TILLING(定向誘導(dǎo)基因組局部突變)技術(shù)原理及其路線.pptx

TILLING 定向誘導(dǎo)基因組局部突變 技術(shù)原理及其路線 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)齊孟文 TILLING是后基因組時(shí)代出現(xiàn)的 一種將烷基化試劑EMS或輻射誘導(dǎo)的位點(diǎn)突變技術(shù) 與特定基因的PCR擴(kuò)增技術(shù)和突變單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)或下一代基因俘獲高效測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的反相遺傳學(xué)方法 提供了一種幾乎對(duì)所有物種都適應(yīng)的 低成本 高通量和自動(dòng)化的誘發(fā)突變篩選技術(shù) 該技術(shù)也可用于天然群體自發(fā)突變的篩選 稱之為Eco TILLING 圖 基因誘變組學(xué)的正向和反向遺傳學(xué)操作的路標(biāo) 技術(shù)特點(diǎn)點(diǎn)突變是隨機(jī)分布的飽和突變 可獲得大量的等位基因系列 對(duì)長(zhǎng)度很小的基因 復(fù)等位基因等具有獨(dú)特的反向遺傳學(xué)技術(shù)優(yōu)勢(shì) 誘變頻率高 為篩選特定目的基因所需的突變?nèi)后w小 不依賴農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化或內(nèi)源標(biāo)簽系統(tǒng) 無(wú)需耗時(shí)的基因操作和繁瑣的組織培養(yǎng) 但需要預(yù)先知道所研究基因的序列 操作流程 操作流程1 用甲基磺酸乙酯處理種子誘導(dǎo)位點(diǎn)突變 2 播種誘變處理種子 按單株種植得到誘變M1代植株 3 播種M1代種子得到誘變M2代植株 自交獲得M2代種子并保存建庫(kù) 4 按單株提取M2代組織DNA 存放于96孔微孔板建庫(kù) 5 5 8倍混合單株DNA庫(kù) 構(gòu)建DNA樣品池以增加掃描通量 6 針對(duì)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)特異性引物 采用700nm和800nm熒光染料標(biāo)記引物 對(duì)DNA目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增 7 PCR的擴(kuò)增片段經(jīng)變性 退火 得到野生型和突變型堿基錯(cuò)配的異源雙鏈核酸分子 8 用特異性識(shí)別并切割錯(cuò)配堿基的核酸內(nèi)切酶cel 切割異源雙鏈核酸分子 在錯(cuò)配位點(diǎn)單鏈的3 端切開(kāi) 9 變性酶切產(chǎn)物得到完整單鏈 無(wú)突變堿基 和單鏈片段 突變點(diǎn)被切開(kāi)所致 10 酶切產(chǎn)物采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 11 用Photoshop對(duì)凝膠進(jìn)行圖像分析 如某一泳道有突變帶 則在700nm和800nm的圖像中 均會(huì)在野生型條帶下方看到一個(gè)新的條帶 這2個(gè)條帶片段大小之和等于野生型條帶長(zhǎng)度 由新增2個(gè)條帶的移動(dòng)距離可以大體上估計(jì)突變距目標(biāo)區(qū)域5 或3 的距離 12 回溯發(fā)現(xiàn)帶有突變的DNA池對(duì)應(yīng)的保存樣品 重復(fù)5 11過(guò)程鎖定突變單株 TILLING分析過(guò)程 a 1 使用熒光染料標(biāo)記基因特異性引物 對(duì)DNA池進(jìn)行PCR擴(kuò)增 2 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)熱變性 然后退火隨機(jī)復(fù)性 3 形成的錯(cuò)配雙鏈DNA分子用S1內(nèi)切酶切割 然后變性 b 切割產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定 以確定基因發(fā)生突變的DNA池 利用LI COR凝膠系統(tǒng)的IRD700和IRD800兩個(gè)通道測(cè)定5 和3 標(biāo)記的PCR產(chǎn)物 產(chǎn)物大小可以確定突變點(diǎn)在擴(kuò)增片段上的位置 在本例中大概離5 端0 2kb 3 端0 8kb的距離 圖 跑膠通道IRD800 左 和IRD700 右 的影像 誘變帶被框出 