相分離技術分離純化膜蛋白-翻譯

相分離技術分離純化膜蛋白摘 要相分離是用來純化和濃縮洗滌劑溶膜蛋白的一種簡單、高效且廉價的方法。盡管如此，在膜蛋白科學中相分離并沒有被廣泛使用，并且只有相對較少的去污劑/膜蛋白的結合體具有隨時可以使用的實驗方案。在這里，我們總結了影響用于膜蛋白研究的常見去污劑的相分離行為的理化參數(shù)。并列舉出了用這種方法以不同種類的去污劑純化膜蛋白的成功例子。在許多下游應用（如膜蛋白結晶或功能分析）中，去污劑的選擇是至關重要的，我們討論了對于一個給定的去污劑緩沖系統(tǒng)如何來給出新的相分離實驗方案。引 言去污劑用來從生物膜中提取膜蛋白和調整它們在水溶液中的溶解度，這是進一步進行蛋白質純化的先決條件1。膜蛋白的純化一般來說較為繁瑣2，因為把它們從自身的膜環(huán)境移入到去污劑緩沖區(qū)，只能部分地模擬類脂膜的理化性質。因此，提取后許多膜蛋白不能保留其生物活性，或者只能部分地或者只能在非常特殊的緩沖溶液中保留活性。提取后，可用用于可溶性蛋白質的相同的層析法進行膜蛋白的純化，其區(qū)別在于去污劑必須一直在緩沖區(qū)。去污劑不會干擾離子交換或金屬螯合色譜，只是有時候會干擾親和層析法。尺寸排阻色譜法中，結合去污劑會增加膜蛋白的表觀分子量。相分離技術是一個功能強大的、可替代或補充色譜法的純化實驗方案。它可直接應用于溶膜，從可溶性蛋白質和其它親水性雜質中分離出膜蛋白。這種粗純化實驗方案可用于膜蛋白組學或者作為色譜純化的第一步3,4。另外，相分離可用于純化后期的同時濃縮和和進一步純化步驟5。使用相分離的步驟來純化膜蛋白有許多好處。該方法具有操作簡單、不需要復雜的實驗設備、易進行試驗放大、可以和大多數(shù)色譜結合使用等優(yōu)點。其中特別對于脫除親水化合物是非常有效的。此外，膜蛋白可以同時純化和濃縮，可與采用（NH4）2SO4或其它鹽的可溶性蛋白的沉淀實驗方案的效率相比擬。這種方法可能有的缺點是，高濃度的去污劑不利于蛋白的穩(wěn)定以及會干擾生物化學試驗和其結合過程。滲析或其他方法與去污劑吸收或凝膠過濾一樣，可能需要從溶液中除去多余的去污劑。本文中，我們描述了影響用于膜蛋白純化的不同類別去污劑的相分離的理化參數(shù)。并論述了成功的相分離技術的實驗方案，以及如何調整實驗方案用于新的去污劑緩沖體系。去污劑的一般性質去污劑是兩親性分子，通常由一個極性或電荷頭基和憎水烴鏈組成。在非常低的濃度下，這些分子可溶于水的單體。當增大去污劑濃度超過所謂的臨界膠束濃度（CMC），去污劑分子聚集形成一個非常窄尺寸分布，稱為膠束。膠束的大小取決于去污劑的類型；去污劑常用于膜生物化學，膽酸鈉的聚集數(shù)（如，去污劑分子每膠束）的變化幅度為2到3，Triton X-100的聚集數(shù)約為140。此外，膠束的大小和臨界膠束濃度（CMC）取決于離子強度和去污劑溶液的溫度。雖然離子去污劑的臨界膠束濃度（CMC）隨鹽濃度的增加而降低，但受溫度影響較小，非離子去污劑的臨界膠束濃度（CMC）不受鹽的影響，但隨溫度的上升而增長7。其它影響膠束的大小和臨界膠束濃度的因素是壓力，pH值，以及雜質的存在6。濁點和相分離通過提高去污劑濃度，或者通過改變溫度，又或者改變膠束去污劑水溶液的鹽濃度來達到所謂的濁點。膠束溶液會變混濁；膠束不能與水混合并形成較大的聚集體，從而區(qū)分于水相。大多數(shù)但并非所有的去污劑都可分成富去污劑相，而反過來其仍然包含了大量的水。依靠去污劑和緩沖體系，富去污劑相可以完全清澈或混濁并可以建立在貧去污劑相上方或下方。這一過程被稱為相分離，或者有時稱為濁點萃取。相分離是由于單相和兩相體系的熵的差異產生，同時也具備溫度依賴性。