（動物遺傳育種與繁殖專業(yè)論文）小鼠胚胎附植中no對子宮內(nèi)膜mmp9+mrna表達的影響.pdf

湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 摘要 本研究將性成熟昆明系小白鼠隨機分為未妊組( 不作處理的未妊小鼠) 、妊娠對照組 ( 注射生理鹽水的妊娠小鼠) 和妊娠抑制組( 注射一氧化氮合酶抑制劑小鼠) ，分別采用 r t - p c r 方法對各組小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)金屬蛋白酶一9 ( m m p 一9 ) 基因m r n a 的表達水平進行了 檢測，探討了胚胎附植前期、附植期和附植后期子宮m 口一9 基因表達水平的變化和n 0 對 子宮砌i p - 9 基因表達的影響，其結(jié)果如下： 1 小鼠胚胎附植過程中子宮內(nèi)膜_ 哪- 9 曲n a 的表達水平 結(jié)果表明：1 6 1 p - - 9 在性成熟未妊小鼠及正常妊娠小鼠的胚胎附植前期，附植期和附植 后期均有不同程度的表達，未妊組小鼠子宮m 驢- 9m r n a 的相對表達量為0 4 7 o 0 1 ；妊 娠對照組小鼠子宮l 刪p - 9m r n a 的相對表達量在胚胎附植前期為0 8 1 o 0 5 ，附植期為 1 5 4 0 1 0 ，附植后期為0 4 0 ：1 ：0 0 2 。與未妊組小鼠相比，正常妊娠小鼠刪p - 9m r n a 的相 對表達量在附植前期和附植期有極顯著增加( p o 0 1 ) ，附植期達到高峰，附植后期恢 復到未妊組的水平。 2 小鼠胚胎附植過程中一氧化氮對子宮內(nèi)膜m 驢_ 9 基因表達水平的影響 在抑制組中本研究利用一氧化氮合酶( n 0 s ) 抑制劑l - n a 艟，分別處理附植前期、附 植期和附植后期妊娠小鼠，觀測一氧化氮( ) 生成受抑制時子宮內(nèi)膜砌i p - 9r l r n a 表達 水平的變化。結(jié)果表明：注射n o s 抑制劑后，子宮內(nèi)膜刪p _ 9m r n a 水平在附植前期( 檢 測不到表達) 和附植期( o 4 7 0 1 5 ) 均受到明顯抑制，極顯著低于妊娠對照組同期附 植過程的砌i p - 9m r n a 表達水平( p 0 0 5 ) 。 3 一氧化氮對小鼠子宮及其內(nèi)膜形態(tài)變化及脫膜化的影響 光鏡觀察結(jié)果表明，附植過程中，妊娠對照組的子宮內(nèi)膜發(fā)育明顯，上皮細胞增高， 腺體發(fā)達，間質(zhì)疏松，間質(zhì)細胞增大，發(fā)生明顯的蛻膜樣變。相比較而言，抑制組子宮內(nèi) 膜柱狀上皮細胞相對較低，腺體數(shù)少，子宮內(nèi)膜在附植后期出現(xiàn)較明顯退行性變化，基質(zhì) 變得緊密。 綜上所述，一氧化氮作為一種內(nèi)源性平滑肌松馳劑和血管擴張劑，對子宮內(nèi)膜 i 腳i p - g m r n a 的表達有著極為顯著的調(diào)節(jié)作用，在附植過程中一氧化氮抑制后能顯著降低 蛐i p - - 9 基因的表達，推斷n o 可能部分通過對轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控來影響m m p - 9 的表達，并進 一步影響子宮內(nèi)膜發(fā)育和胚胎的附植。 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 關(guān)鍵詞：胚胎附植一氧化氮子宮內(nèi)膜基質(zhì)金屬蛋白酶基因表達 a b s t r a c t s e x u a l m a t u r em i c ew c i er a n d o m l ya s s i g n e dt o3g r o u p s ：n o n - p r e g n a n tg r o u p ( w i t h o u t t r e a t m e n t ) 、p r e g n a n tc o n t r o lg r o u p ( t r e a t e dw i t h0 9 s o d i u mc h l o r i d e 硒e c t i o n ) a n d i n h i b i t o rg r o u p ( t r e a t e dw i t hn i t r i co x i d es y n t h a s e i n h i b i t o r ) t h em r n ae x p r e s s i o no f m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e - 9 ( h m 心- 9 ) o f 姍眥e n d o m e t r i u mi nt h eg r o u p sw a sd e t e r m i n e db y t h ei c v c f s 4 。