【畢業(yè)學(xué)位論文】(Word原稿)番茄尖孢鐮刀菌無致病力菌株生防特性的研究-生物化學(xué)與分子生物學(xué)

分 類 號 密級 公開 收藏編號 _ 學(xué)號 11校代碼 10386 編號 _ 番茄尖孢鐮刀菌無致病力菌株 生防特性的研究 學(xué)科專 業(yè) ： 生物化學(xué)與分子生物學(xué) 研究方 向： 應(yīng)用微生物 研究生姓 名： 指 導(dǎo) 教 師 、職 稱： 研究員 所在學(xué) 院： 生物科學(xué)與工程學(xué)院 答辯委員會主席簽名： 二一二 年 四 月 一 遵守學(xué)術(shù)行為規(guī)范承諾 本人已熟知并愿意自覺遵守福州大學(xué)研究生和導(dǎo)師學(xué)術(shù)行為規(guī)范暫行規(guī)定的所有內(nèi)容，承諾所提交的畢業(yè)和學(xué)位論文是終稿，不存在學(xué)術(shù)不端行為，且論文的紙質(zhì)版與電子版內(nèi)容完全一致。 二 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明所提交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得福州大學(xué)或其他教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我 一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。 三 關(guān)于論文使用授權(quán)的說明 本人完全了解福州大學(xué)有關(guān)保留使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。（保密的論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定） 本學(xué)位論文屬于（必須在以下相應(yīng)方框內(nèi)打“”，否則一律按“非保密論文”處理）： 1、保密論文： 本學(xué)位論文屬于保密，在 年解密 后適用本授權(quán)書。 2、非保密論文： 本學(xué)位論文不屬于保密范圍，適用本授權(quán)書。 研究生本人簽名： 簽字日期： 20 年 月 日 研究生導(dǎo)師簽名： 簽字日期： 20 年 月 日 I 番茄尖孢鐮刀菌無致病力菌株生防特性的研究 中文摘要 植物枯萎病是由尖孢鐮刀菌（ 起的一類毀滅性的土傳病害，該菌能夠引起多種作物的枯萎，造成嚴重的經(jīng)濟損失。本文研 究了無致病力番茄尖孢鐮刀菌菌株 寄主范圍、定殖特性、生理學(xué)特性及其對番茄枯萎病的防治效果等。結(jié)果如下： 菌株 寄主范圍和定殖特性研究結(jié)果表明：該菌對供試的5 個科的作物均不造成危害，且在不同作物中的定殖存在明顯差異。在茄科作物中的定殖能力最佳，其次是巴蕉科與葫蘆科，而在百合科及禾本科上不能定殖。從侵入時間上看，在番茄植物最易侵入，接種第 5 d 時即可到達莖基部；其次為甜椒、香蕉及甜瓜等植物，第 10 d 時可到達莖基部或假莖部。利用無毒基因的特異性檢測引物 析了接種菌株不同植物上的分離培養(yǎng)的分離物，結(jié)果均表明所獲得的分離物均為所接種的無致病力尖孢鐮刀菌菌株。 生理學(xué)特性研究表明：無致病力尖孢鐮刀菌 生長速度與致病菌相比無明顯差異。在以柑桔果膠和羧甲基纖維素鈉（ 碳源的培養(yǎng)條件下均能產(chǎn)生多聚半乳糖醛酸酶（ 果膠甲基半乳糖醛酶（ 纖維素酶（ 多聚半乳糖醛酸反式消除酶（ 果膠甲基反式消除酶（ 細胞壁降解酶（ 但以柑桔果膠為碳源時 活力更高。無致病力尖孢鐮 刀菌 夠提高番茄和香蕉植株體內(nèi)過氧化物酶（ 多酚氧化酶（ 無致病力尖孢鐮刀菌 番茄枯萎病的防治效果研究表明：該菌株對番茄有明顯促長作用，能顯著增加株高和葉片數(shù)量，對番茄枯萎病盆栽苗的防效可達 76 %。 