IRD700中的截圖標(biāo)在最右邊 注意一個(gè)通道的泳道浮現(xiàn)在背景上只有一個(gè)帶 另一通道是相應(yīng)的帶 二者大小相加等于擴(kuò)增產(chǎn)物的全長(zhǎng) 最上端的帶 膠下端泳道的若干的條帶是隨機(jī)錯(cuò)誤引導(dǎo)所產(chǎn)生的小片段 關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)1 誘變過(guò)程誘發(fā)突變既可采用金典的化學(xué)誘變?nèi)鏓MS 也可以采用物理誘變?nèi)巛椛湔T變 或者利用自然突變?nèi)后w 誘變過(guò)程應(yīng)進(jìn)行小規(guī)模的預(yù)實(shí)驗(yàn) 通過(guò)對(duì)誘變效率和致使效應(yīng)的折衷 選擇適合的誘變劑量 是一種單功能烷化劑 在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變成缺電子的活潑中間產(chǎn)物 容易與堿基上的 原子和磷酸基團(tuán)發(fā)生親核取代反應(yīng) 通過(guò)2條途徑使基因突變 一是堿基的烷基化效應(yīng) 鳥(niǎo)嘌呤 的 位易被烷基化 形成帶正電的季銨基團(tuán) 產(chǎn)生 種可遺傳的效應(yīng) 促進(jìn) 上的 解離 使 與 配對(duì) 導(dǎo)致 轉(zhuǎn)換成 削弱了 位的糖苷鍵 發(fā)生脫嘌呤作用 如果脫嘌呤位點(diǎn)在 復(fù)制之前未被修復(fù) 則該位點(diǎn)在復(fù)制時(shí)將隨機(jī)插入任何一個(gè)堿基 經(jīng)過(guò)一輪復(fù)制后 可能發(fā)生 到 的轉(zhuǎn)換 也可能發(fā)生 到 或 的顛換 二是磷酸基團(tuán)的烷基化效應(yīng) 磷酸基上的 原子被烷基化后 形成不穩(wěn)定的磷酸酯 容易發(fā)生水解 使核苷酸從磷酸與五碳糖間切斷 導(dǎo)致 斷裂 產(chǎn)生染色體缺失 位點(diǎn)突變引起基因功能的改變主要包括 錯(cuò)義突變 無(wú)義突變和剪接突變 2 突變?nèi)后w為了使突變能夠產(chǎn)生分離表型變異 突變?nèi)后w一般不選嵌合的M1代 而是選擇突變M2代 但是若是花粉誘變則可以選擇其M1代 如玉米品種 在知道誘變頻率的情況 產(chǎn)生目標(biāo)基因突變所需要的群體大小可以估算 3 DNA池為了提高分析通量 一般構(gòu)建8倍的DNA樣品池 如果品種的突變頻率較高 突變?nèi)后w較小時(shí) 樣品池也可以較小 構(gòu)建基因池時(shí) 要確保各個(gè)單株的DNA等量混合 為此一般分析平臺(tái)已采用機(jī)械手加樣 圖 8倍池的構(gòu)建策略 4 SNP檢測(cè) 酶切產(chǎn)物的凝膠電泳多采用的美國(guó)IE Col公司的雙色紅外熒光檢測(cè)的專利技術(shù)分析 因?yàn)榧t外光檢測(cè)的背景低 700nm和800nm通道間間沒(méi)有重疊 能有效的排除假陽(yáng)性 可靠的發(fā)現(xiàn)和確定突變 5 改進(jìn)措施 圖 高通量TILLING的服務(wù)組織 最新和最期待的改進(jìn) Squinting指的是輔助凝膠檢測(cè) 用當(dāng)前使用的GelBuddy軟禁確定新的DNA片段 TbyS途徑是指基于生物信息工具支撐的下一代測(cè)序技術(shù)在TILLING上的應(yīng)用 在突變目的基因擴(kuò)增后直接高速測(cè)序 或采用外顯子俘獲策略 使誘變DNA與轉(zhuǎn)錄組寡核苷酸雜交后再進(jìn)行測(cè)序的途徑 圖 A 傳統(tǒng)TILLING途徑 B 適應(yīng)于TbyS的途徑 圖 新一代高速測(cè)序流程圖 應(yīng)用舉例水稻 玉米 3 斑馬魚(yú) 參考文獻(xiàn)1 High ThroughputScreeningforInducedPointMutations PlantPhysiol 2001 126 4802 TILLINGbySequencing TbyS fortargetedgenomemutagenesisincrops MolBreeding 2017 37 143 TILLINGwithoutaplough anewmethodwithapplicationsforreversegenetics CurrentOpinioninPlantBiology2005 8 211 2154 DiscoveryofchemicallyinducedmutationsinricebyTILLING BMCPlantBiology2007 7 195 Discoveryofinducedpointmuta