t r a n s e r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( 盯- r c x ) t h eo b j e c t i v eo ft h i ss t u d yw a s t oi n v e s t i g a t ec h a n g e so fm r n a e x p r e s s i o no fm o b s ce n d o m e t r i u mm m p - 9i nt h ee a r l y i m p l a n t a t i o np h a s e ，i m p l a n t a t i o np h a s ea n dl a t ei m p l a n t a t i o np h a s ea n d t od e t e r m i n et h ee f f e c t o f n i t r i co x i d e ( n 媯o i li t 。mr e s u l t sw c g t ：a sf o l l o w s ： 1 t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fe n d o m e t r i u mm a t r i xm e t a l l o p r o t e h m s e - 9m r n ad u r i 唧n l o l l l s e e m b r y oi m p l a n t a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a st h ed i f f e r e n te x p r e s s i o no fe n d o m e t r i n mm m p 9 m r h ai nt h en o n - p r e g n a n tm i c ea n dt h ep r e g n a n tm i c ed u r i n ge m b r y oi m p l a n t a t i o n , w h i c h w c i cf o u n da tal e v e lo f0 4 7 - - - 0 0 1i nt h en o n - p r e g n a n tm i c ea n do 8 1 0 0 5i nt h ee a r l y i m p l a n t a t i o np h a s e 1 5 4 0 1 0i n t h ei m p l a n t a t i o np h a s ea n do 4 0 0 0 2i nt h el a t e r i m p l a n t a t i o np h a s e ，r e s p e c t i v e l y i nc o m p a r i s o nw i t ht h en o n - p r e g n a n tm i c e ，t h ee x p r e s s i o no f m m p - 9m r n aw a ss i g n i f i c a n t l ye n h a n c e di nt h ee a r l yi m p l a n t a t i o n p h a s ea n d i nt h e i m p l a n t a t i o np h a s e ( p o 0 1 ) ，r e a c h i n gu pt ot h e 缸t i g i n m i nt h ei m p l a n t a t i o np h a s ea n dt h e n g e t t i n gb a c ki nt h el a t ei m p l a n t a t i o np h a s et ot h el e v e lo f t h en o n - p r e g n a n tm i c e 2 e f f e c to f n i t r i co x i d eo ne x p r e s s i o no f m t r l xm e t a l l o p r o t e i n a s e - 9m r n a d u r i n gm o u s e e m b r y oi m p l a n t a t i o n t h e c