基因診斷與基因治療培訓(xùn)教程.ppt

基因診斷與基因治療GeneDiagnosisandGeneTherapy 第二十八章 第一節(jié)基因診斷學(xué)基礎(chǔ)第二節(jié)遺傳病的基因診斷第三節(jié)傳染病的基因診斷第四節(jié)腫瘤的基因診斷第五節(jié)基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用第六節(jié)基因治療的概念及策略 本章內(nèi)容提要 第一節(jié)基因診斷學(xué)基礎(chǔ)BasisofGeneDiagnostics 基因診斷之父 簡悅威 1976年加州大學(xué)華裔科學(xué)家KanYW用核酸分子雜交技術(shù)首次對一例 地中海貧血進行診斷 一 基因診斷的概念 特點及臨床意義 定義 利用分子生物學(xué)技術(shù) 通過檢測基因及基因表達產(chǎn)物的存在狀態(tài) 對人體疾病作出診斷的方法 基因診斷檢測的目標(biāo)分子是DNA RNA 也可以是蛋白質(zhì)或者多肽 診斷依據(jù) 遺傳物質(zhì)改變 DNA RNA或蛋白質(zhì)水平變化 如病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在體內(nèi)從無到有 癌基因表達水平從低到高 基因結(jié)構(gòu)變化 如點突變引起基因失活 染色體轉(zhuǎn)位引起基因異常激活或滅活 基因診斷的特點高特異性高靈敏性早期診斷性應(yīng)用廣泛性 二 基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù) 核酸分子雜交 Nucleicacidhybridization 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR 單鏈構(gòu)象多態(tài)性 SSCP 限制性片段長度多態(tài)性 RFLP DNA序列測定 DNAsequencing 生物芯片 biochips Western免疫印跡 Westernblotting 免疫組織化學(xué)診斷 一 核酸分子雜交Nucleicacidhybridization 指兩條單鏈核酸在一定條件 溫度 鹽離子和有機溶劑濃度 下 按堿基互補的原則重新配對形成雙鏈的過程 核酸分子雜交流程 待測核酸制備 濾膜上核酸固化 雜交 去除未雜交的探針 檢測雜交信號 核酸探針制備 探針標(biāo)記 加入標(biāo)記探針 提取DNA 限制性內(nèi)切酶消化DNA以產(chǎn)生特定長度的片段 凝膠電泳分離 變性處理 DNA轉(zhuǎn)印到膜上并使其牢固結(jié)合 將標(biāo)記的探針與膜上DNA片段雜交 分析雜交信號 1 Southern印跡雜交 Southernblotting RNA經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳后 轉(zhuǎn)移到固相支持物上 通過分子雜交檢測特定的mRNA分子的含量與大小 2 Northern印跡雜交 Northernblotting 3 斑點雜交 dotblotting 將RNA或DNA變性后直接點樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上 用于基因組中特定基因及其表達產(chǎn)物的定性及定量的研究 4 反向斑點雜交 reversedotblotting 先將探針固定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上 將樣品RNA或DNA標(biāo)記變性后進行雜交 改變了傳統(tǒng)雜交方法中一次雜交只能檢測一種樣品的局限 大大提高了基因診斷的效率 寡核苷酸中的堿基錯配會大大影響雜交分子的穩(wěn)定性 可用人工合成的針對正常和突變ASO探針進行反向斑點雜交 檢測點突變 大大提高檢測結(jié)果的可靠性 等位基因特異性寡核苷酸 allelespecificoligonucleotide ASO 5 原位分子雜交 熒光原位雜交 fluorescenceinsituhybridization FISH 掛鎖FISH FISHwithpadlock 熒光原位雜交 FISH 6 固相夾心雜交法 sandwichhybridization 待測靶基因序列上兩個相鄰但不重疊的DNA片段 A B片段 分別作為捕捉探針 不標(biāo)記的A片段 和檢測探針 標(biāo)記的B片段 同時與靶基因雜交 先將捕捉探針吸附于固相支持物上 與靶基因序列A部分雜交 再加入標(biāo)記的檢測探針 檢測探針與靶基因序列B部分雜交 檢測雜交信號 固相夾心雜交法示意圖 二 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) polymerasechainreaction PCR 模板引物dNTPMg2 TaqDNA聚合酶 變性 延伸 退火 PCR在基因診斷中的應(yīng)用 RT PCR熒光定量PCR多重 PCRPCR ASOAS PCRPCR SSCPPCR RFLP 1 RT PCR 2 熒光定量PCR 熒光標(biāo)記引物 3 多重PCR 多重PCR示意圖A 普通PCR B 多重PCR 4 PCR ASO N 正?