細菌的純種分離.doc

細菌的純種分離、培養(yǎng)和接種技術及菌落形態(tài)的觀察班級：09環(huán)科二班姓名：李建文學號：200930260213一、 實驗目的：（1）熟悉玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準備工作。（2）了解配制微生物培養(yǎng)基的基本原理，掌握常規(guī)的配制、分裝培養(yǎng)基的方法。（3）學會各類物品的包裝、配制（稀釋水等）和滅菌技術。（4）從湖水中分離、培養(yǎng)微生物，掌握常用的分離微生物的方法。（5）學會接種技術。（6）觀察分離出來的幾種細菌的個體形態(tài)及與其相應的菌落形態(tài)特征。（7）通過觀察和比較細菌、放線菌、酵母菌及霉菌四大類微生物的菌落特征，達到初步鑒別上述微生物的能力二、 實驗原理：1、培養(yǎng)基原理：培養(yǎng)基是微生物生長的基質，是按照微生物營養(yǎng)、生長繁殖的需要，由碳、氫、氧、氮、磷、硫、鉀、鈉、鈣、鎂、鐵及微量元素和水，按一定的體積分數(shù)配制而成。調整合適的pH，經(jīng)高溫滅菌后以備培養(yǎng)微生物之用。本實驗配制固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基的成分與液體相同，僅在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑使呈固態(tài)。通常加入質量濃度15-20gL的瓊脂為固體培養(yǎng)基。2、滅菌原理:本次實驗采取加壓蒸汽滅菌法。加壓蒸汽滅菌器是能耐一定壓力的密閉金屬鍋，加壓滅菌的原理在于提高滅菌器內的蒸汽溫度來達到滅菌的目的。3、分離純化原理：本實驗使用的平板表面涂布法，是把聚集在一起的群體分散成能在培養(yǎng)基上長成單個菌落的分離方法。此法加樣量不宜太多，只能在0.5mL以下，培養(yǎng)時起初不能倒置，現(xiàn)正置一段時間等水分蒸發(fā)后倒置。4、微生物的接種原理：接種就是將一定量的微生物在無菌操作條件下轉移到另一無菌的并適合該菌生長繁殖所需的培養(yǎng)基中的過程。本次實驗采取斜面接種法，使用到的接種工具是接種環(huán)，接種環(huán)一般用電爐絲或者鎳絲，環(huán)的柄為金屬材質，其后端套上絕熱材料套。5、菌落形態(tài)觀察原理：由于微生物個體表面結構、分裂方式、運動能力、生理特性及產(chǎn)生色素的能力等各不相同，因而個體及它們的群體在固體培養(yǎng)基上生長狀況各不一樣。按照微生物在固體培養(yǎng)基上形成的菌落特征，可從菌落的形狀、大小、表面結構、邊緣結構、菌叢高度、顏色、透明度、氣味、粘滯性、質地軟硬、表面光滑粗糙等情況，初步辨別是何種類型的微生物。三、 實驗器皿和材料：1、 樣品：人工湖底泥2、 儀器：高壓蒸汽滅菌器、干燥箱、酒精燈或煤氣燈、稀釋水、試管、刻度移液管、錐形瓶、燒杯、量筒、滴管、吸水紙、鑷子、搪瓷杯、高溫滅菌鍋、移液槍（槍頭）、藥物天平、玻璃棒、玻璃珠、石棉網(wǎng)、藥匙、鐵架、表面皿、濾紙、pH試紙和棉花、接種環(huán)、酒精燈、恒溫培養(yǎng)箱、4大類菌落（培養(yǎng)皿）3、 試劑或材料：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH和瓊脂等四、 實驗步驟：（一）玻璃器皿的準備1、洗滌玻璃器皿在使用前必須洗滌干凈。