐘左右。3. 蛋白質(zhì)的變性處理：將離心后的小管取出，吸取上清，轉(zhuǎn)移至另一小管中，吸取時(shí)要小心，不要將沉淀吸出，向小管中按4：1的比例加變性loading ，將蓋子蓋好，用膠帶纏緊，將小管插入到一塑料泡沫上，以防止小管沉底，放入沸水中變性，注意：小管中的液體不能太多，以免加熱后管子爆開(kāi)，可將蓋子用膠帶纏緊，須等水沸騰后將小管放入，不然會(huì)影響變性效果，變性時(shí)間為510分鐘離心后立即變性，防止蛋白質(zhì)的進(jìn)一步降解。變性后的樣品置于4oC，可多次使用。4.灌膠前的準(zhǔn)備：用前須將灌膠用的玻璃板洗干凈，烘干，操作時(shí)避免用手接觸灌膠面，將兩側(cè)的隔條上涂抹一層薄薄的凡士林，不要涂得太寬，以免凡士林進(jìn)入灌膠面，小心將兩塊玻璃板疊在一起，插入到橡膠框中，將長(zhǎng)玻璃板向外傾斜放置，在其底部加10%的瓊脂糖凝膠封底（用前將瓊脂糖在微波爐中加熱至融化，加熱時(shí)間不能太長(zhǎng)，以免沸騰太厲害，污染微波爐），加瓊脂糖的目的是防止液體滲漏，待瓊脂糖凝固后，將玻璃板及橡膠框輕輕置于電泳槽中，旋緊螺栓，也可再加瓊脂糖封邊封底，在兩玻璃板之間加雙蒸水，觀(guān)察有無(wú)液體滲露，若有則需重新封底。5. 灌注分離膠：（根據(jù)我室的灌膠設(shè)備，配10ml即可）灌膠前需根據(jù)要檢測(cè)的組織及蛋白質(zhì)種類(lèi)的不同，選用不同濃度的凝膠，常用濃度為10% 丙烯酰胺溶液（30.8%）3.4ml4分離膠緩沖液（PH8.8）2.5 ml去離子水4.1 ml10%過(guò)硫酸胺(APS)30ulTEMED5-8ul其中過(guò)硫酸胺提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基，而TEMED通過(guò)催化過(guò)硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合。灌膠之前在電泳槽上確定要灌的分離膠的最上液面到達(dá)的位置，即將梳子插入到兩玻璃板之間，梳子下端下方1cm左右處即為分離膠的最上液面，將上述液體充分混勻后，快速加入到兩玻璃板之間，加液體時(shí)可沿一側(cè)壁加入，以免產(chǎn)生氣泡，待分離膠加至所需液面水平時(shí)，停止加分離膠，向其中加去離子水，其作用一方面防止分離膠氧化，另一方面可將分離膠的液面壓平。APS和TEMED的量不能太多，以免凝固太快，形成的凝膠不均勻，以30-45分鐘凝固為宜。6. 灌堆積膠：4ml待分離膠完全凝固后，將水倒出，再向其中加堆積膠，其配方為：丙烯酰胺溶液（30.8%） 0.67ml4堆積膠緩沖液(PH6.8) 1 ml去離子水 2.3ml10%過(guò)硫酸胺(APS) 15ulTEMED 5ul堆積膠的作用為使分散的樣品在進(jìn)入分離膠之前聚集成一條細(xì)線(xiàn)，使起跑位置基本一致，待堆積膠灌至離最上方0.5cm時(shí)，插入梳子，再將液體加滿(mǎn)，因堆積膠凝固后會(huì)有小部分回縮，需在其上方多加一些，以免形成的加樣孔不夠長(zhǎng)，影響上樣量，堆積膠凝固后，將梳子輕輕拔出，拔出時(shí)兩側(cè)用力要均勻，以免損傷加樣孔，若兩加樣孔之間的凝膠條有傾斜，需將其輕輕扶直，最好將設(shè)備置于4oC過(guò)夜備用，因過(guò)夜后凝膠的聚合會(huì)更好一些，有利于跑膠。7. 電泳：將電泳槽中加入電泳緩沖液，電泳緩沖液的液面須高于凝膠的最上端，且注意電極的方向（長(zhǎng)玻璃板側(cè)對(duì)紅面，電泳儀的電極與電泳槽的電極相互對(duì)應(yīng)即可），將電源打開(kāi)，觀(guān)察電流的大小，若電泳緩沖液反復(fù)使用次數(shù)太多，電流太小，則需更換電泳緩沖液。之后將電源關(guān)閉，向加樣孔中加入已變性的樣品，根據(jù)蛋白質(zhì)的濃度確定上樣量，或預(yù)先將樣品按不同的上樣量加入到加樣孔中，根據(jù)電泳后的條帶確定上樣量，若是細(xì)胞樣品，或蛋白質(zhì)的濃度太低，則需將樣品濃縮。在膠的一側(cè)加一marker，marker的用量約2-5ul，以確定蛋白質(zhì)條帶的分子量的大小，marker與樣品之間最好隔一加樣孔，以利于切割，電泳時(shí)，以小電流為好，我室的經(jīng)驗(yàn)是電壓調(diào)至100V，電流約5mA左右，同時(shí)需將電泳槽放入冷水中，因電泳時(shí)有熱產(chǎn)生，會(huì)影響跑膠，導(dǎo)致中間的樣品速度較快而兩邊的樣品速度較慢，跑出的條帶不在一條直線(xiàn)上，待溴酚藍(lán)指示劑完全進(jìn)入瓊脂糖凝膠中，停止電泳。