；?H 雜合子基因 M 突變基因 ASO1 ASO2 N H M 三 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 single strandconformationpolymorphism SSCP DNA的突變造成DNA片段中堿基序列不同 變性為單鏈后在中性聚丙烯酰胺凝膠中的構(gòu)象不同 單鏈構(gòu)象多態(tài)性 利用遷移率的差別可使各種序列不同的單鏈分離開來 PCR SSCP分析原理示意 正常人 純合突變 雜合突變 PCR SSCP分析 四 限制性片段長度多態(tài)性分析 restrictionfragmentlengthpolymorphism RFLP 由于DNA變異產(chǎn)生新的酶切位點或原有的酶切位點消失 在用限制性核酸內(nèi)切酶消化時產(chǎn)生不同長度或不同數(shù)量的片段 可借助核酸分子雜交或PCR進行檢測 設(shè)計適當(dāng)?shù)臄U增引物 使擴增片段包括某一個或數(shù)個限制性內(nèi)切酶識別序列 在PCR擴增后用該限制酶切割PCR產(chǎn)物 根據(jù)電泳后酶切片段長度變化 即可作出診斷 PCR RFLP GAATTC CTTAAG EcoR 限制性內(nèi)切酶位點的變化 五 DNA序列測定 DNAsequencing DNA序列測定原理 雙脫氧末端終止法 左側(cè) 正常 右側(cè)突變 序列分析用于基因診斷研究 六 生物芯片 biochips 基因芯片 genechips 蛋白質(zhì)芯片 proteinchip 基因芯片雜交流程示意圖 基因診斷中常用的分子生物學(xué)方法比較 三 基因診斷技術(shù)路線與方法 直接診斷 直接分析致病基因分子結(jié)構(gòu)及表達是否異常間接診斷 利用多態(tài)性遺傳標(biāo)志與致病基因進行連鎖分析 根據(jù)對致病基因或相關(guān)基因的了解程度決定基因診斷的技術(shù)途徑選擇 一 直接診斷途徑 必要條件 被檢測基因變化與疾病發(fā)生有直接因果關(guān)系 被檢基因正常分子結(jié)構(gòu)已被確定 被檢基因致病的分子機制 突變位點或表達變化 已知 5 5 3 3 RFLP 1 點突變的檢測 1 有限制性內(nèi)切酶位點改變 斑點雜交 反向斑點雜交AS PCR PCR SSCP PCR ASO PCR產(chǎn)物直接測序 5 5 3 3 2 無限制性酶切位點改變 在DNA序列上有一段較長序列的重新排布 包括數(shù)十個堿基到數(shù)千個堿基的丟失 插入 替換 重復(fù)和倒位等 以及染色體突變或畸變 包括染色體的易位 缺失或染色三體 如唐氏綜合征 等 2 基因重排的檢測 核酸分子探針雜交與PCR BamHI BamHI 2 1 2 10kb 14kb 珠蛋白生成障礙性貧血的直接基因診斷 珠蛋白基因不同程度的缺失可引起不同類型的 珠蛋白生成障礙性貧血 根據(jù)引物3 端的互補與否 設(shè)計一對與正?；蛲蛔兡０迮鋵Φ奶禺愐?等位基因特異PCRAS PCR allelespecificPCR 3 基因表達異常的檢測mRNA的相對定量分析mRNA的絕對定量分析mRNA長度分析 二 間接診斷途徑 1 采用原因致病基因未知或基因結(jié)構(gòu)不確定致病突變機制不清致病位點不便檢測 DNA多態(tài)性 指群體中的DNA分子存在至少兩種不同的類型 即個體間同一染色體的相同位置上核苷酸序列存在一定的差異或變異 多在進化中形成 本身并不致病 只是與某些遺傳性致病基因有一定連鎖關(guān)系 2 遺傳標(biāo)記 間接診斷 檢測與致病基因連鎖的遺傳標(biāo)記 三代遺傳標(biāo)記 RFLP 基于核酸分子雜交技術(shù) VNTR variablenumberoftandemrepeats STR shorttandemrepeats SNP singlenucleotidepolymorphism 7 6kb 13kb 患者 正常 HBS的間接基因診斷 RFLP標(biāo)記的連鎖分析 Hap 7 6kb 13kb Southern印跡雜交 NHP N 正常 H 雜合子 P 患者 純合子 黃色區(qū)域為探針 第二節(jié)遺傳病的基因診斷GeneDiagnosisofHereditaryDiseases 一 血紅蛋白病 hemoglobinopathy 一 鐮狀細(xì)胞貧血病 二 珠蛋白生成障礙性貧血癥二 血友病 Hemophilia 甲型血友病基因診斷三 脆性X綜合征 一 鐮狀細(xì)胞貧血病 一 血紅蛋白病 1 鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因診斷 ASO雜交法2 HBS的限制性內(nèi)切酶譜分析3 HBS的PCR RFLP分析 正常的 N 的ASO探針 5 ACTCCTGAGGAGAAGTCTGC 3 突變的 M 的ASO探針 5 ACTCCTGTGGAGGAAGTCTGC 3 1 鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因診斷ASO雜交法 斑點雜交結(jié)果N 正常 M突變 鐮狀紅細(xì)胞貧血患者ASO雜交法檢測 N ASO M ASO 正常突變突變純合子雜合子純合子 5 3 正?