關(guān)鍵詞：無致病力菌株，尖孢鐮刀菌，定殖特性，酶活，防治效果 on of to of . of of t by 20 in of by of of 0 as by 12of no by of or of of by of of 3in by of in by 6 %. 錄 第一章 緒論 . 1 萎病的發(fā)生及危害 . 1 萎病的防治 . 1 業(yè)防治 . 1 學(xué)防治 . 2 病育種 . 2 物防治 . 3 致病力尖孢鐮刀菌的作用模式 . 4 導(dǎo)系統(tǒng)抗性 . 4 爭 . 5 養(yǎng)競爭 . 5 入位點競爭 . 6 致病力尖孢鐮刀菌的應(yīng)用現(xiàn)狀 . 6 研究的目的及意義 . 7 第二章 無致病力尖孢鐮刀菌 毒基因檢測及其病理學(xué)特性研究 . 8 引言 . 8 料與方法 . 8 驗材料 . 8 驗方法 . 9 株 作物的安全性評價 . 9 株 作物體內(nèi)定殖能力分析 . 9 株的特異性引物 測 . 9 果與分析 . 10 株 幾種主要作物的安全性 . 10 株 作物體內(nèi)定殖能力分析 . 11 株的特異性引物 測 . 13 論 . 13 第三章 無致病力尖孢鐮刀菌 理學(xué)特性研究 . 15 引言 . 15 料與方法 . 16 驗材料 . 16 驗方法 . 16 株 致病菌生長速度的比較 . 16 胞壁降解酶粗酶液的制備 . 17 G、 性的測定 . 17 性的測定 . 17 血清蛋白標準曲線的制作 . 18 馬斯亮藍 測定酶蛋白濃度 . 18 株 致病菌株代謝組學(xué)研究 . 18 果與分析 . 19 株 致病菌生長速度的比較 . 19 養(yǎng)條件對菌株 胞壁降解酶的活性影響 . 20 桔果膠為碳源的影響 . 20 甲基纖維素鈉為碳源的影響 . 21 柑桔果膠和羧甲基纖維素鈉為碳源的影響 . 21 株 致病菌株的代謝組測定 . 22 株 致病菌代謝組學(xué)比較 . 26 論 . 28 第四 章 無致病力尖孢鐮刀菌 香蕉與番茄上的定殖特性研究 . 30 引言 . 30 料與方法 . 30 驗材 料 . 30 驗方法 . 31 株 致病菌在植物體內(nèi)的定殖監(jiān)測 . 31 液 的制備 . 32 測定 . 32 測定 . 32 活力的計 算 . 33 萄糖標準曲線的制作 . 33 . 33 果與分析 . 34 株 致病菌在植物體內(nèi)的定殖監(jiān)測 . 34 株的致病性測定 . 34 株的分離驗證 . 36 株 致病菌株 植物體內(nèi)酶類的影響 . 39 株 致病菌株 過氧化物酶的影響 . 39 V 株 致病菌株 多酚氧化酶的影響 . 41 株 致病菌株 . 43 論 . 45 第五章 無致病力尖孢鐮刀菌 番茄枯萎病防效的測定 . 47 引言 . 47 料與方法 . 47 驗材料 . 47 驗方法 . 47 株 致病菌平板共培養(yǎng)的營養(yǎng)競爭 . 47 株 番茄植株生長特性的影響 . 48 株 番茄盆栽苗枯萎病防效的測定 . 48 果與分析 . 48 株 致病菌平板共培養(yǎng)的營養(yǎng)競爭 . 48 株 致病菌株 番茄盆栽苗枯萎病防效的測定 . 49 株 番茄植株生長特性的影響 . 49 株 番茄盆栽苗枯萎病防效的測定 . 51 論 . 53 結(jié)論與展望 . 54 結(jié)論 . 54 展望 . 55 參考文獻 . 56 番茄尖孢鐮刀菌無致病力菌株生防特性的研究 1 第一章 緒論 萎病的發(fā)生及危害 植物枯萎病是由鐮刀菌引起的一種世界性真菌土傳病害，其主要的致病菌是尖孢鐮刀菌（ 。絕大部分的尖孢鐮刀菌都是致病的，會引起植物根部腐爛或維管束病變，但它們中有一些菌株能夠定殖于植物組織而不引起任何癥狀 1。致病的尖孢鐮刀菌具有很強的寄主特異性，基于寄主植物的種類和品種，可以把它們大約分為 53 個種，117 個?；停€有 29 個 變種 2。該菌具有較強的腐生性，能存在土壤中活好幾年，其厚垣孢子通過牲畜消化道后仍具有很強的活力，所以連作地和施用未充分腐熟有機肥的地發(fā)病較為嚴重 3。 