乙型肝炎病毒(HBV)實時熒光定量PCR.doc

乙型肝炎病毒（HBV）實時熒光定量PCR目的要求掌握 血清中HBV-DNA的提取方法及原理；HBV-DNA實時熒光定量PCR的測定原理； HBV-DNA實時熒光定量PCR實驗操作及結(jié)果分析了解 核酸測定引物設(shè)計原理；實時熒光定量PCR儀的工作原理及操作。教學(xué)時數(shù)講授2學(xué)時，實驗6學(xué)時。講授內(nèi)容血清中病毒DNA的提取方法和原理；實時熒光定量PCR的測定原理；核酸測定引物設(shè)計原理；HBV-DNA測定引物設(shè)計思路；HBV-DNA熒光定量PCR試劑組成、相應(yīng)作用及反應(yīng)混合液配制；實時熒光定量PCR儀的工作原理及操作實驗內(nèi)容分組提取血清中HBV-DNA；配制反應(yīng)液并上機操作，實時觀察，結(jié)果分析；實驗結(jié)果討論；實驗總結(jié)自學(xué)內(nèi)容“感染性疾病的分子診斷”實驗指導(dǎo)（自編） 實驗 乙型肝炎病毒（HBV）實時熒光定量PCR【原理】Real time PCR 是普通PCR 的一項改進，使用了針對擴增DNA 的熒光物質(zhì)，使得DNA的數(shù)量與檢測到的熒光強度成線性關(guān)系，大致得到DNA 的擴增曲線，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。即對DNA靶分子的起始拷貝數(shù)進行定量的核酸檢測。該方法精確、靈敏、特異性強、污染途徑小、自動化程度高、操作簡單。是國際公認(rèn)的核酸分子定量的標(biāo)準(zhǔn)方法。它已逐漸代替了Northern blotting 以及semi RT-PCR技術(shù)。本實驗從HBV攜帶者或者乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因組DNA，采用核酸擴增結(jié)合TaqMan熒光探針技術(shù), 利用一對乙肝病毒特異性引物和一特異性結(jié)合于擴增區(qū)另一位點的TaqMan探針, 實現(xiàn)對乙肝病毒模板的擴增和檢測。使用商品化試劑盒：HBV實時熒光定量試劑盒，深圳匹基公司（PG，Biotech.）。針對表面抗原S基因，設(shè)計一對引物和一個探針。TaqMan熒光探針技術(shù)中，兩個熒光染料標(biāo)記在探針上，一個叫報告基團（R），一個叫淬滅基團（Q）。當(dāng)兩個熒光基團都連在探針上時，報告基團的熒光被淬滅基團抑制。在延伸中，DNA聚合酶利用53外切酶活性把報告基團從探針上切下來。一旦和淬滅基團分開，報告基團釋放出熒光。通過監(jiān)測熒光信號的積累來反映乙肝病毒DNA的擴增.產(chǎn)物的積累，根據(jù)擴增反應(yīng)的動力學(xué)特征使用外部標(biāo)準(zhǔn)曲線對初始模板定量（圖4）。 圖4：TaqMan熒光探針技術(shù)原理 R:熒光報告基團 Q：熒光淬滅基團【試劑與器材】1HBV-DNA檢測試劑盒：DNA提取液1，DNA提取液2，PCR預(yù)混合液（含有Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液、dATP、dUTP、dGTP、dCTP引物、熒光標(biāo)記的探針）、Taq酶、UNG，強陽性對照血清、陰性對照血清、臨界陽性血清，四種不同濃度的陽性參控品、雙蒸去離子水。2熒光定量PCR儀3PCR反應(yīng)管4移液器及移液器吸頭5高速離心機6漩渦混合器7超凈工作臺8調(diào)溫電熱板【操作步驟】1. 試劑和主反應(yīng)混合物的準(zhǔn)備：從試劑盒中取出HBV PCR反應(yīng)液、Taq酶及UNG。室溫融化后，2000rpm離心10sec，設(shè)需要的管數(shù)為n（n=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管強陽性對照+1管室內(nèi)質(zhì)控+1管試劑空白+4管陽性參控品），40ul測試反應(yīng)體系配制如下表：試劑PCR反應(yīng)液Taq酶UNG用量37.6ul0.4ul0.06ul計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積試管中，充分混合均勻，向設(shè)定的n個PCR反映管中分別加入38ul，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。2. 樣本的制備和上樣（1）標(biāo)本處理取n個0.5ml滅菌離心管，做好標(biāo)記。首先加入100ulDNA提取液1，再分別加入待測血清或血漿樣本（切勿吸入血細(xì)胞）以及各種對照品各100ul，振蕩混勻，13000rpm離心10min：吸棄上清（離心時注意固定離心管方向，盡可能吸棄上清且不碰沉淀）；再加入25ulDNA提取液2，振蕩10sec（沉淀無需打散、混勻），100干浴，13000rpm離心10min，保留上清備用。