；?1 15kb CCTGAGG 突變基因 1 35kb CCTGTGG 鐮狀紅細(xì)胞貧病的限制性內(nèi)切酶譜分析 Mst 酶切位點 CCTNAGG 2 HBS的限制性內(nèi)切酶譜分析 目錄 0 2kb 1 15kb 1 35kb 正常人 突變攜帶者 患者 鐮狀紅細(xì)胞貧血病的限制性內(nèi)切酶譜分析 目錄 3 HBS的PCR RFLP分析 正常人的擴增產(chǎn)物經(jīng)Mst 消化可生成54bp和56bp兩個片段 而鐮狀細(xì)胞貧血癥患者的DNA片段不被酶切 仍為110bp 雜合子可見三條帶 正常人 雜合體 患者 Marker 1 PCR RFLP分析 珠蛋白生成障礙性貧血癥基因密碼子17突變的檢測M pBR322DNA MspI 1 未酶解片段 2 bA bA 3 bA bT 4 bT bT注 由于54 bp 114bp 72bp片段及分子量標(biāo)準(zhǔn)中低于200bp的片段太小 在0 8 的瓊脂糖凝膠中不易被觀察到 二 珠蛋白生成障礙性貧血癥 珠蛋白生成障礙性貧血癥的反向斑點雜交分析 2 反向斑點雜交 二 血友病 Hemophilia 甲型血友病是由于血漿凝血因子VIII FVIII 缺陷造成 甲型血友病的基因突變類型已有300余種 其中點突變占174種 另有部分患者是由于缺失或插入突變或內(nèi)含子22的基因倒位所致 1 FVIII基因倒位的DNA印跡分析 將基因組DNA用NcoI DraI或BclI等內(nèi)切酶 酶切位點位于交換點兩側(cè) 消化 用特異探針進行雜交分析 正常人表現(xiàn)為21 5kb 14kb和16kb三種類型 I型倒位患者表現(xiàn)為20 17 5和14kb三種類型 型倒位患者表現(xiàn)為20 16和15 5kb三種帶型 在一些重型甲型血友病家系中還有其他異常帶型出現(xiàn) 2 FVIII基因突變的檢測 1 依賴于FVIII基因內(nèi)或旁側(cè)的多態(tài)性標(biāo)記的連鎖分析 2 RFLP連鎖分析 3 VNTR分析 4 短串聯(lián)重復(fù)序列 STR 的連鎖分析 三 脆性X綜合征 脆性X智力低下基因1 FMR1 5 非翻譯區(qū)遺傳不穩(wěn)定的 CGG n三核苷酸重復(fù)序列的異常擴增以及相鄰CpG島的異常甲基化 正常人中約為8 50拷貝 男性和女性攜帶者增多到52 200拷貝 相鄰的CpG島未被甲基化 稱為前突變 premutation 男性患者和脆性部位高表達的女性中 達到200 1000拷貝 相鄰的CpG島也被甲基化 稱為全突變 fullmutation 全突變可關(guān)閉相鄰FMR1基因的表達 FMR1mRNA在幾乎所有患者不表達或只有低表達 從而出現(xiàn)臨床癥狀 脆性X綜合征常用基因診斷方法 1 PCR ASO2 DNA連鎖分析3 Souhern印跡雜交法4 PCR擴增 第三節(jié)傳染病的基因診斷GeneDiagnosisofInfectiousDiseases 目錄 一 病毒性疾病 甲型肝炎病毒 HAV HAV系RNA病毒 利用RT PCR技術(shù)可從糞便中檢測出甲型肝炎病毒的基因組RNA 乙型肝炎病毒 HBV 設(shè)計保守區(qū)序列引物 擴增各型HBVDNA片段 設(shè)計位于可變區(qū)的引物擴增某一亞型HBVDNA 以便分型 丙型肝炎病毒 HCV HCV為正鏈RNA病毒 先反轉(zhuǎn)錄成cDNA 再進行巢式PCR檢測HCV 目錄 二 細(xì)菌引起的疾病 結(jié)核分枝桿菌先設(shè)計一對特異性引物 用PCR技術(shù)擴增出一383bp序列 再用探針雜交 靈敏度可達到100個細(xì)菌水平 幽門螺桿菌 HP 主要采用PCR技術(shù) 檢測HP染色體DNA特異片段 檢測HP尿素酶A基因 用PCR RFLP鑒別HP菌株 三 寄生蟲及衣原體感染 瘧原蟲卡氏肺孢子蟲衣原體感染診斷方法 核酸雜交和PCR技術(shù) 第四節(jié)腫瘤的基因診斷GeneDiagnosisofMalignantTumors 一 原癌基因與抑癌基因的檢測二 常見腫瘤的基因診斷乳腺癌結(jié)腸癌 一 原癌基因與抑癌基因的檢測 1 原癌基因的檢測ras基因家族由H ras K ras和N ras組成 最常見的突變是第12 13 59或第61位密碼子的點突變 胰腺癌 結(jié)腸癌 肺癌以K ras突變?yōu)橹?如第12位密碼子突變 由編碼甘氨酸的GGT突變?yōu)門GT GTT或GAT 少數(shù)突變?yōu)镚CT 急性淋巴細(xì)胞白血病 慢性淋巴細(xì)胞白血病等以N ras突變?yōu)橹?泌尿系統(tǒng)腫瘤則以H ras突變?yōu)橹?PCR及PCR SSCP分析 擴增ras基因第12位密碼子點突變部位 再用SSCP技術(shù)進行分析 或者直接測序確定患者ras原癌基因的點突變 核苷酸雜交技術(shù) 如ASO 檢測ras基因第12位密碼子點突變 2 ras原癌基因突變常用的檢測方法 3 抑癌基因p53的檢測 p53基因以密碼子第175位 第248位 第249位 第273位及第282位點突變率最高 在結(jié)直腸癌 乳腺癌 小細(xì)胞肺癌 都可見異常的p53基因蛋白 p53的基因診斷方法有 1 PCR SSCP分析技術(shù) 2 DNA序列分析 3 PCR RFLP分析 一 乳腺癌 1 乳腺癌常見基因變異5 10 乳腺癌患者有家族遺傳性 乳腺癌高危家族中常有抑癌基因的BRCA基因 breastcancergene 的突變 BRAC1突變易致乳腺癌 突變分布于整個編碼序列 沒有明顯的突變簇或突變熱點 70 的缺失或插入導(dǎo)致編碼序列的框移和翻譯提前終止 BRCA1在N端的一半部位截短 與乳腺癌和卵巢癌的高風(fēng)險相關(guān) 而在C端截短則主要與乳腺癌高危有關(guān) BRCA2基因在30 40 的散發(fā)性乳腺癌有雜合性缺失 LOH 突變提高乳腺癌易感性 二 常見腫瘤的基因診斷 1 PCR法檢測BRCA1基因突變 2 熒光原位雜交 FISH 檢測BRCA2基因擴增 2 乳腺癌基因診斷方法 二 結(jié)腸癌 1 結(jié)腸癌常見基因變異在癌發(fā)展過程的不同階段發(fā)生不同的基因突變 APC adenomatouspolyposiscoli 是結(jié)腸癌發(fā)生過程中第一個突變基因 K ras原癌基因突變也是結(jié)腸癌形成的早期事件 DCC deletionofcolorectalcancer 基因失活是結(jié)腸癌發(fā)展的晚期事件 抑癌基因DPC4和MADR2也可能會因18q等位基因丟失而失活 