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原核轉錄與真核轉錄的比較答:1 原核生物中mRNA的轉錄與翻譯幾乎是同步發(fā)生的,而真核生物,轉錄是發(fā)生在細胞核內,翻譯則在核外進行.轉錄合成的RNA必需穿出核膜才發(fā)揮作用. 2 RNA聚合酶不相同,原核生物中RNA由一種聚合酶合成.真核生物中有三種類型的RNA聚合酶. 3 啟動子不同 真核生物的啟動子與原核生物的很相似,也位于轉錄起始部位的5/端,但存在著幾個重要區(qū)域.例如在距起始部位最近的一個是-25區(qū),稱為TATA匣子,與原核生物的-10順序(TATAAT)很相似. 4 轉錄后RNA加工修飾不同 其中mRNA最為突出.真核生物mRNA分子的壽命較長,不像原核生物的只有幾秒鐘.而且不用加工修飾.真核生物mRNA在5/和3/端都要修飾, 5/端要形成一種稱作帽子的復雜結構. 3/端則要加上一段多聚腺嘌呤核苷酸poly(A)的順序。Replicator:起始子，決定DNA復制起始的序列。Initiator:起始因子，識別并作用起始子，啟動復制的蛋白質。必需氨基酸（essential amino acid）:必須從食物中攝取，以維持生物體正常功能的氨基酸，賴（Lys）、蘇（Leu）、異亮（Ile）、苯丙（Phe）、甲硫（Met）、纈（Val）、色（Trp）。蛋白質一級結構（primary structure）：蛋白質的多肽鏈中氨基酸的排列順序，包括二硫鍵位置。特點為是基礎結構、穩(wěn)定結構。測定蛋白質一級結構的一般步驟（1）測定蛋白質分子中的多肽鏈數(shù)目（2）拆分蛋白質分子的多肽鏈（3）測定多肽鏈的氨基酸組成（4）測定多肽鏈的C端（肼解法）和N端（丹磺酰氯法）殘基（5）斷裂多肽鏈內的二硫鍵（6）用兩種以上的方法將多肽鏈斷裂為數(shù)個肽段（E法和化學法（溴化氰法）（7）測定肽段的氨基酸順序（Edman法）（8）用拼版法確定多肽鏈的氨基酸排列順序（9）確定肽鏈間的二硫鍵蛋白質一級結構測定的常用方法末端殘基的測定：N-端殘基的測定：丹磺酰氯法（DNS）,該法原理與Sanger法相同，但產(chǎn)物有熒光，因此靈敏度高。Edman 法氨肽酶法。（2）C-端殘基的測定：肼解法、還原法、羧肽酶法。二硫鍵的斷裂與巰基的保護。多肽鏈的斷裂：至少要用兩種不同的方法酶法化學法。酶法：用不同的蛋白酶水解同一肽鏈，得到不同的肽段，常用的蛋白酶及其專一性為：胰蛋白酶：羧基端為Lys和Arg的肽鍵；胰凝乳蛋白酶：羧基端Phe,Trp和Tyr的肽鍵；化學法：常用溴化氰法。肽段氨基酸順序的測定：常用Edman法。多肽鏈氨基酸順序的確定：拼版法。穩(wěn)定蛋白質三維結構的作用力（1）氫鍵（2）離子鍵（3）配位鍵（4）疏水作用：是在極性環(huán)境中，氨基酸的疏水基團之間的聚集力。（5）二硫鍵 是Cys殘基的硫氫基之間通過氧化形成的共價鍵，存在較少，但是由于它是共價鍵，所以在維持蛋白質分子構象中也起主要作用，分為鏈間二硫鍵和鏈內二硫鍵。（6）范德華力 當分子間結合的結構最匹配時，范德華力最大。蛋白質的立體化學原理（1）肽鍵平面（peptide plane）形成原因：共軛，肽鍵不能自由旋轉。結果：形成剛性平面，又叫酰胺平面。（2）二面角（dihedral angle）共用同一原子的兩個平面間的夾角稱為二面角，決定主肽鏈骨架的構象。（3）非鍵合原子最小接觸距離 決定R基及其原子在空間的排列。蛋白質的二級結構（secondary structure）在規(guī)則氫鍵指導下，局部主肽鏈在空間的排列。1、螺旋（helix）：螺旋的表示方法 “nsR或L”，其中n表示上升一圈的氨基酸數(shù)，s表示氫鍵形成的環(huán)中所含的原子數(shù)，R或L表示螺旋的旋轉方向。2、折疊片（-pleated sheet）：多個折疊股平行排列通過氫鍵形成折疊片。平行的每個重復周期為0.65 nm，反平行0.7nm。3、回折（reverse turn）或稱轉角（turn）。4、-發(fā)夾（-hairpin）：它是由一條構想伸展的肽鏈彎曲，彼此靠近并呈反向平行的發(fā)夾狀狀結構（剛性結構），包含10或11個氨基酸殘基，兩條等長的肽段依靠16個氫鍵連接起來。5、無規(guī)則卷曲（random coil）：這是一種沒有一定規(guī)律的結構（軟性結構），但是又是蛋白質執(zhí)行功能的結構部位。6、三股螺旋（triple-stranded helix）：存在于膠原蛋白（甘脯羥脯）中的一種特殊結構，膠原蛋白分子由三條分子量約為120000的肽鏈組成。每條肽鏈形成左手螺旋（特點是輕微的螺旋），但內部沒有氫鍵，三條這樣的螺旋又形成右手三股螺旋，肽鏈間借助Gly殘基的肽鍵之間形成氫鍵交聯(lián)在一起，是一種超螺旋結構。7、-突起（-bulge）：在-折迭結構中片層出現(xiàn)彎曲，使局部肽鏈之間不是平行結構。蛋白質的超二級結構（super secondary structure）：指相鄰二級結構單元按一定規(guī)律組合，形成空間上可以區(qū)別的結構單位。類型：1、卷曲的卷曲-螺旋（，coiled-coil-helix）2、x單元 兩段平行的-折迭借助一個二級結構單元連接組成。當X=-折迭時，則形成；當X=-螺旋時，則形成；當X=無規(guī)則卷曲時，則形成C。