如果樣本裂解產(chǎn)物當(dāng)天不使用，則要保存在-20。（2）上樣若樣本及對照品裂解產(chǎn)物保存在-20，使用前置室溫解凍，以13000rpm離心5min。在所設(shè)定的n個反應(yīng)管中分別加入步驟1中處理過的樣本、陰性對照、強陽性對照和室內(nèi)質(zhì)控血清、滅菌去離子水以及陽性參控品各2ul，蓋緊PCR反應(yīng)管管蓋，并記錄樣本信息。3. PCR上機擴增檢查反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器；檢查并消除反應(yīng)管底氣泡。按設(shè)置裝載反應(yīng)管，選擇或設(shè)置擴增和檢測條件：選擇預(yù)設(shè)的程序文件或設(shè)置為：370C：3min；940C：1min；950C：5sec，600C：30sec，40個循環(huán)，熒光信號收集設(shè)在600C。設(shè)置模板：設(shè)置孔位及熒光（詳見相應(yīng)儀器的操作手冊）。保存數(shù)據(jù)文件并運行。4. 結(jié)果分析（1）設(shè)置分析條件：設(shè)定基線：不同的PCR儀操作略有不同，按儀器說明書操作。PE7700:分析前把標(biāo)準(zhǔn)熒光定為TAMRA。如果沒有Ct16的強陽性樣品，應(yīng)選315個循環(huán)的平均熒光信號作為基線再分析Ct；如果有Ct16的樣品，則將此樣品定為強陽性，并將此樣品從數(shù)據(jù)庫中剔除，然后以315個循環(huán)的平均熒光信號作為基線再分析Ct。ICycler：基線一般取自設(shè)值（210）。實驗結(jié)束后，點擊PCR baseline subtract選項扣除基線值。若某些曲線出現(xiàn)無規(guī)則的起伏跳動，應(yīng)視為非正?，F(xiàn)象，此時將其從結(jié)果中剔除（點擊select wells,消除此孔彩色，然后選擇display wells）。注意調(diào)整坐標(biāo)，使所有曲線都在坐標(biāo)內(nèi)，見圖5。LightCycler：用熒光顯示模式F1/F2讀取結(jié)果?；€設(shè)定原則以剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點，且Ct值不出現(xiàn)任何數(shù)值時為準(zhǔn)（一般定在0.0010.01范圍內(nèi)，也可以根據(jù)儀器本身的實際情況加以調(diào)整）。域值設(shè)定：以剛好高于陰性對照品的擴增曲線最高點，且陰性對照品Ct=40或Ct=0為原則，調(diào)整起始域值。（2）實驗有效性判斷：檢查質(zhì)控和標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)同時符合下列條件，見圖5：（否則試驗視為無效）陰性對照、試劑空白CT值都為0強陽性對照和室內(nèi)質(zhì)控CT值不為0，且強陽性小于室內(nèi)質(zhì)控，拷貝數(shù)在105107間。標(biāo)準(zhǔn)品CT值小于38，且標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率在-3.5 -4.0間，截距在40 50間，相關(guān)系數(shù)小于-0.98。A.B.圖5 實時熒光定量PCR結(jié)果分析E8, F8, G8, H8為標(biāo)準(zhǔn)品，D8為待測樣本，C8為陰性對照；A：基線、域值設(shè)置， B.：標(biāo)準(zhǔn)曲線5. 檢測結(jié)果的報告：檢測樣本中103copies/ml HBV DNA 5107copies/ml，可直接報告相應(yīng)的拷貝數(shù)；檢測樣本中HBV DNA 103copies/ml時，均報告為 103copies/ml。檢測樣本中HBV DNA 為 0copies/ml時 ，報告為 5107copies/ml時，均報告為 5107copies/ml【注意事項】1操作中應(yīng)使用不含熒光物質(zhì)的一次性手套（經(jīng)常更換）、一次性吸頭（最好帶濾芯），并不能用手直接接觸擴增管。2操作臺、離心機、移液器、PCR擴增儀等應(yīng)定期用10%次氯酸鈉或70%酒精擦拭去污染。3熒光探針應(yīng)避光保存，配制好反應(yīng)液體系，應(yīng)盡快上機擴增。4配置反應(yīng)體系時，應(yīng)注意移液器的使用方法，所有液體的混勻要使用振蕩器進行，不能用移液器吹打。5所有試劑開蓋前，應(yīng)短暫離心。6配制反應(yīng)體系過程中若需標(biāo)記，請在試管或離心管架上標(biāo)記，不要直接標(biāo)記在擴增管上。【思考題】通常PCR有典型的變性-退火-延伸三個溫度點，為何本實驗擴增溫度循環(huán)只有兩溫度點：950C：5sec，600C：30sec，40個循環(huán) ？1.一般典型陽性的擴增曲線有對數(shù)生長期（熒光信號呈指數(shù)上升，曲線平直且有一定斜率），以及平臺期（熒光信號無明