p53基因的突變是結(jié)腸癌發(fā)展過程的晚期現(xiàn)象 DNA修復(fù)基因也與結(jié)腸癌有關(guān) 如hMSH2 hMLH1 hPMS1或hPMS2基因的突變所致的DNA錯配修復(fù)缺陷與遺傳性非息肉性結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān) 二 常見腫瘤的基因診斷 1 PCR SSCP法 對腺瘤樣息肉病人APC基因PCR SSCP技術(shù)進行分析 2 異源雙鏈PCR法 檢測APC基因變異 3 蛋白質(zhì)免疫印跡法 檢測因基因突變而縮短了的APC蛋白 2 結(jié)腸癌基因診斷方法 第五節(jié)基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用ApplicationofGeneDiagnosisinForensicMedicine 目錄 重復(fù)序列以各自核心序列 重復(fù)單元 首尾相連多次重復(fù) 稱為串聯(lián)重復(fù)序列 其重復(fù)次數(shù)在人群中存在變異 形成多態(tài)性 串聯(lián)重復(fù)序列散在分布于染色體上 重復(fù)單位6 25bp長 稱為小衛(wèi)星DNA 重復(fù)單位2 6bp長 如 TA n CGG n等 稱為微衛(wèi)星DNA 一 DNA指紋與多態(tài)性遺傳標(biāo)記 可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列 VNTR 人類染色體上小衛(wèi)星DNA的高度可變區(qū) HVR 是由頭尾相連的串聯(lián)重復(fù)序列 tandemrepeat TR 組成 TR的核心序列同源性很高 等位HVR的長度由于TR的重復(fù)次數(shù)不同而有很大的差別 具高度多態(tài)性 DNA長度多態(tài)除可用Southern印跡雜交法檢測外 還可以通過PCR擴增后電泳來檢出 擴增片段長度多態(tài) amplifiedfragmentlengthpolymorphism Amp FLP 1985年 英國遺傳學(xué)家Jeffeys等人用TR的核心序列為探針進行RFLP分析時 檢測到許多HVR 并產(chǎn)生相應(yīng)的圖譜 所得圖譜具有高度的個體特異性 達到了如同人類指紋那樣的高度專一性 所以稱其為DNA指紋圖譜 DNAfingerprinting AlecJohnJeffreysOxford UnitedKingdom 目錄 人類DNA指紋圖 二 DNA指紋與法醫(yī)學(xué)診斷 個體識別和親子鑒定 DNA指紋技術(shù)是從基因水平檢測DNA的高度多態(tài)性 個體識別率高 以往在刑事案件的法醫(yī)學(xué)鑒定中應(yīng)用的是血型 血清蛋白型 紅細(xì)胞酶型和HLA分型 個體分辨能力不夠 只能排除 不能做到統(tǒng)一認(rèn)證 法醫(yī)案檢中的基因診斷技術(shù) VNTR 可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列 小衛(wèi)星 的核酸分子雜交分析STR 短串聯(lián)重復(fù)序列 微衛(wèi)星 的PCR分析SNP的基因芯片檢測 1 單位點探針檢測及PI值的計算 父權(quán)指數(shù) PaternityIndex PI 值 父權(quán)相對指數(shù)或親子關(guān)系概率值計算方法基本一致 PI值表示爭議父作為親父比隨機男人作為親父的可能性大多少倍 PI值大于1表示傾向肯定父子關(guān)系 數(shù)值越大 可能性越大 等于0時表示排除父子關(guān)系 2 DNA指紋圖與親權(quán)鑒定 多位點VNTR系統(tǒng)和DNA指紋圖的電泳分離后片段數(shù)目較多 各等位基因頻率分布的計算復(fù)雜 進行親權(quán)鑒定和個體識別時匹配概率的計算影響因素較多 目前尚無一個公認(rèn)的最合理的計算方法 目前解決親權(quán)糾紛最簡單的辦法是先在孩子DNA指紋圖中找出非母片段并計數(shù)為P 然后分析爭議父DNA指紋圖 看P條非母帶在爭議父中出現(xiàn)多少條 親權(quán)鑒定與DNA指紋圖由此圖可推斷出 A和C是親生女兒 B為妻子和其前夫所生 D為養(yǎng)女 第六節(jié)基因治療的概念及策略ConceptandStrategyofGeneTherapy 目錄 基因治療 指將目的基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 病毒載體介導(dǎo)或者非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi) 目的基因表達產(chǎn)物對疾病起治療作用 目錄 狹義基因治療 指目的基因?qū)氚屑?xì)胞后與宿主細(xì)胞內(nèi)的基因發(fā)生整合 成為宿主基因組的一部分 目的基因表達產(chǎn)物起治療疾病的作用 廣義基因治療 外源正?；?qū)氩∽兗?xì)胞 產(chǎn)生正?