培養(yǎng)皿、試管、錐形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自來水沖凈。移液管先用洗液浸泡，再用水沖洗干凈。洗刷干凈的玻璃器皿自然晾干或放入干燥箱中烘干、備用。2、包裝（1） 移液槍和槍頭的包裝：移液管的吸端用細鐵絲（或牙簽）將少許棉花塞入構成1-1.5cm長的棉塞，起過濾作用（以防細菌吸入口中，并避免將口中細菌吹入管內）。棉塞要塞的松緊適宜，吸時既能通氣，又不致使棉花滑入管內。然后將塞好棉花的移液管的尖端，放在4-5cm寬的長紙條的一端，移液管與紙條約成30度夾角，折疊包裝紙包住移液管的尖端，用左手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉，紙條螺旋式地包在移液管外面，余下的紙折疊打結，待滅菌。（2） 培養(yǎng)皿的包裝：培養(yǎng)皿由一底一蓋組成一套，用牛皮紙或報紙將10套培養(yǎng)皿（皿底朝里，皿蓋朝外，5套、5套相對而放）包好。（3） 硅膠塞：。硅膠塞四周應緊貼管壁和瓶壁，不能有折皺，以防空氣微生物沿硅膠塞折侵入。硅膠塞的直徑和長度視試管和錐形瓶的大小而定，一般約35塞入管內。試管、錐形瓶塞好硅膠塞后，用牛皮紙包裹并用細繩或橡皮筋捆扎好，放在銅絲簍內待滅菌。（二）培養(yǎng)基的配制 1. 配制溶液取一定容量的燒杯盛入100mL蒸餾水（有時也可用自來水），按培養(yǎng)基配方（0.5g牛肉膏、1g蛋白胨、0.5gNaCl、2.0g瓊脂）逐一稱取各種成分，依次加入水中溶解。蛋白胨、肉膏等可加熱促進溶解，待全部溶解后，加水補足因加熱蒸發(fā)的水量。在制備固體培養(yǎng)基加熱融化瓊脂時要注意攪拌，避免瓊脂糊底燒焦。2. 調節(jié)pH一般剛配好的培養(yǎng)基是偏酸性的，故要用質量濃度為100gL NaOH調pH至7.2-7.4.應緩慢加入NaOH，邊加邊攪拌，并不時用pH試紙測試。調整至所需的pH。3.分裝（1） 分裝試管：將培養(yǎng)基趁熱加至漏斗中。分裝時左手并排地拿數(shù)根試管，右手控制彈簧夾，將培養(yǎng)基依次加入各試管，用于制造斜面培養(yǎng)基時，一般裝量不超過試管高度（15mm*150mm）的15.分裝時謹防培養(yǎng)基沾在管口上，否則會使棉塞沾上培養(yǎng)基而造成染菌。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，Nacl 0.5g,瓊脂2.0g，水100ml,pH7.2-7.4.滅菌條件：121攝氏度（相對蒸氣壓力為0.103MPa）,20min. (2)加棉塞、包裝后滅菌。 4.斜面的制作 滅菌后如需制成斜面培養(yǎng)基，應在培養(yǎng)基冷卻至50-60攝氏度，將試管擱置成一定的斜度，斜面高度不超過試管總高度的13。（三）稀釋水的制備試管稀釋水的制備另取5支18 mm180mm的試管，分別裝9 mL蒸餾水，塞上棉塞，包扎后滅菌。（四）滅菌 加壓蒸汽滅菌法（1）向滅菌器內加入清潔軟水（蒸餾水更好）：水位應不超過水位線標志，以免水進入滅菌桶內，浸濕被滅菌物品。（2）堆放物品并注意留有空隙：將需要滅菌的物品包好后，順序放在滅菌桶內的篩板上。（3）蓋上蓋子：對稱地堅固螺栓，注意不宜旋得太緊，以免損壞橡膠密封墊圈。（4）打開電源置滅菌溫度：通過壓力-溫度控制器旋鈕預置，溫度預置范圍在109126，順時針方向旋轉旋鈕，滅菌溫度預置值減??