尖孢鐮刀菌寄主范圍十分廣泛，目前已報道的被嚴重為害的作物有番茄、香蕉、辣椒、西瓜、黃瓜、棉花、香石竹、康乃馨、蘿卜、鷹嘴豆、菠菜、草莓、川紅花、甘蔗、芝麻、粉蕉、鳳梨等多種植物 4。鄧坤章對廣西北海市香蕉枯萎病進行調(diào)查，自 2003 年起到 2009 年，枯萎病發(fā)生面積由 加為 30 。張揚等對北京市延慶 縣 2002 年至 2006 年期間 甘藍枯萎病的田間發(fā)生和危害進行了追蹤調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這 5 年來該縣甘藍發(fā)病面積提高了 產(chǎn)量損失由 180000 展到 1370000 積年產(chǎn)量損失 4030000 。目前陜西、甘肅、湖南、福建、廣西、浙江、四川、海南、北京、貴州、山西等地已相繼有此病的報道。近年來植物枯萎病 發(fā)展和蔓延迅速 ，對農(nóng)業(yè) 發(fā)展 構(gòu)成了巨大威脅。 萎病的防治 業(yè)防治 對枯萎病的防治傳統(tǒng)上采用農(nóng)業(yè)措施：（ 1） 輪作， 實行與其它種類蔬菜 水旱 輪作； 發(fā)現(xiàn) 只有在輪作時， 西瓜抗性品種才會表現(xiàn)較強的抗病能力，且由于鐮刀菌在土壤中的存活時間較長， 而且要求 5 年以上輪作才有較好的防治效果 7。（ 2）選用不含致病菌的土壤育苗，提倡用新法育苗，減少對根部的傷害 ；在夏季高溫季節(jié)對重病地塊或大棚內(nèi)覆膜，利用 太陽能高溫使 病殘體全部腐爛后殺死病原菌，從而控制病害的蔓延。福州大學(xué)碩士學(xué)位 論文 2 （ 3）嫁接栽培，以抗枯萎病能力較強的作物為砧木從而達到防治目的；嫁接苗不僅可以防治枯萎病，確保苗全、苗壯，而且嫁接苗的根系強大，對水、肥的吸收能力較強。莫云彬等用不同砧木嫁接西瓜，結(jié)果表明利用日本強勢葫蘆作為砧木的效果最佳，不僅抗枯萎病能力最好，而 且綜合性狀也比其它砧木效果好 8。（ 4）加強水肥管理，嚴禁大水漫灌，要施用充分腐熟的有機肥，增施消石灰，從根本改善土壤的理化性狀 9。 雖然傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)措施對枯萎病具有一定的防治效果，但這種方法耗費時間較長，適用范圍有限，這些缺陷都限制著農(nóng)業(yè)防治的廣泛適用性 10。 學(xué)防治 與農(nóng)業(yè)防治相比，化學(xué)防治具有起效快、效果好等優(yōu)點。國內(nèi)常用的化學(xué)方法有：（ 1）采用新土育苗或者將床土消毒后使用，可用多菌靈可濕性粉劑加土拌勻。（ 2）必要時要對種子進行消毒，用適樂時對種子包衣，并進行苗床澆灌或者用一定濃度 的硫酸銅浸種，洗凈后催芽播種。（ 3）發(fā)病初期要及時拔除病株處理掉，并對發(fā)病點進行噴藥保護?？蛇x擇的藥劑有適樂時、多菌靈、甲基托布津可濕性粉劑，在進行灌根時，要根據(jù)植株的生長情況選擇合適的劑量 11。國外常用化學(xué)藥劑熏蒸土壤達到消滅病原菌的目的，如用甲基溴熏蒸。 在西瓜播種前 25 d 用聚乙烯塑料薄膜覆蓋地面進行殺毒，并用多菌靈在播種后噴灑，可明顯降低枯萎病的發(fā)生 12。 采用化學(xué)防治的方法雖能產(chǎn)生較好的防治效果，但也能夠讓一些病原菌產(chǎn)生抗藥性，從而使防治工作更加困難，最嚴重的是化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境的污 染，直接損害人類健康，例如甲基溴被發(fā)現(xiàn)是一種潛在的致癌物，在許多國家已禁止使用 10。 病育種 對環(huán)境最安全的方法就是使用抗病品種，常規(guī)方法一般是用野生植物作為抗枯萎病育種材料，經(jīng)過幾年的抗性培養(yǎng)篩選出那些具有良好抗性的植株。但是這種常規(guī)的育種方法選育抗性資源花費的時間長、耗資大?