最常見的是三段平行-折迭和兩段-螺旋，這類結構稱為Rossmann結構。3、-迂回（- meanter）:由幾個相鄰反平行的折迭互相結合，中間由短鏈連接形成的結構。4 、回型拓撲結構5、-折迭桶（-barrel）：是大的折迭片層發(fā)生扭曲，最后卷曲成桶狀的結構，其-折迭可以是平行的，也可以是反平行的。6 、-螺旋-回折-螺旋（-helix-turn-helix）這是兩個-螺旋經(jīng)一個回折連接起來的結構，兩個螺旋互成一定的角度。蛋白質的結構域（doman）：蛋白質一條多肽鏈上出現(xiàn)緊密的、相對獨立的區(qū)域。類型：-螺旋結構域-折疊結構域+結構域/結構域無規(guī)則卷曲結構域-回折結構域蛋白質的三級結構（tertiary structure）：是指蛋白質分子中全部原子的空間排列。球蛋白都具有三級結構。三級結構特點1球狀蛋白往往利用各種結構單元折疊成緊密的球狀結構，各種結構單元所占的比例與蛋白質種類有關；2球狀蛋白質分子的疏水基團主要趨向于內部，而親水基團主要分布于表面，內部的疏水基是穩(wěn)定的蛋白質結構的主要部分，而外部的親水基團有利于蛋白質穩(wěn)定的存在于極性的細胞環(huán)境中；3蛋白質表面的下陷區(qū)往往是蛋白質執(zhí)行功能的部位；4同類球狀蛋白具有基本相同的三級結構，不同的球狀蛋白其三級結構是不同的，這是球狀蛋白結構的專一性，但這種專一性也不是一成不變的，而是常發(fā)生一些必要的構象變化，這種專一性和靈活性的統(tǒng)一是蛋白功能多樣性、復雜性的結構基礎。蛋白質的四級結構（quaternary structure）就是亞基在空間的排列方式。含有亞基的蛋白質稱寡聚蛋白。亞基之間的主要的作用力是疏水作用力。四級結構的優(yōu)越性減少遺傳錯誤；擴大功能；節(jié)省模版；形成一定得幾何構型，從而形成特殊結構的蛋白質。蛋白質的結構原則1、手性原則（handed principle）：即蛋白質從低級結構形成高級結構時要遵從右手原則。螺旋是以右手螺旋為主，平行的折迭相互連接是右手連接，折迭片層比較大時，要發(fā)生扭曲，扭曲的方向也是右手扭曲。2、疏水表面積最小原則3、自我裝配原則。波爾效應PH對血紅蛋白對氧親合力的影響，生理意義：在機體組織中因其低，有利于氧的釋放，使組織能比氧分壓降低獲得更多的氧，氧的釋放又促進血紅蛋白與、的結合以補償?shù)慕档?；在肺部由于氧分壓高，有利于、的釋放與氧的結合。*攝入過多的脂肪會怎樣？答：酸性體質，血液PH低，不利與血紅蛋白結合氧，會使機體無力，脂肪分解過快，產(chǎn)生酮體，易造成酸中毒。*燙發(fā)：人工使二硫鍵改變。頭發(fā)卷直軟硬與二硫鍵的位置和多少有關。核酸的分類 包括DNA和RNA（tRNA、mRNA、rRNA、SnRNA、其它）。 DNA的結構：1、特點a.反平行雙鏈右手螺旋；b.糖-Pi在螺旋線上；c.堿基伸向內部其平面垂直于軸；d.A=T、G=C；e.直徑=2nm，一圈上升10對核苷酸，螺距為3.4nm；f.大溝、小溝。2. 穩(wěn)定作用力 氫鍵（堿基之間，橫向力）；堿基堆積力(包括縱向的疏水作用力和堿基間p電子的相互作用)（主要）；相反電荷作用。DNA雙螺旋構象的多樣性1、B型DNA ：天然，大多數(shù)生物的DNA都是屬于這種類型。2、A型DNA ：B型DNA脫水后變成A型DNA。3、Z型DNA ：為左手雙螺旋， DNA二級結構的多樣性A、B、Z、3鏈、4鏈DNA的狀態(tài)和功能+意義：有利于基因的表達調控，有利于DNA的穩(wěn)定。三鏈及四鏈DNA 1三鏈DNA：三鏈結構是在正常的雙螺旋結構中第三鏈結合在大溝中，從而形成局部三鏈結構。三鏈中正常T-A鏈間為反平行，第三股鏈與A鏈為平行。功能與基因調控有關，且第三股鏈只與特定區(qū)域結合它的存在使調控蛋白及酶難以結合，從而關閉基因，抑制解螺旋。2四鏈DNA（Ttraplex）：在染色體的端粒處，有（T4和G4）序列，兩條鏈上各8個G形成局部四鏈結構。雙螺旋結構的局部構象1、堿基對平面 ：形成這種構象的原因是堿基之間的互相積壓。2、堿基對旋轉角：平均為36。局部構象是DNA結合蛋白識別的標志 。DNA的三級結構DNA的三級結構是指DNA的超螺旋結構。1、超螺旋DNA（Supercoiled DNA）：松弛態(tài)（relaxed state） DNA中心軸與平面平行即不扭曲的狀態(tài)。超螺旋：雙螺旋結構的DNA再次扭曲形成的螺旋結構。右旋超螺旋-負超螺旋；左旋超螺旋-正超螺旋。2、細胞中的DNA：細胞中原核、真核DNA都以負超螺旋存在。超螺旋的重要性1超螺旋化使分子致密，易包裝；2超螺旋化是DNA轉錄復制的需要。超螺旋是一種受力狀態(tài)，負超螺旋引起互補鏈分開，局部變性。Z-DNA的形成對超螺旋化有意義，如BZ（1個圈），DNA超螺旋結構就會發(fā)很大變化。RNA的結構特征1、堿基組成：AGCU,區(qū)別DNA：AGCT；2、一級結構：基本組成單位：核苷酸（AMP、GMP、CMP、UMP）；核苷酸鏈接鍵：3-5磷酸二酯鍵；存在狀態(tài)：單鏈，少數(shù)為雙鏈，長度：65至60000bp。