病毒感染的微生物學(xué)檢查方法.ppt

病毒感染的檢查方法 一 標(biāo)本采集與送檢 原則 1 盡早采取 發(fā)病初期2 部位適宜 由感染部位采取3 冷藏速送 裝有冰塊或干冰的容器內(nèi) 一 供分離病毒 檢出核酸及抗原的標(biāo)本 二 檢測特異性抗體的標(biāo)本采集雙份血清 4 20 保存 病毒分離是診斷病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn) 一旦陽性 即可確診 不適用于快速診斷 操作復(fù)雜 實(shí)驗(yàn)成本高 陽性檢出率低等有時(shí)不得不分離病毒 例如發(fā)現(xiàn)了一種新的病毒病 必須分離病毒進(jìn)行研究 或者分離株的鑒定對流行病學(xué)有很大作用 如流感病毒 或者需要培育疫苗 或者希望獲得天然弱毒株等 二 常規(guī)分離與鑒定 一 病毒分離 二 病毒鑒定 1 形態(tài)學(xué)鑒定 觀察CPE 常見的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化為細(xì)胞變圓 壞死 溶解 脫落或形成合胞體 有些病毒能形成包涵體 正常細(xì)胞 病變細(xì)胞 感染細(xì)胞具有吸附紅細(xì)胞的能力感染細(xì)胞的培養(yǎng)液中有許多游離病毒存在 具有凝集紅細(xì)胞的作用 2 血吸附和血凝作用 多見于以出芽方式釋放的病毒 紅細(xì)胞吸附 正常細(xì)胞 1 血吸附作用 吸附試驗(yàn)可通過特異抗血清抑制來達(dá)到鑒定具有吸附特性的病毒 2 血凝作用 血凝試驗(yàn) 血凝抑制試驗(yàn) 3 病毒成分的直接檢測 用免疫學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)直接檢查感染細(xì)胞或其上清液中病毒抗原 或核酸 三 電子顯微鏡檢查 病毒的很多特征如大小 形態(tài) 結(jié)構(gòu)等必須借助電子顯微鏡進(jìn)行檢查 對于目前尚難培養(yǎng)而形態(tài)又非常典型的病毒 可直接從感染組織或分泌液 或者接種病料的雞胚和細(xì)胞培養(yǎng)收獲的材料作電子顯微鏡檢查 直接觀察病毒粒子 透射電子顯微鏡 1 正染法 超薄切片法 雞痘病毒 超薄切片 超薄切片法的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 可觀察病毒形態(tài)和形態(tài)發(fā)生過程缺點(diǎn) 操作復(fù)雜 費(fèi)時(shí) 但標(biāo)本可長時(shí)間保存 2 負(fù)染技術(shù) 負(fù)染是指通過重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強(qiáng)樣品外周的電子密度 使樣品顯示負(fù)的反差 襯托出樣品的形態(tài)和大小 口蹄疫病毒的電鏡負(fù)染 負(fù)染法的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 快速簡易 10 20min 分辨率高 圖象清晰地病毒結(jié)構(gòu)缺點(diǎn) 敏感性低 要求病毒量在107以上 所有樣品應(yīng)處于懸浮狀態(tài) 免疫電鏡技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與電子顯微鏡的高分辨力相結(jié)合 在亞細(xì)胞和超微結(jié)構(gòu)水平上對抗原物質(zhì)進(jìn)行定位分析的一種高度精確 靈敏的方法 3 免疫電鏡技術(shù) Immuneelectronmicroscopy IEM 1 免疫凝集電鏡技術(shù) 抗原與抗體凝集反應(yīng)后 可使標(biāo)本中病毒顆粒聚集成團(tuán) 再經(jīng)負(fù)染直接在電鏡下觀察 提高了敏感性 確定病毒的血清學(xué)性質(zhì) 2 免疫電鏡定位技術(shù) 特異性抗體用電子致密物質(zhì) 如鐵蛋白 過氧化物酶等標(biāo)記后 使之與組織超薄切片中的抗原結(jié)合 在電鏡下觀察到標(biāo)記物所在位置 即為抗原抗體反應(yīng)的部位 酶標(biāo)記染色 四 血清學(xué)試驗(yàn) 是一種常用的診斷病毒病的方法 可采用ELISA 瓊脂擴(kuò)散 中和試驗(yàn) 標(biāo)記抗體技術(shù)等免疫血清學(xué)方法檢查病畜的抗體消長情況和發(fā)病組織中的病毒抗原 virus 1 中和反應(yīng) 觀察特異性抗體能否保護(hù)易感的試驗(yàn)動(dòng)物死亡 能否抑制病毒的細(xì)胞病變效應(yīng) 凡能與病毒結(jié)合 使其失去感染力的抗體又稱中和抗體 2 補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng) 溶血 不溶血 3 免疫擴(kuò)散 4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ELISA 將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相裁體上 并保持其免疫活性 測定時(shí) 將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng) 然后加入酶的作用底物催化顯色 進(jìn)行定性或定量測定 1 間接ELISA 2 夾心ELISA 五 分子生物學(xué)技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng) PCR 2 核酸雜交技術(shù) 核酸探針 probe 是指能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知核酸片段 可檢測待檢樣品中特定的基因順序 六 感染組織的組織學(xué)檢查 病毒在光學(xué)顯微鏡下無法看到 但是在某些病毒感染細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)包涵體 或者細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變