結果類似于蛋白質沉淀因使用聚乙二醇（PEG）或（NH4）2SO4而沒有足夠的自由水可保持蛋白質充分水化，從而得到溶解。同樣，少量的水覆蓋去污劑膠束聚集體的表面從而形成一個獨立相，這種聚集體行為受溫度，鹽，和聚合物的影響。相 圖圖1顯示兩個去污劑相水溶液簡單的例子，展示了去污劑隨溫度和濃度增長的兩個不同的相形態(tài)。所有的去污劑都是低濃度的單體溶液。單體去污圖1. （A）簡化的下會溶邊界的去污劑相圖。這種類型的去污劑通常是非離子的。所有聚乙二醇（PEG）為基礎的去污劑都是這一類。（B）簡化的上會溶邊界的去污劑相圖。這是經常可以觀察到的兩性離子去污劑和糖苷去污劑。劑溶液與膠束溶液由CMC分開并依賴于其本身的溫度。高于此濃度，則去污劑由膠束構成一個特定的大小。膠束溶液和相分離之間的界線在相圖中叫做上限或下限會溶邊界。在圖1A中，去污劑的濁點增長達到中間體濃度的膠束溶液的溫度，就達到了混溶邊界。而在圖1B中去污劑的濁點降低達到中間體濃度的去污劑膠束溶液的溫度，就達到了上混溶界限。圖1A中是是典型的PEG去污劑的相形態(tài)，而在圖1B中的上混溶界限可觀察到許多兩性離子和糖苷去污劑。當達到濁點，去污劑將形成一個獨立相，水相將被去污劑耗盡。在極高的去污劑濃度和低溫（通常是在濃度與生化目的不相關）時，將形成包含有序去污劑分子的液晶相。液晶相可分為立方體，六邊形，或層狀相8，這要取決于許多因素，但在此不進行討論。重點是要注意，溫度與濃度的相圖劇烈變化時，溶液的離子強度是多種多樣的。因此，可以通過加鹽而不是改變溫度達到膠束溶液的濁點。已對Triton家族去污劑做了廣泛的研究9。其他添加劑像甘油或尿素因為不存在脂質的混合膠束10以及添加聚合物，都對去污劑的相形態(tài)有較大影響（見下一節(jié)）。利用相分離純化膜蛋白去污劑基相分離是以聚合物基相分離為基礎的。當兩個十分不同的水溶性聚合物（例如，葡聚糖dextran和聚乙二醇PEG）的混合溶液的濃度較高時，兩個不混溶水相將形成。不同的蛋白將分成兩相，這取決于其物理性質和聚合物的性質11。當使用帶不同電荷的聚合物（例如，陽離子或陰離子聚乙二醇PEG衍生物），蛋白可以從一個相移到其它相，只需通過在低離子強度的緩沖體系中的等電離點從高到低改變pH值12。這種方法的變化是兩相體系，包括PEG和鹽13。雙水相體系已可以適用于工業(yè)規(guī)模的生產14，但還很少應用于實驗室研究。聚合物基雙水相系統(tǒng)可用于去污劑溶膜蛋白，束縛去污劑的性質將影響膜蛋白分離的問題。因為這涉及除此之外的兩個聚合物，蛋白質和去污劑，這種系統(tǒng)很難處理，同時在下游應用中移除聚合物也是一項額外的挑戰(zhàn)。但是，PEGdextran系統(tǒng)聯(lián)合去污劑Triton X-100已成功地用來純化大腸桿菌外部膜磷脂酶15和溶壁微球菌細胞色素b55616。表1. 去污劑用于相分離純化膜蛋白圖2. 去污劑基的相分離可用于純化或濃縮膜蛋白。越過去污劑的混溶邊界，是由于溫度或緩沖液離子強度的變化，又或者是由于添加了聚合物（A），會形成一個分離出來的富去污劑相（B）。放置一段時間（通常是幾個小時）或離心是使其充分分開為兩相的必要條件。請注意，根據(jù)緩沖體系的密度可在貧去污劑相的上面或下面找到富去污劑相包含的膜蛋白（C）。富去污劑相通常是總量的1-10，可以達到明顯的濃度因素。當在去污劑中只加一種聚合物時也可以相分離，從而減少了系統(tǒng)的復雜性。在這種情況下，去污劑膠束本身作用于第二種聚合物。此方法是許多非離子去污劑與PEG或dextran結合使用，并已用于膜蛋白的純化17。