RNA構象元件（RNA有7種結構,DNA有5種結構）：雙螺旋、內部環(huán)（雙螺旋中間出現(xiàn)的環(huán)，是兩條鏈形成的）、單堿基突起（一個堿基未形成氫鍵）和突環(huán)（在雙螺旋的中間部位且是一條鏈是單鏈，而另一條鏈是完整的堿基配對，是由一條鏈形成的）、發(fā)夾環(huán)（一個雙螺旋自身的兩條鏈形成的環(huán)）、多分支環(huán)或結合環(huán)（連接多個雙螺旋結構）、假結（在一級結構上不連續(xù)的堿基，空間上形成的另一種氫鍵，三級結構才能看見，二級結構不配對）、單鏈區(qū)mRNA結構 原核生物mRNA為多順反子mRNA（polycistron），即一條mRNA可編碼幾條肽鏈，無帽子結構和尾巴，不含稀有堿基，半壽期短，二級結構有豐富的自身回折產(chǎn)生的雙鏈區(qū)。真核生物mRNA為單順反子mRNA（monocistron），即一條mRNA只編碼一條肽鏈，5有帽子結構3有尾巴，含少量稀有堿基，半壽期可達一小時。tRNA結構一級結構：分子量25000左右，7399個核苷酸，大多數(shù)是76個核苷酸含有較多的稀有堿基3為CCA 5端磷酸化。二級結構：三葉草型。三級結構：倒L型snRNA(small nuclear RNA):小分子核RNA，分布于細胞核，80260個核苷酸，沉降系數(shù)48S，普遍存在于各種真核生物中，由于富含尿嘧啶，所以以U系列命名。功能：多樣化，U1、U2、U4、U5、U6與蛋白質（剪接體）結合參與mRNA的剪接，U3與rRNA加工有關（轉錄后加工）等。SnoRNA(small nucleolar RNA):小分子核仁RNA，存在于真核生物細胞核的核仁部分，功能為參與rRNA的加工，影響rRNA及其前體的形成，指導甲基化位點的形成等。反義RNA（antisenseRNA）指能與mRNA進行互補結合的單鏈RNA，具有調節(jié)作用。（與mRNA結合，使轉錄不進行，由于基因的過量表達，雙鏈RNA有酶切斷，發(fā)生基因沉默。）核酶（robozyme）：具有催化活性的RNA。核酶的催化方式自我剪接（self-cleavage）：這些RNA可以對自身進行催化，自己催化自己的多核苷酸鏈分解 ；自我剪切（self-splicing）：即RNA對自身的多核苷酸鏈既催化其水解，又可將成熟片段連接起來。具有特殊結構，如錘頭結構、發(fā)夾結構、斧頭結構；分子間催化。脫氧核酶(deribozyme)：具有催化活性的DNA：RNA的切割作用：以金屬離子為輔助因子Mg2+ Zn2+ Mn2+ Ca2+等；以氨基酸為輔助因子；無輔助因子；DNA切割作用：類脫氧核酶：需維生素C和Cu2+ 參加；類脫氧核酶：只需Cu2+參加；過氧化物酶活性；DNA激酶活性可使DNA5，端磷酸化；DNA連接酶活性 。DNA一級結構的測定最常用的方法為雙脫氧法（Sanger法）DNA的一級結構測定體系模版和引物：模版為需測序的單鏈DNA片段；可以與模版互補的帶放射性標記（有時用非放射性標記）的引物雙脫氧核苷三磷酸參與DNA 復制的酶（DNA聚合酶）與底物(4種dNTP)。離心分離的基本原理分子量越大的分子，被分離的越遠。在一定離心場中，顆粒的沉降速度不僅與離心力有關，而且與顆粒大小、密度以及介質黏度有關，一組不同的顆粒在同一條件下離心時則可以根據(jù)它們的密度和顆粒大小而分離。離心場產(chǎn)生的離心力的表示 習慣使用法：轉速-轉/分（r/min）；缺點：如果旋轉半徑不同，則粒子所受的離心力不同。標準法：相對離心力（RCF），表示方法：數(shù)字*g（g為重力加速度，即相對離心力為重力加速度的倍數(shù)）相對離心力與轉速的換算：計算法：RCF=1.119*10-5*（r/min）2*r*g g:9.8kg.m/s2. 圖表法：根據(jù)旋轉半徑r、RCF、r/min的列線計算圖進行換算。離心技術沉淀離心：選定一定得時間、速度進行離心，使樣品液中的大的固型物與液體分離，從而獲得沉淀或上清液，又稱為固液分離法，使用普通離心機。差速離心（差級離心、差分離心）在均勻介質中，利用各種物質粒子沉降速度的不同而分批分離的方法。（至少需要2個離心力）密度梯度分離（超速離心機）原理：利用各種粒子的沉降速度和浮力密度差，當一定粒子到達與其密度相同的梯度位置時停止沉降，不同粒子處于不同位置，則得到了分離。用途：是制備高純度物質的常用方法。電泳原理 v=(*q)/(6) v:泳動速度 :電場強度 q:粒子電荷數(shù) r:顆粒半徑:介質黏度 粒子的泳動速度與電場強度成正比,與粒子電荷成正比,與顆粒半徑成反比,與介質黏度成反比。聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE 凝膠的結構：立體網(wǎng)狀；凝膠聚合原理：在TMED（四甲基乙二胺）催化過硫酸胺還原產(chǎn)生的自由基的存在下，丙烯胺單體的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的線狀長鏈，在交流劑甲叉雙稀酰胺的參與下的共聚合僅反應中，聚丙烯酰胺的交聯(lián)形成三維帶狀網(wǎng)絡結構，網(wǎng)格孔徑的平均直徑?jīng)Q定于丙烯酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度。聚合方法：光聚合、化學聚合。凝膠性質 A機械強度高、有彈性、透明；B性質穩(wěn)定；C有分子篩效應，抗對流；D親水且為中性；E不溶性，不污染樣品，可微量操作；F通過控制凝膠濃度，孔徑大小可以控制。