8. 考馬斯亮藍(lán)染色及脫色：將兩玻璃板輕輕分開(kāi)，使凝膠在一塊玻璃板上，去掉分離膠兩側(cè)的瓊脂糖及堆積膠，將凝膠小心從玻璃板上取下，置于考馬斯亮藍(lán)染色液中，過(guò)夜，次日將考馬斯亮藍(lán)染色液回收，將染色后的凝膠放入內(nèi)有考馬斯亮藍(lán)脫色液的平皿中脫色，可在脫色搖床上搖動(dòng)以加快脫色，中間換兩次脫色液，待背景基本無(wú)色時(shí)即可，脫色時(shí)間不能太長(zhǎng)，以免蛋白質(zhì)條帶顏色過(guò)淺，將凝膠取出，用保鮮膜包好，置于4oC冰箱中保存或照相。9. 轉(zhuǎn)膜將海綿、濾紙和硝酸纖維素膜在轉(zhuǎn)膜液中浸濕備用。攤開(kāi)轉(zhuǎn)膜夾，先根據(jù)需要轉(zhuǎn)膜的凝膠大小確定濾紙及膜的大小，濾紙和膜應(yīng)比凝膠稍小，將其中一海綿置于轉(zhuǎn)膜夾黑面上方，其上放一層厚的濾紙或4層薄濾紙，將凝膠放在濾紙上，它的上方再放膜及濾紙，最上方放另一塊海綿，將轉(zhuǎn)膜夾夾好，注意：膜與凝膠之間不能有氣泡，因有氣泡的部位蛋白質(zhì)不能轉(zhuǎn)到膜上去，且凝膠兩側(cè)的海綿和濾紙不能接觸，否則會(huì)產(chǎn)生短路，使轉(zhuǎn)膜的效果差，將夾子放入轉(zhuǎn)膜槽內(nèi)，接通電源，注意電極的方向不能接反，轉(zhuǎn)膜所需的電流為40mA，過(guò)夜或200mA左右，1.5-2小時(shí)。10. 麗春紅染色：轉(zhuǎn)膜后關(guān)閉電源，將膜小心取出，同時(shí)可將轉(zhuǎn)膜后的凝膠放入考馬斯亮藍(lán)染色液中進(jìn)一步染色，觀(guān)察轉(zhuǎn)膜的情況，將取出的膜用麗春紅染色，染色幾分鐘即可，染色時(shí)間不宜太長(zhǎng)，以看到清楚的條帶為宜，用雙蒸水漂洗膜，洗去麗春紅。11. 封閉：將漂洗后的膜裝入大小適中的塑料袋中，向其中加封閉液（3%BSA+5%脫脂奶粉，用0.1MPBS稀釋?zhuān)覝叵?小時(shí)。12. 加一抗：將膜取出，置于另一塑料袋中，加一抗（利用含3%BSA+5%脫脂奶粉的封閉液稀釋?zhuān)♂尪雀鶕?jù)所選用的抗體確定，一般為1：1000），用封口機(jī)將膜封好，4oC冰箱中過(guò)夜。注意將袋中的氣泡排除干凈。13. 洗一抗：取出膜，放在平皿中，用含0.1%Triton的PBS漂洗，室溫下每次10分鐘，漂洗三次。14. 加二抗：將膜放在另一塑料袋中，加偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的二抗（二抗的性質(zhì)根據(jù)使用的一抗來(lái)確定，用含0.1%Triton的封閉液進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尪葹?：2000-5000），排凈氣泡，將膜封好，室溫下作用1-1.5小時(shí)。注意二抗的濃度不能太高，以免有較強(qiáng)的假陽(yáng)性出現(xiàn)。15. 洗二抗：取出膜，放在平皿中，用含0.1%Triton的PBS漂洗，室溫下每次15分鐘，共漂洗三次。16. 顯色（利用ECL光化學(xué)發(fā)光法試劑盒）：取ECL液中的1.2 ml A液+30ulB液混勻，作用5分鐘，將膜從洗滌液中取出，吸干洗滌液，正面朝上，把ECL液均勻加在膜上作用5分鐘左右，吸干ECL液，將膜用保鮮膜包好，入暗室操作。17. 曝光，顯影，定影：打開(kāi)壓片夾，將膜放在一側(cè)，其上方放置膠片，合好壓片夾，作用幾分鐘到幾十分鐘，選用不同的曝光時(shí)間，取出膠片，進(jìn)行顯影，定影，將膠片在室溫晾干即可。18. DAB法：除了用ECL光化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，也可用常規(guī)的DAB法顯色，其大體步驟為：封閉：將麗春紅染色漂洗后的膜裝入塑料袋中，加封閉液（3%BSA+5%脫脂奶粉，用0.1MPBS稀釋?zhuān)?，室溫?小時(shí)。加一抗：將膜置于另一塑料袋中，加一抗（用封閉液稀釋?zhuān)♂尪雀鶕?jù)所選用的抗體確定，一般為1：1000），4oC冰箱中過(guò)夜。洗一抗：用含0.