當憎水性物質被添加到其他可溶性蛋白，在這樣的系統(tǒng)中它們可以分割成富去污劑相18。相分離也可以很好的應用于其它聚合物的體系，只要去污劑的濁點的溫度不會傷害到蛋白質結構與功能就可以。如果情況并非如此，則可以通過添加鹽或改變pH值對濁點進行修正，在以下幾節(jié)中就討論不同類別的去污劑，并如圖2所示，去污劑的相分離是很容易推廣和應用到工業(yè)化生產過程19-21。表1總結了去污劑的相分離已成功用于膜蛋白純化的特性。Triton家族 大多數(shù)已發(fā)表的相分離實驗方案都是依靠Triton家族的去污劑。叔辛基酚聚乙烯（乙二醇醚）n是在不同商標下商業(yè)上的應用。其中產品略微的差別在于平均尺寸n和PEG基頭基的粒度分布。在Triton X-100，Nonidet P-40 （NP-40），和Igepal CA-630中，n分別是9.6，9.0，和9.522。 經典的相分離法應用于膜蛋白是依賴于去污劑Triton X-114（n=7-8），并在1981年由Bordier得到發(fā)展23。這種去污劑在與膜蛋白工作的濃度有關時，其濁點大約為22C，在室溫下很容易分離，當樣品存放在冰上時只有一相。許多不同的膜蛋白由動物和植物組織以及微生物中提取和純化時，均可用Triton X-114系統(tǒng)22。為了更好地分離的兩相，可以用6的蔗糖墊；在室溫下離心，可以從蔗糖墊下收集富去污劑相24。假如由于蛋白質的有限穩(wěn)定性而使室溫為不利條件，則可添加15-20的甘油從而使Triton X-114的濁點降至4 25。 Triton X-100的濁點為64 23，因此需要添加劑來降低膜蛋白相分離的工作溫度。在室溫下，添加9（NH4）2SO4或16 的NaCl可降低2Triton X-100的濁點9，可以用來分離膜蛋白26。富去污劑相在（NH4）2SO4的濃度20%時成為固體，很可能形成一個之前討論過的液晶相。在室溫下，NP-40的相分離行為相類似，但是需要稍微降低鹽濃度9。 所有叔辛基酚基去污劑都會強吸收紫外線，從而干擾光學檢測。此外，它們的CMC已經相當?shù)投遗c溶液滲析不一樣。因此，盡管它們是溫和的去污劑，以致很少使膜蛋白變性，但是在許多應用中依然不是一個理想的選擇。Tween家族 Tween去污劑是使膜蛋白溶解常使用的脂肪酸的聚氧乙烯山梨醇脂，因為它們是相對溫和的去污劑，并且很少干擾酶的檢測6。相對于Triton和其他非離子型去污劑，鹽對Tween去污劑的臨界膠束濃度（CMC）和聚集數(shù)的影響較低27。2的Tween 20或Tween 80進行相分離時可分別加入16或12的（NH4）2SO49，或者可以添加PEG或dextran17。Tween 80與兩種復雜聚合物相結合已被用來純化人和重組載脂蛋白A128。通常情況下，Tween去污劑只用于溶解蛋白質，之后使用Triton X-114的相分離方法，因為它們的特性非常相似。Tween 20和Tween 80可以取代Triton X-100的相分離實驗方案29。聚乙二醇醚去污劑 某一尺寸分布中無論是作為純物質或者是混合物，商品化聚乙二醇醚都可有多種不同的鏈長。在許多的物理化學綜述中列出了可用的聚乙二醇醚去污劑及其濁點，臨界膠束濃度（CMC）和聚集數(shù)30，31。所謂的CxEy是依據(jù)本身的烷基鏈長度（x）和聚乙二醇單位的頭基數(shù)量（y）。通常情況下，這些去污劑可以通過商品名稱更好的了解它們（例如，Brij 35即C12E23，或者Emulgen 147即C12E25）。這些去污劑濁點的影響，取決于烷基鏈以及頭基的長度；烷基鏈長度為常數(shù)時，濁點隨頭基大小的增大而降低（例如，從58C的C8E3到96C的C8E8）。