電泳分離原理（1）濃縮效應 1、膠層不連續(xù)2、離子成分不連續(xù)3、電位梯度不連續(xù)4、PH不連續(xù)。（2）分子篩效應凝膠孔徑與蛋白質分子大小在一個數(shù)量級，各種蛋白質都可通過，但是阻力不同，小分子可很容易的通過，大分子需要從凝膠孔中擠過去。（3）電荷效應。凝膠電泳類型（1）圓盤電泳（2）垂直板凝膠電泳：優(yōu)點為表面積大，易控制溫度，多個樣品條件相同，可進行雙向電泳，放射自顯影。等電聚焦凝膠電泳（IEF）1、原理：在凝膠中形成了濃度梯度（1）兩性電解質載體：兩性電解質載體為多羥基、多羧基化合物，因此具有等電點，氨基、羧基比例不同，其等電點也不同，兩性電解質載體也具有緩沖作用。（2）PH梯度的形成.（3）電泳分離蛋白。SDS凝膠電泳 1、樣品處理：樣品蛋白中加入SDS、巰基乙醇，巰基乙醇的作用 打開二硫鍵；SDS作用：作用于亞基。2、電泳：不同蛋白質的區(qū)別只有分子量，因此電泳后可按分子量的大小不同而分離，但是測出的只是亞基的分質量，為了得到蛋白質的分子量，電泳時必須加標準蛋白marker一起電泳。凝膠層析（gel chromatography）1、凝膠結構與性質；結構：立體網(wǎng)狀；單體：葡萄糖；交聯(lián)劑：甘油；性質：穩(wěn)定，不溶性。2、分離原理：蛋白質在凝膠中的速度決定于內水、外水的分配系數(shù).大分子不進入顆粒速度最快，小分子完全進入顆粒速度最慢，中等大小分子速度中間；3、操作：溶脹-裝柱-層析-再生；4用途：a脫鹽b分離提純蛋白質c濃縮d測定分子量。親和層析原理 生物物質之間有專一性。特點：效率高，純度高，可純化細胞，條件溫和。離子交換層析1、離子交換劑：弱酸型的CM-纖維素、弱堿型的DEAE-纖維素。2、分離過程：不同蛋白質所帶電荷不同，與交換劑的結合力也不同，通過改變洗脫液離子強度或PH，可將蛋白質根據(jù)其結合力從弱到強依次分離。核酸的合成 原核細胞含一個染色體，真核細胞含多個染色體，細胞分裂前，DNA會發(fā)生復制。復制完畢則細胞分裂。染色體外的遺傳因子，有的受染色體控制，而與染色體DNA同步復制，有的不受控制則在細胞周圍的任何時期都可復制。DNA復制（replication）:以親代DNA為模板指導合成相同的子代DNA分子的過程。DNA復制的方式-半保留復制。DNA的復制方式有三種，全保留、半保留和分散式。放射自顯影法 用帶3H的T標記大腸桿菌DNA，用溶菌酶去掉細胞壁，釋放出完整的DNA鋪在透析膠上，蓋上感光膠片，若干星期后3H 處則被B射線感光，顯影后，就勾畫出DNA分子形狀在光學顯微鏡下可觀察DNA復制的過程 1，順序性：指DNA復制時是先局部解開兩條鏈，再復制且邊解鏈邊復制：2，復制的起始位點:原點局部雙鏈解開，形成復制眼（復制起點不是任意的，而是固定的，原核生物有一個起點，真核生物多個起點）；3，復制方向：單向復制，即只形成一個復制叉；雙向復制，形成兩個復制叉。（分子中正在復制的部位稱為復制叉，它是由兩股解開得親代鏈和在其上新合成得子鏈、酶、因子組成）。4，雙向復制的對稱性 對稱復制 兩個復制叉移動速度相同，對于環(huán)形DNA來說，其終點在原點180處。不對稱復制兩個復制叉移動速度不同。6復制子（replicon）:從一個原點起始復制的DNA （原核細胞只有一個原點，即只有一個復制子）。5.半不連續(xù)復制:DNA聚合酶作用下，5-3開始合成，5-3方向與解鏈方向一致，則連續(xù)復制；另一條3-5方向的不能連續(xù)復制，則產(chǎn)生岡崎片段，是由DNA聚合酶控制的。岡崎片段（Okazaki）：岡崎用3H標記噬菌體感染的大腸桿菌、然后短時間內分離DNA，則得到1000堿基左右的片段，真核生物則為100-200個核苷酸片段，稱為岡崎片段。結果：半不連續(xù)復制。連續(xù)鏈叫先導鏈；不連續(xù)鏈叫后隨鏈；二者差一個岡崎片段。機理 兩條模板鏈中3-5方向的模板其子代DNA合成是連續(xù)的，這條子代DNA 叫先導鏈，而5-3方向的鏈是不連續(xù)合成的，隨著復制叉的移動要先合成小片段，然后連起來，這條子代DNA鏈叫滯后鏈或隨后鏈。問題：真核生物DNA比大腸桿菌的DNA大的多復制叉移動速度慢10倍，據(jù)此計算真核細胞DNA 復制需用幾個星期，實際上只用6-8小時（因為真核細胞DNA有多個原點，整個分子分為多個復制子，且都為雙向復制）。5-3外切：去除引物，填補缺口。3-5外切：校對。IV和V一般不參與修復，專性很低，沒校對功能。I和II是主要修復。SOS對微點損傷后，不按堿基配對原則來修復，對進化有用，使基因突變。參與DNA復制的酶和輔助因子：1.DNA聚合酶 催化反應的要點：底物：四種dNTP；模板：DNA鏈；聚合方式：5-3；條件：聚合反應必須有引物存在。2.引發(fā)酶（primase）:功能：可能從無到有地以DNA為模板，催化合成一小段與DNA互補的RNA即引物。其本質是RNA聚合酶，有1060個核苷酸組成。引物酶本身無活性，只有與另外6種蛋白質結合為引物體（primosome）才可催化引物的合成；3，DNA連接酶（ligase）功能：將復制過程中形成的DNA片段用35磷酸二酯鍵連接起來；4，DNA解螺旋酶（helicase）（解鏈酶）功能：DNA的雙螺旋解鏈，解開一對堿基，需兩分子ATP。作用點：DNA上局部單鏈處，向雙鏈方向解鏈。