h a n g e so ft h em r n ae x p r e s s i o no fm o u s ce n d o m e t r i u mm m p - 9 w e r cd e t e r m i n e d i nt h ei n h i b i t o rg r o u p i nw h i c hp r o d u c t i o no fn ow a ss u p p r e s s e db yt r e a t m e n tw i t h 丑衄r i c o x i d es y n t h a s ei n h i b i t o rl - n a m ei nt h ee a r l yi m p l a n t a t i o np h a s e ，i m p l a n t a t i o np h a s ea n dl a t e i m p l a n t a t i o np h a s e t h e r e s u l t sw e r es h o w e dt h a tt h em r n ae x p r e s s i o no fm o u s e c n d o m c t r i n mm l v l p - 9i nt h ee a r l yi m p l a n t a t i o np h a s e ( n oe x p r e s s i o n ) a n di m p l a n t a t i o np h a s e n 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 ( 0 4 7 4 - 0 1 5 ) i nt h ei n h i b i t o rg r o u pw a sr e s t m 抽e da n dw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a ti n p r e g n a n tc o n t r o lg r o u p ( p 0 0 5 ) ；l - n a i 匝0 2m g 只處理組植入胚胎數(shù)顯著降低( p o 0 5 ) 。為迸一步探討n o t 胚胎植 入中的作用機理，用明膠酶譜方法檢測了子宮中m m p s - 2 和l 刪p s - 9 的活性，結(jié)果顯示：與 對照側(cè)相比，l - n a m e0 2m g 只處理組子宮中i 刪p - 2 的活性沒有變化，而m 腫_ 9 活性顯著 下降；l - n a m e 與s n p 合并應(yīng)用后，1 6 1 p - 9 的活性恢復正常。結(jié)果表明，n o n , j , 鼠胚胎植入 起促進作用，這種作用可能是通過影響 伽，_ 9 的活性實現(xiàn)的。 袁益明等“”在研究n o 對哮喘大鼠m 肝s 及金屬蛋白酶組織抑制物表達的影響時發(fā)現(xiàn) l - a r g 組i 腳p - 2 m r n a 水平較哮喘組增加，而t 1 m p - i 水平兩組比較差異無顯著性，同時肺組 織n 擴和n o p - 水平與m 肝2m i l m 水平呈顯著正相關(guān)，表明n 0 可能影響哮喘大鼠蛐艫一2 的表達， 改變m m p 一2 t i m p 一1 平衡。 g il b e r t 等m 1 在體外培養(yǎng)的大鼠主動脈平滑肌細胞中，用非選擇性n o s 抑制劑l - n m m a 抑制i l 一1 b ( 白細胞介素- 1 ) ，t n f a ( 腫瘤壞死因子一d ) 等細胞因子誘導的n o s 表達生成 的大量n o ，發(fā)現(xiàn)l n m m a 以劑量依賴性方式增加舯一9 的合成與表達，而舯一2 表達并無明 顯的增高。u p c h u r c h 等報道了相同的研究結(jié)果。m i l i n d 等m 1 通過腺病毒載體將e n o s 基因 轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠主動脈平滑肌細胞，為證實n o l o 制v s m c ( 血管平滑肌細胞) 的增殖與 遷移是通過調(diào)節(jié)h 咿的活性與表達而介導；結(jié)果發(fā)現(xiàn)e n o s 基因轉(zhuǎn)染后v s m c 的增殖明顯被抑 制，i 腳p - 2 及i & i p - 9 的活性明顯降低，而m 腫抑制劑t i m p - 2 表達明顯增加。另外，在細胞培 養(yǎng)基中加入n o 供體和c g m p 類8 - b r o m o c g m p 培養(yǎng)2 4 h 后，同樣發(fā)現(xiàn)舯一2 與硒儼一9 活性明顯降 低，表明n 0 可能通過c g m p 調(diào)節(jié)m 艫s 的活性。