；反之，預置值增大。 可 根據(jù)需要確定預置滅菌溫度。（5）設置滅菌時間：按照不同的需要，將計時器旋鈕按順時針方向旋至所需的時間刻度上，當達到預置的滅菌溫度時，計時指示燈亮，計時器自動計時。（6）加熱，排放冷空氣。（7）滅菌。（8）結束（關電源）：此時切忌立即放氣，一定要待指針接近“零”位時，再打開放所閥，取出物品，排掉鍋內剩余水。來過菌的培訓基冷卻后置于37恒溫箱內培養(yǎng)24h，若無菌生長則放入冰箱或者陰涼處保存?zhèn)溆?。（五）細菌的純種分離及培養(yǎng)（平板表面涂布法） （1）取樣：用無菌瓶從湖底中取一定量的活性污泥泥，迅速帶回實驗室。（2）融化培養(yǎng)基：加熱融化培養(yǎng)基，待用。（3）將1瓶90ml和5管（根據(jù)預備實驗數(shù)據(jù)變化）9mL的無菌水排列好，按10(-1)、10（-2）、10（-3）、10（-4）、10（-5）、10（-6）依次編號。在無菌操作條件下，用10mL的無菌移液管吸取10mL稀釋的樣品置于90mL無菌水（內含玻璃珠）中，將移液管吹洗3次，用手搖10min（或用混合器）將顆粒狀樣品打散，即為10(-1)濃度的混合液。用1mL無菌移液管吸取1mL10(-1)濃度菌液于9mL無菌水中，將移液管吹洗3次，搖勻，即為10（-2）濃度菌液。同法依次稀釋到10（-6）。（4）倒平板：將融化并冷卻至50攝氏度左右的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷凝后即成平板。（5）涂布：用無菌移液槍吸取一定量的經(jīng)適當稀釋的樣品液于平板上，用三角刮刀在平板上旋轉涂布均勻。（6）培養(yǎng)：送恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)（正置），如果培養(yǎng)時間較長，次日把培養(yǎng)皿倒置繼續(xù)培養(yǎng)。（六）細菌的接種（1）準備：接種前將操作臺擦凈，將所需的物品整齊有序地放在桌上，用 75%酒精擦手。（2）編號：在試管上貼標簽，注明菌號、接種日期、接種人姓名、組別等。貼在距試管口約23cm的位置。也可用記號筆注明上述內容。（3）點燃：酒精燈。（4）手持試管：將一支斜面菌種（或培養(yǎng)皿菌落）和一支待接的斜面培養(yǎng)基用大拇指和其它四指握在左手中，使中指位于兩試管之間部位。斜面面向操作者，并使它們位于水平位置，而且管口齊平。（5）灼燒接種環(huán)：右手先將硅膠塞擰松，以便接種時容易拔出。右手拿接種環(huán)，在火焰上將環(huán)燒紅以達到滅菌的目的。（6）接種：在火焰旁，用右手小指、無名指和手掌夾住硅膠塞將其拔出。試管口在火焰上微燒一周，將管口上可能沾染的少量菌或帶菌塵埃燒掉。將燒過的接種環(huán)伸入菌種管內，使環(huán)端輕觸內管壁，冷卻后取種，立即轉移至待接種試管斜面上，自斜面底部開始向上做“Z”形致密劃線直至斜面頂端。抽出接種環(huán)，試管過后塞上硅膠塞，將試管放回試管架。灼燒接種環(huán)，殺滅環(huán)上細菌。送培養(yǎng)箱（37）培養(yǎng)，待看結果。（七）菌落形態(tài)的觀察 （1）將自己培養(yǎng)的細菌菌落逐個辨認并編號，按號碼順序將各細菌的菌落特征描述、記錄。（2）繪制菌落形態(tài)圖。（3）與細菌、放線菌、酵母菌以及霉菌菌落特征進行比