5，單鏈結合蛋白（single strand binding protein SSB）MW:74000,四聚體，可與由解鏈酶解開的單鏈結合。功能 防止單鏈再次形成雙鏈，防止核酸酶水解多核苷酸鏈，保護DNA。原核SSB對單鏈DNA結合有高度協(xié)同性，真核SSB無協(xié)同性。可重復使用。6DNA拓撲異構酶（topoisomerase）DNA構象的拓撲關系 引入副超螺旋（右旋）。減少螺旋，引入正超螺旋（左旋），增加螺旋，通過催化DNA拓撲結構的變化，減少由于解鏈形成的張力和合成的子代DNA形成雙螺旋。 控制DNA拓撲結構的酶為DNA拓撲異構酶。（1）拓撲異構酶 首先在大腸桿菌種發(fā)現(xiàn)，過去稱為-蛋白，分子量為11000，一條肽鏈，它可切斷DNA一條鏈，增加一個螺旋，再接起來，所以它可消除負超螺旋，可增加正超螺旋，不需供能系統(tǒng)。 功能：1，雙鏈DNA超螺旋與松弛態(tài)和相互轉換。2，單鏈結狀DNA和環(huán)狀無結狀DNA的相互轉換。3，單鏈互補環(huán)狀DNA正、負形成環(huán)狀DNA。4，雙鏈環(huán)狀DNA環(huán)連和解環(huán)連。（2）拓撲異構酶 E.coli中，MW=1400000為四聚體，A2B2,真核生物中該酶分子量為390000二聚體，它可使DNA兩條鏈同時裂解，然后再連接，結果引入負超螺旋，這是需能過程，能量由ATP供能.拓撲異構酶的功能：雙鏈DNA超螺旋與松弛態(tài)的相互轉化。單鏈結狀DNA和環(huán)狀無結狀DNA的相互轉化。單鏈互補環(huán)狀DNA正、負鏈形成環(huán)狀DNA。雙鏈環(huán)狀DNA環(huán)鏈或解環(huán)鏈。去除解螺旋的張力。7.端粒酶 是個核蛋白，保護能夠表達的DNA不被水解。組成：蛋白質和DNA。性質：兩個亞基，一個是催化亞基，一個是調節(jié)亞基。功能 以酶分子中的RNA片段為模版，在染色體DNA36端合成一段DNA。生理意義由于復制過程中，3-端引物切除以后聚合酶1無法填補，就造成了3-端的縮短。端粒酶可以補充染色體末端的丟失，防止細胞衰老。真核生物DNA復制需要的酶：真核生物DNA聚合酶aby&e.a功能：合成引物與一小段DNA。b功能：DNA損傷修復。y功能：線粒體DNA的復制。&功能：復制的主要酶。e功能：修復；填補缺口。DNA復制機理1，起始：DNA分子上有特定的起始位點，在一些因子的作用下，DNA部分解鏈，形成一個“復制眼”（replication eye）/復制泡。2，延長。3，終止： DNA復制無特定終止位點，復制鏈接到達前面已復制成的片段則自動終止。真核生物DNA復制機制：1起始2延長：與原核生物基本一致。3終止：兩復制叉相遇，與原核生物相似。4端粒的復制與端粒酶。端粒酶：保護DNA末端，防止細胞老化。真核生物DNA復制方式1、染色體DNA復制方式： 多復制子復制 即DNA上先形成幾個復制眼，雙向復制?！把邸睌U大互相相連，形成“大眼睛”后完成整個DNA的復制,形成兩個DNA分子2 、線粒體DNA復制方式 ：D環(huán)復制模型。原核生物DNA的復制方式：1凱恩斯模型2滾環(huán)模型，均為雙鏈環(huán)狀DNA復制方式。3單鏈環(huán)狀DNA復制方式。4線粒體DNA復制方式反轉錄（逆轉錄） 以RNA為模版合成DNA的過程。反轉錄酶：存在于真核生物的RNA腫瘤病毒中；催化特性：1以四種dNTP為底物，需模版和引物2 以病毒RNA為模版，合成互補DNA3 具有核糖核酸功能，水解RNADNA雜合分子中的RNA4 以自己合成的DNA鏈為模版合成互補的的DNA，從而形成雙螺旋分子。催化過程：1以RNA為引物合成負鏈DNA。2完成了RNA反轉錄為cDNA的過程。DNA損傷修復1 光復活2 切除修復：屬于復制前的修復3 重組修復：復制中的修復4 SOS修復：堿基亂配。 反轉錄的特點：1三種反應（RNA-DNA，RNA降解，DNA-DNA）由一個酶催化。2負鏈DNA合成的天然引物是tRNA,是引物的3端18bp與RNA互補結合。正鏈合成的天然引物是分解后的RNA片段。3實現(xiàn)了兩次跳躍。4cDNA的兩條鏈是分步合成的。轉錄（transcription）:在DNA指導下合成RNA的過程.1 局部轉錄；RNA的轉錄只轉錄DNA的部分信息；轉錄時每次轉錄一個轉錄單位，轉錄單位從RNA轉錄起始到終止的DNA序列。2 不對稱轉錄：只以一條DNA鏈為模版合成RNA的過程，其中模版鏈也叫反義鏈與模版鏈互補的鏈因為與RNA鏈堿基序列基本相同，所以叫模版鏈（coding strand）也叫正義鏈(sense strand)。3 轉錄產(chǎn)物：編碼mRNA的基因叫結構基因（structural gene），因其最終產(chǎn)物是蛋白質。編碼是其他RNA的基因叫非結構基因，因其最終產(chǎn)物是RNADNA復制中的損傷：1堿基錯配2核苷酸插入或刪除3校對的疏忽。DNA損傷的修復：1錯配修復2切除修復：堿基切除修復核苷酸切除修復偶聯(lián)轉錄切除修復3直接修復光復活去甲基4重組修復（修復后損傷點還在）5SOS修復6斷鏈修復單鏈斷裂修復雙鏈斷裂修復復制雙鏈斷裂直接雙鏈斷裂修復（重組修復）。RNA聚合酶 性質:以四種NTP（ATP 、GTP CTP UTP ）為底物，以DNA鏈為模版，按照堿基配對原則，將相應的NTP的5 磷酸與上一個核苷酸3羥基形成3-5磷酸二酯鍵,即合成方向為5-3方向,聚合反應不需要引物。