然而，濁點隨著烷基鏈長度的增長而下降（例如，從43C的C8E4到4C的C12E4 ）31。盡管濁點有廣泛的變異性，應允許在緩沖體系和常溫下的任何條件下相分離，存在少數(shù)用PEG相分離法來分離純化膜蛋白。近來，C8POE，一種C8Ex混合物，X=2-9，已用于純化細菌外膜蛋白。C8POE的重要組成部分是C8E4，其濁點為43，而在室溫下，借助于20的（NH4）2SO4，其濁點會有所改變22。C8POE 優(yōu)于Triton X-114的一個主要優(yōu)點的是它的高臨界膠束濃度（CMC），可輕松的分離去除多余的去污劑。C10E4基本相同，其額外的優(yōu)點為良好的性質，就是相分離在低鹽緩沖液中可以發(fā)生在室溫條件下32。Triton和Tween系列去污劑，聚乙二醇醚與dextran或者PEG一起，可用于聚合物為基礎的相分離。一份詳細的研究表明，膜蛋白細菌視紫紅質和膽固醇氧化酶的相分離是通過去污劑C12E5，C12E8和C12E23（即Brij 35），與dextran T500或PEG 40000相結合來完成的。聚合物與去污劑的濁點的轉移，使得相分離發(fā)生在室溫條件下，4 時僅存在一相17。同樣，聚乙烯吡咯烷酮可用于誘導基的去污劑的相分離33。糖苷去污劑有糖苷頭基的去污劑經常用于膜蛋白晶體。這一類最常見的去污劑是烷基-葡萄糖和烷基-麥芽糖，其烷基鏈的長度一般為8至14?？磥恚擒杖ノ蹌┡c帶有其它頭基的去污劑相比具有獨特的性能，使它們特別適用于溶解和穩(wěn)定的膜蛋白；-十二烷基麥芽糖（即- DM）膠束的界面區(qū)提供了一個水環(huán)境，而其它（非糖苷）去污劑的情況并非如此34。在含有PEG的緩沖系統(tǒng)中，糖苷去污劑的相圖顯示了上會溶邊界，從而進行低溫的相分離35（圖1B）。這可以應用于純化膜蛋白，可采用PEG（或dextran）與-辛基多苷（-OG），-十二烷基麥芽糖苷17，36，或辛集硫葡糖苷（- OTG）來進行相分離37，38。根據(jù)不同去污劑和脂質的比率，用-OG的相分離可以發(fā)生在不添加高聚物的膜增溶，并已用于純化煙堿型乙酰膽堿受體10。其他非離子型去污劑N-氧化-N,N-二甲基-1-十二胺（DDAO；也可稱為N-氧化-N,N-十二烷基-二甲胺，或LDAO）已成功地用于通過相分離純化細菌反應中心。這個特殊應用中，當pH值為8.0轉變至pH小于7.0開始使用相分離。在這種體系中富去污劑相的密度與水相非常相似，導致乳濁液在離心時并不容易被分離39。在升高溫度是促進其相分離，但添加鹽是抑制其相分離40。毛地黃皂苷，一種溫和的去污劑，其主要用于真核細胞質膜蛋白的選擇性溶解41，可用于相分離法。膜的相分離發(fā)生在0C時添加了13%的PEG 6000和可溶性毛地黃皂苷（例如，葡萄球菌）42。許多其他類型的非離子型去污劑用于膜蛋白時，在生物化學和晶體學中沒有相圖和濁點的詳細信息。例如去污劑烷基-N-甲基葡糖酰胺（MEGA-8 to MEGA-10）43和6-O-（N-庚基氨基甲酰）-甲基葡萄糖苷（HECAMEG），所有這些都是很容易透析卻不會使膜蛋白變性的物質，即使在高濃度中也是一樣。兩性離子去污劑許多兩性離子去污劑的相圖顯示上會溶邊界44，類似于糖苷去污劑（圖1B）。其濁點隨烷基鏈的增長而增大。但是，只存在于烷基dimethylammonioethylsulfates和烷基dimethylammoniopropylsulfates的詳細物理化學研究是用于提取小疏水性有機物，而不是膜蛋白生化44，45。