；虻谋磉_產(chǎn)物以補充缺失的或失去正常功能的蛋白質(zhì) 采用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)抑制細(xì)胞內(nèi)過度表達的基因 將特定的基因?qū)敕遣∽兗?xì)胞 在體內(nèi)表達特定產(chǎn)物 向功能異常的細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞 中導(dǎo)入該細(xì)胞中本來不存在的基因 如自殺基因 利用這些基因的表達產(chǎn)物達到治療疾病的目的 目錄 本節(jié)內(nèi)容提要 一 基因治療的策略二 基因轉(zhuǎn)移技術(shù)三 基因干預(yù)四 基因治療的應(yīng)用研究五 基因治療的前景與問題 目錄 基因治療分類 體細(xì)胞 somaticcell 基因治療生殖細(xì)胞 germline 基因治療 只限于某一體細(xì)胞的基因的改變只限于某個體的當(dāng)代對缺陷的生殖細(xì)胞進行矯正當(dāng)代及子代 一 基因治療的策略 一 基因置換 genereplacement 定義 指將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞 通過定位重組 導(dǎo)入的正常基因 以置換基因組內(nèi)原有的缺陷基因 目的 將缺陷基因的異常序列進行橋正 對缺陷基因的缺陷部位進行精確的原位修復(fù) 不涉及基因組的任何改變 定向整合的條件 轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體與基因組DNA具有相同的序列 帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點 進行部分基因序列的交換 基因同源重組技術(shù)又稱為基因打靶 genetargeting 細(xì)胞內(nèi)基因同源重組的發(fā)生率很低 基因同源重組技術(shù) 二 基因添加 geneaugmentation 定義 通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達其本身不表達的基因 類型 在有缺陷基因的細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正?；?而細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去 通過導(dǎo)入正常基因的表達產(chǎn)物 補償缺陷基因的功能 向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來不表達的基因 利用其表達產(chǎn)物達到治療疾病的目的 三 基因干預(yù) geneinterference 定義 采用特定的方式抑制某個基因的表達 或者通過破壞某個基因的結(jié)構(gòu)而使之不能表達 以達到治療疾病的目的 定義 將 自殺 基因?qū)胨拗骷?xì)胞中 這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物 誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生 自殺 效應(yīng) 從而達到清除腫瘤細(xì)胞的目的 應(yīng)用 是惡性腫瘤基因治療的主要方法之一 四 自殺基因治療 SuicideGeneTherapy 自殺基因的作用機制 TK GCV單純皰疹病毒 herpssimplexvirus HSV 型胸苷激酶 thymidinekinase tk 基因編碼胸苷激酶 特異性地將無毒的核苷類似物丙氧鳥苷 ganciclovir GCV 轉(zhuǎn)變成毒性GCV三磷酸核苷 后者能抑制DNA聚合酶活性 導(dǎo)致細(xì)胞死亡 1 自殺基因系統(tǒng) 定義 自殺基因 導(dǎo)入后 不僅使轉(zhuǎn)導(dǎo)了 自殺基因 的腫瘤細(xì)胞在用藥后被殺死 而且與其相鄰的未轉(zhuǎn)導(dǎo) 自殺基因 的腫瘤細(xì)胞也被殺死 2 旁觀者效應(yīng) bystandereffect 五 基因免疫治療 通過將抗癌免疫增強的細(xì)胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織 以增強腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應(yīng) 二 基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 基因治療的兩種途徑 載體 目的基因 invivo exvivo 靶細(xì)胞 目錄 基因轉(zhuǎn)移 genetransfer 技術(shù) 1 病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移2 非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 1 病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高 因此它也是使用最多的基因治療載體 據(jù)統(tǒng)計 有72 的臨床實驗計劃和71 的病例使用了病毒載體 其中用得最多的是反轉(zhuǎn)錄病毒載體 反轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)及生活周期 1 反轉(zhuǎn)錄病毒 兩端各有一長末端重復(fù)序列LTR 反轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點 LTR由U3 R和U5三部分組成 病毒有三個結(jié)構(gòu)基因 5 端LTR下游有一段病毒包裝所必需的序列 及剪接供體位點 SD 和剪接受體位點 SA 含有負(fù)鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點 PBS 和正鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點 在U3內(nèi)有增強子和啟動子 U3和U5兩端分別有病毒整合序列 IS 