e b e r h a d t 等應(yīng)用n o 供體s 一亞硝基一乙酰青霉 胺( s n a p ) 發(fā)現(xiàn)在腎小球膜細胞中n o 對于i l 一1 p 誘導的i 刪p - 9 m r n 水平有顯著地抑制作用。 同樣表明內(nèi)源性n o 的產(chǎn)生對m 船啕的表達呈抑制作用。 m m p s 是一個結(jié)構(gòu)同源、依賴鋅離子并以e 咧成分作為水解底物的蛋白酶家族。它通過 1 4 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 對e c m 的降解而參與機體的多種生理和病理過程。對大鼠子宮分離組織的研究表明，n o s 的抑制劑能降低m m p - 2 的活性，相反n 0 的供體卻能提高m m p 一2 的活性，提示n 0 可能通過上 調(diào)m m p 一2 而參與大鼠胚胎的植入過程”。眾多研究表明，環(huán)磷酸鳥苷( c g m p ) 是n 0 作用于 靶細胞產(chǎn)生的主要第二信使，可以通過下游許多分子發(fā)揮n o 的作用m 1 。鑒于此，沈政等 采用小鼠胚泡體外植入模型，利用n o s 抑制劑l 一單甲基一精氨酸、n o 供體s 一亞硝基一乙酰 青霉胺8 - b r c g 肝對胚泡黏附擴展以及m m p - 2 分泌的影響進行研究發(fā)現(xiàn)，n o 能促進體外小鼠 胚泡的黏附、擴展及m m p - 2 的分泌，提示n 0 的這些作用可能是通過c g m p 來實現(xiàn)的。 2 6 問題與展望 成功的胚胎植入要求胚胎與子宮內(nèi)膜發(fā)育一致，體內(nèi)研究表明，n 0 可能從胚胎發(fā)育 和影響子宮環(huán)境兩方面參與胚泡植入。m 妒s 作為e c m 主要降解酶之一，是一把雙刃劍，既 有保護性作用，又有引起損傷性作用嘲。這種差異可能存在于胚胎附植的不同階段。盡 管人們對于h 咿s 的結(jié)構(gòu)、生物化學特性、功能、催化機制、特異性的底物及t i m p s 對它們 抑制的機制都有了深刻的了解，但仍有許多問題未弄明白。對于前m 妒一2 _ t i 肝一2 復物的 結(jié)構(gòu)的了解十分有助人們了解前m 儼一2 在細胞表面如何與t i 肝一2 與m t i - 砌i p 裝配在一起 n 町。然而，在細胞遷移之間是如何進行時間與空間上的裝配這樣精確的機制尚不可知。 另外，盡管膠原酶是m 妒s 家族中首先被發(fā)現(xiàn)的成員，但到底是叫l(wèi) 型膠原酶還是裂解三螺 旋膠原酶人們還不知道。同時t i 肝一3 對a d a i i 家族的金屬蛋白酶的抑制機制也有待于人 們?nèi)フJ識。 基質(zhì)金屬蛋白酶水解細胞外基質(zhì)是滋養(yǎng)層細胞侵襲的前提條件，了解和掌握基質(zhì)金 屬蛋白酶的作用及調(diào)控機制，可幫助我們更精確地把握滋養(yǎng)層細胞侵襲行為。雖然目前 國內(nèi)外已對m 口s 系統(tǒng)在生殖中的作用作了大量廣泛的研究，但尚缺乏對a n 艫s 抑制劑如 肛儺、p n l 等在滋養(yǎng)層細胞侵襲及胚胎植入時的作用及作用機制的研究，深入蛋白酶抑 制劑的研究有助于防治自然流產(chǎn)、妊高征、宮內(nèi)發(fā)育遲緩等疾病，促進避孕技術(shù)研究的 發(fā)展，并可對惡性腫瘤的治療提供新的線索。 在胚胎植入過程中n o 調(diào)節(jié)h 刪p s 的活性和表達的機理并不清楚，可能通過c g m p 等不同 的途徑調(diào)節(jié)m m p s 的變化及m m p s t i 卯的平衡，從而影響胚胎附植的成功與失敗，因而研究 對m 肝的調(diào)節(jié)作用及具有非常重要的意義。同時，了解n o 與刪p 之間的相互關(guān)系將為胚 胎附植的分子調(diào)控機理的研究提供新的手段和方法。但n 0 對m 咿的調(diào)節(jié)作用可能較復雜， 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 并不是簡單的促進或抑制，可能存在一個n o 濃度的臨界值，臨界值上下的濃度產(chǎn)生的作 用可能不同甚至相反，故仍需大量的研究。 2 研究的目的與意義 本研究將通過盯呻僳的方法檢測妊娠早期m 肛_ 9 基因的生理表達及在n 0 抑制情況 下的表達，探討胚胎附植過程中n o 和m 驢一9 的生理作用，揭示m m p - - 9 在胚胎附植前后的 生理變化特點，并通過不同處理下小鼠子宮內(nèi)膜的變化來了解n o 、m m p - 9 的作用機理及n o 與m 咿_ 9 之間的相互關(guān)系。