，F(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，為抗病育種研究提供了強有力的工具，分子標記方法和基因工程技術(shù)已成為抗病育種的新方法，利用植物的遺傳轉(zhuǎn)化可創(chuàng)造出常規(guī)方法得不到的基因型，這就大大減輕了育種工作 13。 通過將質(zhì) 粒 入一株熒光假單胞菌獲得融合菌株，這種融合菌株番茄尖孢鐮刀菌無致病力菌株生防特性的研究 3 能夠提高對黃瓜枯萎病的防治效果 14。 抗病育種雖然能夠盡快選育出抗病品種，但也面臨很多問題。培養(yǎng)一種抗病植物，不僅要知道該植物的優(yōu)勢基因，而且要求這個植物是雌雄同株的。對于康乃馨、仙客來、亞麻這些植物來說，它們的優(yōu)勢基因未知，而對于棕櫚樹來說，它又是雌雄異株的 15。隨著時間的推移，致病菌還會突變?yōu)橐环N新的菌侵入那些抗病植物。總而言之，通過農(nóng)藥以及培養(yǎng)抗病品種來控制枯萎病還存在一定的困難。隨著人們對殺菌劑危害環(huán)境的認識逐漸提高，對零化學(xué)農(nóng)產(chǎn) 品的興趣逐漸增加，加上培育抗病品種費時費力，生物防治就成為人們最青睞的辦法。 物防治 用來防治植物枯萎病的生防菌已經(jīng)有很多報道，包括多種細菌、真菌、放線菌，或者將兩種或兩種以上的菌聯(lián)合起來使用。這些生防菌之所以能夠防治枯萎病，目前公認的機制主要包括營養(yǎng)的競爭、生態(tài)位的競爭、重寄生、產(chǎn)生抗菌素或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生免疫抗性等 16。 生防細菌目前報道的主要是芽孢桿菌和假單胞菌，芽孢桿菌中枯草芽孢桿菌（ 地衣芽孢桿菌（ B. 短短芽孢桿菌（ 及假單胞菌中的熒光假單胞菌（ 銅綠假單胞菌（ P. 5 種生防菌對枯萎病防治效果良好。 從鷹嘴豆根際分離得到一株銅綠假單胞菌，該菌能夠顯著減少鷹嘴豆枯萎病的發(fā)生 17。 發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌 夠有效防治香石竹枯萎病 18。 用來防治枯萎病的真菌主要有木霉、青霉、擬青霉、叢枝菌根、無致病力尖孢鐮刀菌等。 發(fā)現(xiàn)哈茨木霉（ 夠有效防治鷹嘴豆枯萎病 19 。 利用草酸青霉（ 孢子對番茄枯萎病進行防治，防效達 49 %20。王明祖等從根結(jié)線蟲的卵上分離到一株淡紫擬青霉，該菌能夠控制棉花枯萎病的發(fā)生、蔓延 21。李敏等在田間和盆栽條件下，用叢枝菌根接種西瓜苗，可以有效防治西瓜枯萎病，并能夠促進西瓜生長，提高產(chǎn)量和品質(zhì) 22。陳延熙從健康棉花體內(nèi)分離到了無致病力尖孢鐮刀菌，并發(fā)現(xiàn)該菌能夠防治棉花枯萎病 23。 福州大學(xué)碩士學(xué)位 論文 4 致病力尖孢鐮刀菌的作用模式 關(guān)于無致病力尖孢鐮刀 菌的作用模式目前公認的有 2 種：誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ 競爭。競爭又可以進一步分為腐生性競爭和寄生性競爭，前者為在土壤和植物根際中競爭營養(yǎng)，后者為在植物根部競爭侵入位點，了解這些機制能夠使菌株在應(yīng)用時發(fā)揮最好的效果。 導(dǎo)系統(tǒng)抗性 早給誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ 個明確的定義，即植物在遭受一些生物或非生物的壓力時所做出的系統(tǒng)性防御反應(yīng) 24。 1989 年 現(xiàn)幾株無致病力尖孢鐮刀菌能夠防治西瓜枯萎病，這個概念首次被用在無致病力尖孢鐮刀菌上 25。 首次研究發(fā)現(xiàn)無 致病力尖孢鐮刀菌侵入豌豆根部后能夠引起細胞學(xué)變化，無致病力菌株在植物的組織中形成大量半球形的圍墻，同時有一種非導(dǎo)電物質(zhì)在致病菌株的菌絲周圍大量沉淀 26。