在R內(nèi)還有poly A 加尾信號 gag基因 編碼核心蛋白和屬特異性抗原 pol基因 編碼反轉(zhuǎn)錄酶 env基因 編碼病毒外殼或包膜糖蛋白 包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白 反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 由兩部分組成 反轉(zhuǎn)錄病毒載體 其基因組為缺陷型 保留了病毒的包裝信號 而缺失病毒的包裝蛋白基因 它可以克隆并表達外源治療基因 但不能自我包裝成有增殖能力的病毒顆粒 輔助細(xì)胞株 如PA317 由另一種缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒 即帶有全套病毒包裝蛋白基因 但缺失包裝信號 的反轉(zhuǎn)錄病毒 感染構(gòu)建而成 能合成包裝蛋白 用于反轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝 但本身卻不能包裝成輔助病毒顆粒 Retroviralpackagingsystem 反轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點 反轉(zhuǎn)錄病毒包膜上env編碼的糖蛋白 能夠被許多哺乳動物細(xì)胞膜上的特異性受體識別 從而使反轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進入靶細(xì)胞 反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag env和pol的缺失不影響其他部分的活性 前病毒通過LTR高效整合至靶細(xì)胞基因組中 有利于外源基因在靶細(xì)胞中的永久表達 包裝好的假病毒顆粒 攜帶目的基因的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體 以出芽的方式分泌至輔助細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中 易于分離制備 反轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點 隨機整合 有插入突變 激活癌基因的潛在危險 反轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小 只能容納7kb以下的外源基因 2 腺病毒 adenovirus 載體腺病毒是一種大分子 36kb 雙鏈無包膜DNA病毒 它通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入細(xì)胞內(nèi) 然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi) 保持在染色體外 不整合進入宿主細(xì)胞基因組中 腺病毒是人類呼吸道感染的病原體 但目前尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián) 宿主細(xì)胞范圍廣 可感染分裂和非分裂終末分化細(xì)胞 如神經(jīng)元等 目錄 腺病毒的優(yōu)點 基因?qū)胄矢?對人類安全 宿主范圍廣 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞分裂無關(guān) 重組腺病毒可通過口服經(jīng)腸道吸收 或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注 腺病毒載體容量較大 可插入7 5kb外源基因 目錄 腺病毒載體缺點 宿主的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腺病毒載體表達短暫 有兩個環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒 靶向性差 不能整合到靶細(xì)胞的基因組DNA中 分裂增殖快的細(xì)胞 導(dǎo)入的重組病毒載體 隨分裂而丟失的機會增多 表達時間相對較短 3 腺病毒相關(guān)病毒載體一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒 其基因組DNA小于5kb 無包膜 外形為裸露的20面體顆粒 AAV不能獨立復(fù)制 只有在輔助病毒 如腺病毒 單純皰疹病毒等 存在時 才能進行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染 否則只能建立溶源性潛伏感染 StructureofAAVVirusGenomicDNA REP 病毒復(fù)制基因 CAP 編碼衣殼蛋白的基因 ITR 反向末端重復(fù)序列 AAV的特點 以潛伏感染為主 病毒基因組與細(xì)胞共存 只要宿主細(xì)胞正常 AAV基因表達被抑制而維持潛伏狀態(tài) 若細(xì)胞受刺激 表達應(yīng)激基因 AAV基因表達從而使AAV病毒復(fù)制 產(chǎn)生子代病毒并釋放 又感染新的細(xì)胞 建立新的潛伏狀態(tài) AAV載體是目前正在研究的一類新型安全載體 它對人類無致病性 AAV可以高效定點整合至人19號染色體的特定區(qū)域19q13 4中 并能較穩(wěn)定地存在 這種靶向定點整合可以避免隨機整合可能帶來的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險性 而且外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達 