轉錄四個階段 識別啟動子，聚合酶結合于雙鏈，尋找基因的調控區(qū)域，識別啟動子起始，聚合酶停泊在啟動子上，從局部序列解旋，形成轉錄跑開始，到合成轉錄產(chǎn)物中最初幾個核苷酸磷酸二酯鍵的合成延伸，聚合酶沿著雙鏈運動，轉錄泡隨之前進，前方的雙螺旋不斷解旋，暴露出心的單鏈模版片段終止，聚合酶識別轉錄終止信號，停止合成磷酸二酯鍵，轉錄復合物解體釋放解體釋放轉錄產(chǎn)物。真核細胞RNA的轉錄機理與原核RNA轉錄機理基本相同。主要不同之處為：1. 啟動子復雜2. 需要多種因子參與3. RNA聚合酶不同。真核RNA聚合酶有三種，即RNA聚合酶I、 II、 III。原核生物轉錄的機理：起始：搜索、結合啟動子形成封閉復合物形成開放復合物形成三元復合物因子的解離延伸：聚合酶的變化與運動：酶的變化：因子離去，全酶變?yōu)楹诵拿福H和力降低。運動方式：蠕蟲運動。鏈的生成雙螺旋模板的拓撲變化終止：聚合酶到達終止子，則停止轉錄。終止子（terminator）：能夠使轉錄停止的序列。終止子特點：富含、的反向重復序列末端有連續(xù)的對。終止因子：能夠幫助終止子進行終止的蛋白質。強終止 只依靠終止子和部分因子就可使轉錄停止，并釋放合成的鏈和聚合酶弱終止 不僅需要終止子，而且需要r因子才能停止轉錄并釋放RNA和RNA聚合酶的終止方式。又叫依賴于r因子的終止子。核心啟動子：1.-35區(qū)，功能：RNA聚合酶識別位點，對聚合酶全酶有很高的親和力。.區(qū)，功能：聚合酶緊密結合位點，決定轉錄方向，開始解鏈區(qū)。因子的功能：識別核心啟動子，使聚合酶全酶結合與啟動子部位，并開始轉錄。RNA轉錄后的加工1. rRNA加工：（1）剪接（2）修飾：主要是甲基化2.tRNA的加工（1）剪切(2) 修飾：3加CCA。剪切加工后，全部的真核tRNA和原核細胞中一大類tRNA無3端的CCA，需要在修飾加工中加上。其它修飾：如還原、糖苷鍵移位、甲基化等。 3.真核mRNA的加工 （1）5加帽子，3加尾巴（2）剪接：真核細胞的蛋白質基因是斷裂基因，即一個基因中有的片段具有指導合成蛋白質的信息，而有的片段無此信息。DNA和hnRNA中在mRNA中出現(xiàn)的相應序列稱為外顯子。DNA和hnRNA中在mRNA中不出現(xiàn)的相應序列稱為內含子。RNA復制酶 催化性質：以4種NTP為底物，以RNA為模板，按照堿基配對原則進行聚合反應，合成方向為5 3。聚合反應不需要引物。蛋白質合成體系多順反子mRNA(polycistronic mRNA) 原核細胞mRNA的編碼序列可指導幾條肽鏈的合成。單順反子mRNA(monocistronic mRNA)： 真核細胞mRNA的編碼序列只指導一條肽鏈的合成。mRNA(messenger RNA) ：攜帶有指導合成蛋白質的遺傳信息的RNA。1.結構：原核細胞 mRNA 5端有引導序列，3端有拖尾序列，引導序列之后是編碼序列，可直接指導肽鏈合成。真核細胞mRNA 5端有引導序列，3端有拖尾序列，還有帽子（cap）結構，3端有尾巴(tail),中間是編碼序列。3端有尾巴（多聚A200左右個核苷酸）功能：保護作用；5端有帽子結構：0號帽子：結構為 m7G5ppp5 Np；1號帽子：結構為 m7G5ppp5 NmpNp；2號帽子：結構為 m7G5ppp5 NmpNmp；功能：保護作用，參與蛋白質合成起始2. 遺傳密碼(genetic code) mRNA編碼區(qū)核苷酸的排列順序與肽鏈中氨基酸的排列順序的對應方式。密碼表的組成 有義密碼子編碼氨基酸的密碼子，61 個；無義密碼子不編碼氨基酸的密碼子，即終止密碼子。UAA UAG UGA；起始密碼子 作為翻譯起始信號的密碼子，AUG（GUG）。移碼突變（frame shift mutation）：由某一個核苷酸 漏讀、重讀或者編碼區(qū)插入、刪除一個核苷酸就會使該處之后的讀碼發(fā)生錯誤而引起的突變。密碼的特點 （1）無間斷性。密碼閱讀方向5-3，密碼之間無間隔。2）簡并性（degeneracy）。一個氨基酸有一個以上密碼子的現(xiàn)象。意義：加強翻譯的準確性（3）變偶性(wobble)。指翻譯過程中密碼子與反密碼子堿基配對時，密碼子的第三個堿基不嚴格遵守堿基配對原則的現(xiàn)象。（4）通用性。所有生物的遺傳密碼都是通用的。但是相對通用性，不是絕對通用性。即有少部分生物（如紅色面包霉）或細胞器（如線粒體）具有另外的遺傳密碼。變偶學說的四種關系A：密碼的前兩個堿基與反密碼的相應堿基相成強有力的配對B：反密碼的第一個堿基決定給定tRNA所讀密碼子的數(shù)目。第一個堿基為C、A，這種tRNA只能閱讀一種密碼子；第一個堿基為U、G，這種tRNA能閱讀兩種不同的密碼子；第一個堿基為I，這種tRNA能閱讀三種不同的密碼子；C：一個氨基酸有不同的密碼子時，頭兩個堿基不同的密碼子需要不同的tRNA。D：最少需要32種tRNA來翻譯所有64 種密碼子；意義 1、保證翻譯的速度：密碼的第三個堿基與反密碼結合的不專一性，說明它們之間的堿基配對是松散的，可保證蛋白質合成時tRNA從密碼子上迅速離去。2、保證翻譯的準確性：如果密碼子第三位堿基發(fā)生突變，依然能保證翻譯的肽鏈不變。反密碼子 （anticudon）位于tRNA反密碼環(huán)可與mRNA的密碼子堿基配對的三個堿基稱為密碼子。