烷基dimethylammoniopropylsulfonates（烷基鏈長為10至16，或者可稱為磺酸甜菜堿去污劑或兩性去污劑）是溫和性的去污劑可用于溶膜蛋白46。其濁點在0以下，因此，在溫度降低的條件下它們的上會溶邊界不能引發(fā)相分離，除非緩沖溶液添加劑的濁點達到室溫44。膽酸基兩性離子去污劑3-（3-膽酰胺丙基）-二甲氨基-l-丙磺酸內鹽（CHAPS）47經常被用來溶解膜蛋白，但是，沒有資料顯示其相圖或濁點的存在，而C8-卵磷脂可以被很好的研究相分離行為，但還沒有被用于提取膜蛋白48。陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）常用于蛋白質的應用方面，但通常會使蛋白質變性。至于其他陰離子去污劑，SDS的溶液行為強依賴于緩沖系統(tǒng)的離子強度。SDS的聚集數(shù)從62至132增加了一倍以上，而當在25 C，NaCl濃度從0增加到500 mM，其臨界膠束濃度從8.1至0.5 mM減少了16倍49。誘發(fā)SDS產生相分離，要將0.4-0.5 M的NaCl添加到SDS蛋白質混合物中50，51。顯然，大多數(shù)的蛋白質在高濃度的SDS中會變性，但有一點是可以想象的極其穩(wěn)定的膜蛋白（例如，一些細菌外膜蛋白）可以用SDS來純化。陰離子去污劑膽酸和去氧膽酸似乎可以非常好的穩(wěn)定膜蛋白，但他們加入鹽后會產生沉淀，因此不能用于相分離9。陽離子去污劑陽離子去污劑與SDS類似，會使大多數(shù)蛋白質變性52。然而，十二烷基三甲基溴化銨（DTAB或C12TAB）已成功地用于分離完整的牛視網膜視紫紅質53。因此，陽離子去污劑也可用于提取膜蛋白的相分離技術。甲基三烷基氯化銨（Aliquat-336）結合Na2SO4通過相分離可以濃縮水樣中的肽類毒素54。一些相分離實驗方案使用陽離子與非離子型去污劑的混合物。加入少量DTAB以引發(fā)在細菌反應中心的LDAO的相分離39。將C10E4與C10TAB混合以改善以相分離為基礎的純化葡萄糖-6-磷酸脫氫酶技術55。混合型去污劑在某些情況下，它可以有利于混合不同的去污劑以改變去污劑緩沖體系的相分離性能。非離子與陽離子去污劑的混合物已被成功地用于純化膜蛋白（例如部份陽離子去污劑），C10E4和OTG的混合物與單一去污劑相比，改進了純化細菌反應中心的相分離性質56。Triton X-114與兩性離子去污劑SB-10的混合物，通過相分離的蛋白質組學研究確保了其可以增溶和富集膜蛋白，而單一去污劑卻不可以3。許多去污劑都是商品化的不同烷基或頭基鏈長的混合物，它們更廉價一些因此適用于大型生產應用例如, Triton57, Angrimul 58, or Lorol 21。是否可以使用混合去污劑來純化膜蛋白將主要取決于下游應用；在膜蛋白晶體學中，去污劑純度是否影響晶體性質，這無疑會是一個問題。去污劑的脫除相分離中，膜蛋白分到富去污劑相。高濃度的去污劑在這個階段可能對蛋白質有不好的影響，以及相粘度技術造成的液體處理問題（如準確的移液量）。收集富去污劑相并稀釋它，是最簡單的方法來重新建立一個單相膠束溶液。在緩沖體系中可分離時的去污劑濃度的界定，只在去污劑高臨界膠束濃度時，但它的優(yōu)點是在富去污劑相中保留高蛋白質濃度。凝膠過濾可用于緩沖液更換59，也可以像其他色譜方法一樣進行離子交換或親和層析。另外，去污劑可以結合和去除，疏水性聚苯乙烯樹脂（Bio-Beads, Calbiosorb, 或 Amberlite XAD2, 等）60或環(huán)糊精。環(huán)糊精結合去污劑單體。它們可以被添加到其中連同束縛去污劑一起增溶和消除，因為它們是小于膠束的不可分離的去污劑61。環(huán)糊精也可以結合色譜