并可受到周圍基因的調(diào)控 兼具反轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體兩者的優(yōu)點 目錄 AAV載體的缺陷 常用基因治療載體 7 5kb 2 非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 1 脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便 成本低廉 基本原理 利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后 可以自動形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體 然后與細(xì)胞一起孵育 即可通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA 即目的基因 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi) 并進行表達 脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖 目錄 2 受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù) 將DNA與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián) 可使DNA具有靶向性 這種偶聯(lián)通常通過多聚陽離子 如多聚賴氨酸 來實現(xiàn) 多聚陽離子與配體共價連接后 又通過電荷相互作用與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合 將DNA包圍 只留下配體暴露于表面 這樣形成的復(fù)合物可被帶有特異性受體的靶細(xì)胞吞飲 從而將外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞 受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)示意圖 目錄 3 基因直接注射技術(shù)不需要進行基因工程的繁瑣操作 直接將裸露DNA注入動物肌肉或某些器官組織內(nèi) 動物實驗表明 接受注射外源DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應(yīng)的蛋白質(zhì) 并能維持?jǐn)?shù)月之久 將促進心臟血管生長的基因直接注入實驗鼠的心臟 可使其心臟壁內(nèi)毛細(xì)血管增加30 40 將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細(xì)胞 能分泌糖尿病所缺少的胰島素 肌內(nèi)注射凝血因子 基因 可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子 基因直接注射法的優(yōu)點 制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒DNA重組體的技術(shù)較容易 排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用 導(dǎo)入的基因不需整合即可表達 避免了反轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入整合后 一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)的缺點 基因直接注射法可反復(fù)使用 而病毒載體則可能誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答 致使反復(fù)治療效果下降 三 基因干預(yù) geneinterference 一 反義RNA antisenseRNA 1 反義RNA與基因表達調(diào)控利用反義RNA對體外培養(yǎng)的細(xì)胞進行基因表達調(diào)控 通常采用的方法有兩種 1 體外合成反義RNA 直接作用于培養(yǎng)細(xì)胞 細(xì)胞吸收RNA后 發(fā)揮作用 2 構(gòu)建一些能轉(zhuǎn)錄反義RNA的重組質(zhì)粒 將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中 轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用 反義RNA的關(guān)鍵技術(shù)問題 反義RNA進入靶細(xì)胞前的降解問題 專一性轉(zhuǎn)移問題 2 受體介導(dǎo)反義RNA技轉(zhuǎn)移術(shù) 受體介導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)移十分專一 而且效率高 被轉(zhuǎn)移的RNA是被保護的 與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護層 可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用 借助前述的受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法 可以實現(xiàn)受體介導(dǎo)的反義RNA轉(zhuǎn)移 3 反義RNA的優(yōu)點 受體介導(dǎo)的反義RNA基因治療有其自身的優(yōu)點 而在一定程度上補充了轉(zhuǎn)基因治療的不足 l 安全性高 2 反義RNA設(shè)計和制備方便 3 具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng) 4 能直接作用于一些RNA病毒 二 核酶 ribozyme 天然核酶多為單一的RNA分子 具有自我剪切作用 但核酶也可以由兩個RNA分子組成 在基因治療時 利用核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當(dāng)?shù)牟课?