核糖體（ribosome）原核生物蛋白質合成因子有起始因子（initiation factor, IF）,延伸因子（elongation factor, EF）,終止因子（termination factor, RF）真核生物蛋白質合成因子有起始因子（e IF）,延伸因子（e EF）,終止因子（e RF）。tRNA的種類：起始tRNA專一性識別起始密碼子AUG，進P位，結合于mRNA小亞基復合體上；延長tRNA:識別一般密碼子，進A位，結合于mRNA核糖體復合體；校正tRNA：識別24個密碼子，校正移碼突變發(fā)生的閱讀錯誤，通過再編碼改正。起始復合體包括mRNA,小亞基，起始氨酰tRNA,IF。氨酰-tRNA合成酶的專一性一種酶只識別一種氨基酸和相應的tRNA.氨酰-tRNA合成酶每一個氨基酸有一個氨酰-tRNA合成酶，如果這個氨基酸有幾個tRNA，一個酶可以催化所有相應tRNA氨酰化。對氨基酸的專一性：有三個校正過程:（1）氨基酸的結合（2）氨酰-AMP的識別，若不正確則將其水解(3）氨酰-tRNA的識別，若不正確則將其水解對tRNA的專一性：（1）識別特殊核苷酸殘基的位點，主要幾種在氨基酸臂和反密碼臂，也有其它位置。（2）識別tRNA分子的構象（3）識別反密碼子氨酰-tRNA合成酶與tRNA的相互作用被人們稱為是“第二遺傳密碼”，這套遺傳密碼顯然要比第一套復雜的多，它在保證蛋白質合成的精確性上其非常重要的作用。大腸桿菌蛋白質的合成 肽鏈合成的起始：起始信號 起始密碼子AUG。SD(Shine-Dalgasrnon)序列 位于起始密碼上游(5-端方向)10個核苷酸左右，可與16SrRNA3-端的核苷酸序列互補。起始復合體的形成 核糖體分離，氨酰tRNA與起始因子結合。反應過程需要IF-1、IF-2、IF-3三種輔助因子。延長:進位：正確的氨酰-tRNA進入A位的過程。該過程需要Tu、Ts兩個因子和GTP參與。水解一分子GTP，使一分子氨酰tRNA到達A位。(2)轉肽（3）移位（核糖體移動，mRNA,tRNA不動）：移動距離：3組核苷酸 一個密碼，消耗一個鍵，移動一個密碼距離，方向5-3；3、終止。大腸桿菌蛋白質合成延伸部分（1）進位反應：起始tRNA已進入P位點。第二個氨基酸以連接于tRNA的活化形式到達，按照mRNA上密碼子的要求進入A位點需要延伸因子EF-Tu和GTP；（2）轉位和肽鍵的合成；（3）移位反應：結合有肽酰-tRNA的mRNA與核糖體相對位置移動一個密碼子。結果：1、原來在p位點內的去氨酰的tRNA被移到E位點，準備離開核糖體；2、原來位于A位點內的密碼子及其連接的二肽酰-tRNA一起移到P位點內；3、A位點空載，準備接受下一輪的氨基酸t(yī)RNA，移位需要延伸因子EF-Tu和GTP。多核糖體（polyribosome）：結合于同一mRNA上不同時間開始翻譯的多個核糖體，mRNA翻譯過程形成，不同核糖體結合與mRNA不同位置，長度不同。優(yōu)點：提高mRNA的利用率，加快蛋白質的合成速度，同時合成許多分子，可重復利用。蛋白質合成后加工N-端氨基酸的反應：原核：甲酰甲硫氨酸；真核：甲硫氨酸化學修飾：磷酸化（形成稀有氨基酸）、羥基化、甲基化、乙?；?；結合蛋白的形成；形成特有的空間結構：形成亞基的空間結構以及亞基之間排列的信息存在于蛋白質的一級結構中，但是需要折疊酶和一類蛋白質因子分子伴侶（chaperonin）功能：與折疊過程的蛋白結合，幫助折疊，防止其生成非天然構象，幫助肽鍵形成特有的空間結構。一級結構決定空間結構的非特定性，肽鏈剪接，肽鏈中也有內含子，需經(jīng)過剪接才能成熟。蛋白質合成抑制劑抗生素：嘌呤霉素(puromycin): 結構類似與氨酰-tRNA3端，可進入A位，形成肽鍵，但不能進入P位從而終止肽鏈合成。四環(huán)素(tetracyclines)：阻斷A位，抑制氨酰-tRNA的結合，終止蛋白質合成。氯霉素(chloramphenicol): 阻斷肽基轉移，抑制細菌和葉綠體、線粒體的蛋白質合成，但不抑制真核生物蛋白質合成。環(huán)已酰亞胺(cycloheximide)：抑制真核細胞核糖體的肽基轉移酶，但不抑制細菌和葉綠體、線粒體的同種酶。鏈霉素(streptomycin)：低濃度引起遺傳密碼的錯讀，高濃度抑制合成蛋白質合成的起始。負作用：引起耳聰。毒素 白喉毒素(diphtheria)： 滅活真核延長因子eEf-2，從而終止蛋白質合成。（引起咳嗽特別是兒童）。蓖麻毒蛋白(ricin)：滅活真核細胞核糖體的60S亞基。生蓖麻引起中毒。干擾素：抗病毒(唯-種不殺死病毒的蛋白質)降解模板RNA：干擾素與雙鏈病毒RNA共同活化2，5-A合成酶，促進2，5-A合成酶。2，5-A活化核酸內切酶促進mRNA降解使eIF-2磷酸化，抑制蛋白質合成起始。蛋白質的定向運輸導肽類 對于向細胞核、線粒體、葉綠體等細胞器的蛋白質，他們的肽鏈中都有一段或多段叫“導肽”，可以將蛋白質定向運輸。信號肽類 對于向溶酶體、質膜和細胞外運輸?shù)牡鞍踪|，它們N-端有一段有信號作用的肽端，叫做信號肽(signal peptide),它的作用：將肽鏈引導進內質網(wǎng)。然后蛋白質運至高爾基器，在高爾基器中進行定向分揀，接著定向運輸。信號肽作用 含有信號肽的蛋白端合成信號識別粒子(SRP)與肽鏈結合使蛋白合成停止信號肽經(jīng)過內質網(wǎng)后形成運輸泡SRP與SRPreceptor結合信號肽與空間蛋白結合用剪切酶將其它的肽與信號肽切開，運輸?shù)礁郀柣鹘?jīng)行更近一步的修飾轉運到溶酶體或分泌小泡和質膜中去或分泌到膜外。