因此推測通過這種防御反應(yīng)的快速刺激，寄主根部就會得到信號，植物就會做出反應(yīng)抵抗致病菌。但也有人認為這是物理上的阻礙。 過研究棉花枯萎病的誘導(dǎo)抗性，認為是無致病力尖孢鐮刀菌阻塞了植物的維管束，就會限制了致病菌株在維管束組織中的活動范圍和數(shù)量 27。 除了細胞學(xué)的變化，無致病力尖孢鐮刀菌入侵植物后還會產(chǎn)生一系列化學(xué)物質(zhì)的變化。 察 到一種交叉保護現(xiàn)象，即先用一種非該植物?；偷闹虏【臃N，隨后再接種專化型的致病菌，通過這種方式該植物的枯萎病癥狀要比直接接種?；椭虏【木徍秃芏?28。 發(fā)現(xiàn)種植在拮抗性土壤里的番茄植株體內(nèi)的致病性相關(guān)蛋白，如一些水解酶類，它們的含量會比一般高，并且發(fā)現(xiàn)種植在無菌土壤里的植物，如果人為地接入無致病力尖孢鐮刀菌，這些植物體內(nèi)水解酶的活性也會提高 29。發(fā)現(xiàn)接入無致病力尖孢鐮刀菌 番茄體內(nèi)抗性蛋白（ 幾丁質(zhì)酶均有增加 30。 從拮抗性土壤中分 離出來的無致病力尖孢鐮刀菌對番茄、西瓜和甜瓜的枯萎病都具有防治效果，說明無致病力尖孢鐮刀菌的確存在 應(yīng) 31。 無致病力尖孢鐮刀菌在入侵植物時還會分泌一些水解酶類，比如果膠酶、纖維素酶，這些酶能夠破壞寄主的細胞壁，以便進入寄主根部組織。在研究中發(fā)現(xiàn)無致病力尖孢鐮刀菌可以定殖在番茄根部細胞番茄尖孢鐮刀菌無致病力菌株生防特性的研究 5 內(nèi)外而不引起細胞的損傷，這種情況通常在一些寄主與寄主專化型菌株之間存在，并發(fā)現(xiàn)在無致病力菌株定殖于番茄根部的過程中，果膠的水解是主要的作用機制之一，細胞間存在大量的無致病力菌株就可以證明這一點32。 從細胞化學(xué)角度來分析幾丁質(zhì)的分布模式，發(fā)現(xiàn)無致病力鐮刀菌所含的幾丁質(zhì)明顯大幅度降低，尤其是那些菌絲與寄主細胞壁緊貼的位置，這些結(jié)果都表明植物的根部在受到刺激后產(chǎn)生了幾丁質(zhì)酶，而這些幾丁質(zhì)酶很可能是在細胞外進行累積的 33。 另外， 發(fā)現(xiàn)在木豆幼苗中接入無致病力尖孢鐮刀菌后對潮濕鐮孢菌也有抵抗作用，這就表明誘導(dǎo)抗性還會產(chǎn)生一些抗真菌物質(zhì)34。 研究發(fā)現(xiàn)通過接種無致病力尖孢鐮刀菌，三色牽?；óa(chǎn)生了一種不耐熱的化學(xué)物質(zhì)，這種物質(zhì)能夠使三色牽?；ǖ挚箍菸?病 35。 盡管以上這些結(jié)果都表明誘導(dǎo)抗性是無致病力尖孢鐮刀菌的作用模式之一，但是仍然需要更多的研究來說明誘導(dǎo)抗性的分子機理。當(dāng)單獨接種無致病力菌株這種情況對病害的防治效果比將兩種菌一起接入土壤中的效果弱一些，這就表明還存在其它的作用機制，特別是致病菌株與無致病力菌株間的競爭。 爭 養(yǎng)競爭 已經(jīng)可以證實無致病力尖孢鐮刀菌和致病尖孢鐮刀菌之間存在碳源的競爭。 發(fā)現(xiàn)在對枯萎病有拮抗作用的土壤中生物總量和酶活性都比非拮抗土壤中的高，并且尖孢鐮刀菌在兩種土壤中利用 葡萄糖的能力也是不同的 36。 發(fā)現(xiàn)隨著土壤中葡萄糖濃度逐漸增大， 3 株無致病力尖孢鐮刀菌（ 致病尖孢鐮刀菌抑制能力也逐漸增大 37。還有大量的事實證明無致病力菌株和致病菌株之間還存在其它營養(yǎng)條件的競爭。 發(fā)現(xiàn)無致病力尖孢鐮刀菌 離體條件下也能抑制尖孢鐮刀菌香石竹專化型菌株 就表明碳源的競爭只是營養(yǎng)競爭機制中的一種 38。 發(fā)現(xiàn)不同的無致病力尖孢鐮刀菌菌株在富含葡萄糖的土壤中生長能力不同，與致病性菌株 競爭定殖在土壤中的能力也不同 39。 發(fā)現(xiàn)無致病力尖孢鐮刀菌在土壤中的生長情況與其對亞麻枯萎病的防治效果有密切相關(guān)性 40。還有一些其它的無致病力尖孢鐮刀菌也被證實存在營養(yǎng)競爭，1。