形成錘頭狀核酶結(jié)構(gòu) 將靶RNA分子切斷 通過破壞靶RNA分子而達到治療疾病的目的 核酶錘頭狀的二級 三級結(jié)構(gòu) 只要兩個RNA分子通過互補序列相結(jié)合 形成錘頭狀的二級結(jié)構(gòu) 3個螺旋區(qū) 并能組成核酶的核心序列 13個或11個保守核苷酸序列 就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應(yīng) 目錄 1 核酶的設(shè)計 核酶是通過靶RNA分子與核酶分子共同組成酶活性結(jié)構(gòu)域 要從靶分子和核酶分子兩個方面來設(shè)計核酶 1 選擇合適的靶部位 該部位具有核酶切割位點 能與核酶分子結(jié)合并組成酶活性結(jié)構(gòu)域 2 核酶的基本組成 用于基因治療的核酶分子由三個部分組成 中間是保守序列 能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域 兩端是引導(dǎo)序列 核酶的作用機制 2 核酶的應(yīng)用 與一般的反義RNA相比 核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu) 不易受到RNA酶的攻擊 更重要的是 核酶在切斷mRNA后 又可從雜交鏈上解脫下來 重新結(jié)合和切割其它的mRNA分子 三 干擾RNA 1 RNA干擾現(xiàn)象RNA干擾 RNAinterference RNAi 是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象 在此過程中 與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA mRNA 被降解 從而抑制該基因的表達 有義RNA senseRNA 或反義RNA antisenseRNA 均能抑制線蟲基因的表達 雙鏈RNA比單鏈RNA更為有效 這與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)的解釋正好相反 而且其抑制基因表達的效率比反義RNA至少高2個數(shù)量級 2 RNA干擾的機制 RNA干擾過程主要有2個步驟 1 小干擾性RNA siRNA 2 siRNA與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體 稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體 RNA inducedsilencingcomplex RISC 該復(fù)合體可識別與siRNA有同源序列的mRNA 并在特異的位點將該mRNA切斷 長雙鏈RNA被細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21 23個堿基對的短雙鏈RNA 稱為小干擾性RNA smallinterferingRNA siRNA RNA干擾機制示意圖 研究基因功能的新工具 由于RNA干擾技術(shù)具有高度的序列專一性和有效的干擾能力 可以使特定基因沉默或功能喪失 因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強有力的研究工具 RNA干擾技術(shù)能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達 建立多種表型 抑制基因表達的時間可以控制在發(fā)育的任何階段 1 體外化學(xué)合成 2 用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地生成 siRNA的產(chǎn)生 四 基因治療的應(yīng)用研究 一 遺傳病的基因治療研究 一 遺傳病基因治療必須符合以下要求1 在DNA水平明確其發(fā)病原因及機制 2 必須是單基因遺傳病 而且屬隱性遺傳 3 該基因的表達不需要精確調(diào)控 4 該基因能在一種便于臨床操作的組織細(xì)胞中表達并發(fā)揮其生理作用 5 該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴(yán)重后果 如不治療難以存活等 可供選擇并符合上述4條以上要求的不過只有30余種遺傳病 腺苷脫氨酶 ADA 和嘌呤核苷磷酸化酶 PNP 缺乏癥珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白病血友病和其他血漿蛋白缺乏癥苯丙酮酸尿癥和其他先天性代謝缺陷病萊 納 Lesch Nyhan 綜合征家族性高膽固醇血癥囊性纖維化病 目錄 二 惡性腫瘤基因治療研究 1 通過基因置換和基因補充 導(dǎo)入多種抑癌基因以抑制癌癥的發(fā)生 發(fā)展和轉(zhuǎn)移 腫瘤發(fā)生是一個極為復(fù)雜的過程 許多基因的突變會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生 2 抑制癌基因的活性 通過干擾癌基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯 發(fā)揮抑癌作用 3