miRNA與siRNA的聯(lián)系（1） 均為Dicer的產(chǎn)物：長度約為22m左右，5端Pi基，3端-OH；（2）均需A蛋白家族的存在，因為RISC的組合。（3）進化關系上兩種推論：siRNA是miRNA的補充，miRNA在進化過程中替代了siRNA。尋找miRNA的方法（1） 分子生物學：分離、提純、測序、分子雜交等（2） 分子信息學：原理：出發(fā)點：前體的發(fā)夾膜結構和miRNA在物種間的保守性。DNA結合蛋白的基本結構域螺旋轉角螺旋（helix-turn-helix,HTH）結構特點：每個HTH由20個左右氨基酸殘基組成，1-7構成第一個螺旋，12-20構成第二個螺旋。鋅指（zinc finger）一個鋅指單元含有一個鋅離子，它可以與肽鏈的Cys、His形成配位鍵，使局部肽鏈形成指形區(qū)，故稱為鋅指。Zn2+的作用 對蛋白質分子形成的指形構想的骨架及其與DNA的結合均有固定作用，它比蛋白質分子的二硫鍵更加穩(wěn)定，而且不參與氧化還原作用。（3）亮氨酸拉鏈（Leucine zipper）蛋白質分子中的一個螺旋，在其一側集中了大量的疏水殘基，并且每7個氨基酸殘基就出現(xiàn)一個亮氨酸，即每兩個螺旋出現(xiàn)一個亮氨酸，兩個蛋白質的這種螺旋相互接觸，其亮氨酸測鏈交錯相插，從而形成二聚體。二聚化的蛋白質可以與DNA結合，但其結合區(qū)不是拉鏈區(qū)，拉鏈的功能是維持蛋白質的二聚化。 堿性螺旋環(huán)螺旋（helix-loop-helixHLH）這種結構為兩個螺旋有一個可變長度的肽鏈形成的環(huán)連接，這種結構對蛋白質與DNA的結合以及蛋白質分子二聚化都是很重要的。-折疊 蛋白質分子中反向平行的折疊插到DNA分子的大溝中直接與堿基相互作用，這類蛋白質分子也經(jīng)常形成二聚化。乳糖操縱子（1）如有乳糖存在時，乳糖轉化為半乳糖，此時與蛋白質結合使阻遏蛋白變性，啟動子處于開放狀態(tài)：（2）無乳糖時，阻遏物可以結合在操縱基因上，阻止轉錄過程，導致基因關閉?；?負載特定遺傳的DNA片段，包括由編碼序列，非編碼序列組成的DNA序列。CDNA 以mRNA為模板，在反轉錄酶的作用下合成的DNA?；蚪M 指來自一個遺傳體的一整套遺傳信息。在真核生物體，基因組是指一套完整的單倍體的染色體DNA和線粒體DNA的全部序列?；虮磉_ 基因的攜帶的遺傳信息，經(jīng)轉錄，翻譯等，產(chǎn)生具有特異生物學功能的蛋白質分子的過程。但對于rRNA、tRNA編碼基因，基因表達僅是轉錄的過程?；虮磉_的特異性 ：時間特異性 某一特定基因的表達嚴格特定的時間順序發(fā)生，多細胞生物基因表達的時間特異性與發(fā)育階段相關，故又稱階段特異性空間特異性 在個體生長發(fā)育過程中，某種基因在個體不同組織（空間）表達的差異，基因表達伴隨時間順序所表現(xiàn)出的這種空間分布的差異，實際上由細胞在個體的分布所決定，空間特異又稱細胞組織特異性。基因表達的方式基因表達 某類基因在一個個體的幾乎所有細胞中持續(xù)表達，通常被稱為管家基因。它們較少受環(huán)境因素影響，而且在個體各個生長階段的幾乎所有組織中都持續(xù)表達，這類基因表達稱為基因表達或組成性表達誘導和阻遏表達 在特定環(huán)境信號刺激下，相關的基因可被激活，基因表達產(chǎn)物增加，這種基因稱為可誘導基因，可誘導基因在特定的環(huán)境中表達增強的過程被稱為誘導?？勺瓒舻鞍?如果基因對環(huán)境信號應答是被抑制，這種基因稱為可阻遏蛋白。阻遏 可阻遏基因表達產(chǎn)物水平降低的過程稱為阻遏?；虮磉_調控的基本機理基因表達調控的多層次和復雜性：基因激活、轉錄起始轉錄后加工mRNA降解、蛋白質翻譯翻譯后加工修飾蛋白質降解等基因轉錄激活調節(jié)基本要素：基因表達的調節(jié)與基因的結構、性質、生物個體或細胞所處的內外環(huán)境以及細胞內存在的轉錄調節(jié)蛋白有關。啟動序列(promoter):是RNA聚合酶結合并啟動轉錄的特異DNA。操縱序列(operator):阻遏蛋白識別、結合的DNA序列，當操縱序列結合有阻遏蛋白時，會阻礙RNA聚合酶與啟動序列的結合，或是RNA聚合酶不能沿DNA向前移動，阻礙轉錄。真核生物基因的特異DNA序列：順式作用元件(cis-acting element)：可影響自身基因表達活性的DNA序列。包括啟動子、增強子、沉默子等。調節(jié)蛋白 原核生物基因調節(jié)蛋白分3類：特異因子決定RNA聚合酶對啟動序列的特異性的特異性識別和結合能力阻遏蛋白 可結合操縱序列，阻遏基因轉錄，介導負性調節(jié)機制激活蛋白(activator) 結合啟動序列鄰近的DNA序列，促進RNA聚合酶與啟動序列的結合，增強RNA聚合酶活性，介導正性調節(jié)機制。真核基因的調節(jié)蛋白 絕大多數(shù)此蛋白可通過與順序作用元件識別結合，反式激活另一個基因的轉錄，又稱反式作用因子，這種作用叫反式作用。（元件：DNA調節(jié)序列，因子：蛋白質）。順式作用：某些真核轉錄因子可特異識別，結合自身基因的調節(jié)序列，調節(jié)自身基因表達，稱為順式作用。DNA-蛋白質相互作用反式作用因子與順式作用元件之間的特異識