研究圍繞小鼠胚胎植入過程中n o 在妊娠早期的不同時期對 _ m 伊s 活性和表達的調(diào)節(jié)，探討m 肝s 活性和表達的動態(tài)變化，以充分了解n o 在植入中的 作用機理，以達到進一步了解胚胎植入的網(wǎng)絡(luò)級聯(lián)調(diào)節(jié)通路的目的。本研究對深入探討 早期胚胎發(fā)育機制，揭示其發(fā)育過程的調(diào)節(jié)規(guī)律及對了解一氧化氮、m m p - 9 的具體的生理 作用和對胚胎附植過程的作用分子機理有極其重要的意義，為提高胚胎附植率、動物產(chǎn)仔 數(shù)及一氧化氮相關(guān)疾病的治療提供了重要的供理論依據(jù)和新思路。 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 材料與方法 1 驗材料 1 1 試驗用卜硝基一l 精氨酸甲酯 l - n a m e 為美國s i g m a 公司產(chǎn)品，其基本資料如下： 形態(tài)： 白色結(jié)晶 分子量：2 6 9 7 分子式：c 7 h 1 5 n s 0 4 h c l 結(jié)構(gòu)： 晰 剛、i 飛吲意訛懈t hhh ”刑 。 純度：9 8 b y 印l c 溶劑：8 2 0 ( 5 0m g m 1 ) 貯存：- 2 0 。c 避光冷凍保存 1 2 試驗動物 試驗動物為昆明系小白鼠，購自湖南中醫(yī)學院小動物實驗室，7 0 日齡，體重3 5 9 左 右。飼料一并購入，自由采食，自然采光進行飼喂，有完整的歷史記錄。 1 3 主要試驗儀器及型號 梯度p c r 儀：德國c p p e n d o r f 生產(chǎn)，型號為5 3 3 1 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京六一儀器廠生產(chǎn)，型號為d y y - 6 b 凝膠成像系統(tǒng)：美國u v ps i o l m a g i n gs y s t e m 生產(chǎn)，型號為g d s 一8 0 0 0 紫外分析儀：北京六一儀器廠生產(chǎn)，型號為w d 9 4 0 3 b 紫外分光光度計；德國e p p e n d o r f 生產(chǎn)，型號為6 0 3 10 5 4 3 0 超低溫冰箱：青島海爾股份有限公司生產(chǎn)，型號為b d - 3 9 6 l t - 6 5 w 臺式離心機：德國e p p e n d o r f 生產(chǎn)，型號為c e n t r i f u g e5 4 1 5 d 低溫離心機：德國c p p e n d o r f 生產(chǎn)，型號為c e n t r i f u g e5 8 1 0 r 微波爐：青島海爾股份有限公司生產(chǎn)，型號為h r 6 7 0 2 d w 立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)，型號為l d z x - 4 0 b i 低溫離心機：德國e p p e n d o r f 生產(chǎn)，型號為c e n t r i f u g e5 8 1 0 r 1 7 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 超凈臺：蘇凈集團安泰公司 恒溫培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)有限公司 立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)，型號為l d z x 4 0 b i 制冰機：德國s c o t s m a n 生產(chǎn)，型號為a f l 0 0 超純水機：重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司生產(chǎn)，型號為a u p - 1 3 5 g - 2 干燥箱：上海躍進醫(yī)療器械廠生產(chǎn)，型號為1 0 1 - 2 - b s 1 4 主要試劑及來源 t r i o l ：美國i n v i t r o g e n 公司 i 汀- p c r 試劑盒：德國m b i 公司 2 x t a qp c rm a s t e r m i x ：貨號：k t 2 0 1 ，購自北京天為時代科技有限公司 瓊脂糖及t r i s ：購自r o c h e 公司 g e n er u l e r t m i o o b p d n al a d d e r ：貨號：m d l 0 9 ，購北京天為時代科技有限公司 緩沖液和常用試劑的配備： ( 1 ) w e 緩沖液：l o mm o l lt r i s c i ( p h8 0 ) 、l mm o l le d t a ( p h 8 o ) ，高壓滅 菌。 ( 2 ) 5 0 x t a e 緩沖液；2 4 2 9t r i s 溶于7 0 0 r a l 雙蒸水中，加入5 7 1 m i 冰乙酸、1 0 0 m l 0 5 m o l le d t a ( p h8 o ) ，定容至1 0 0 0 m l ，室溫存放待用。 ( 3 ) 瓊脂糖凝膠電泳上樣緩沖液：0 2m o l le d t a 、3 0 甘油、0 2 5 - - 甲苯青、0 2 5 9 6 溴酚蘭。 。 ( 4 ) l m o l lt r i s c 1 ( p h8 o ) ：將1 2 1 i gt r i s 溶于8 0 0 r a l 雙蒸水中，加濃鹽酸 調(diào)p h 到8 0 定容至1 0 0 0 m l ，滅菌備用。 ( 5 ) 0 5 m o l le d t a ( p h8 0 ) ：8 0 0 r a l 雙蒸水加入1 8 6 1 9 二水乙二胺四乙酸二鈉， 加n a o h 調(diào)p h 值至8 0 ，定容至1 0 0 0 m l ，滅菌備用。 ( 6 ) i o d e p c ：1m ld e p c 溶解于1 l 雙蒸水中，用磁力攪拌器攪拌3 0 r a i n 以上，高 壓滅菌。 2試驗方法 2 1 試驗分組及處理 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 挑選性成熟、生長健康、體重3 0 9 左右的雌性小白鼠。每次2 0 只進行超排處理。下 午2 4 時腹腔注射p m s gi o i u 只，4 6 4 8 小時后腹腔注射h c 6l o i u 只，并與l o 只公 鼠按1 ：1 合籠，過夜，第二天早上8 ：0 0 檢查陰道栓，以驗栓呈陽性為妊娠第l d ，根據(jù)胚 胎發(fā)育特點( 一般4 5 d 胚泡開始附植子宮內(nèi)膜) ，將妊娠早期分為附植前期( d i d d ) 、附 植期( d 5 d 6 ) 和附植后期( d 7 d i o ) 試驗分三期進行( 附植前期，附植期，附植后期) ，并隨機分為3 組，即將處于妊娠早期 各個階段( 附植前期d 4 、附植期d 6 和附植后期d 9 ) 的孕鼠隨機分為注射生理鹽水的對照組 和和注射n o s 抑制劑的n o s 抑制組以及處于相同日齡未作交配小鼠的未妊組，每組5 個重 復。對照組和n o s 抑制組采取腹腔注射的方法處理，分別于各個階段采取子宮前4 8 h ，對 照組注射生理鹽水o 1 m l 只，抑制組注射一氧氣化氮合酶抑制劑l - n a 娩( l 一硝基一精氨酸 甲酯) s m y r ，并于妊娠第4 天、6 天和9 天脫臼處死試驗鼠，剖腹采取子宮，未妊組小鼠則 不作任何處理，并與其他組同時采取子宮。各組子宮采取后，剔凈系膜組織，隨即進行檢測。 左側(cè)子宮用于總r n a 提取，右側(cè)子宮用于切片制作。 2 2m h p - 9 半定量r t - p c r 2 2 1 總r n a 提取 取5 0 m g 左側(cè)子宮組織樣于研磨器中，迅速加入l m i t r i z o l 試劑，研碎并劇烈振蕩至 透明的，以充分裂解細胞。室溫5 分鐘后，將上清移至新e p 管中，加入0 2 m l 氯仿，搖 動1 5 s ，室溫放置2 3 分鐘，然后在1 2 0 0 0 印m4 c 離心1 5 分鐘。轉(zhuǎn)移約4 0 0pl 水相至 一新管內(nèi)，再加入0 5 r i d 異丙醇混勻，4 c 放置1 0 1 5 分鐘。在4 c 下1 2 0 0 0 r p m 離心1 0 分鐘。棄上清，加i m l 7 5 乙醇洗滌r n a ，4 c 7 5 0 0 r p m 離心5 分鐘。離心后，倒出乙醇， 置空氣中干燥5 1 0 分鐘，再加入適當?shù)膁 e p c 處理水，室溫下溶解1 0 2 0 分鐘。 2 2 2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù) i - ( h t t p ：w w w n c b l h i m n i h s o y ) g e n b a n k 公布的m t p 一9 基因及內(nèi)參照b - a c t i n 基因序列，通過p r i m e rp r e m i e r5 軟件按引物要求完成，并由北京奧科生物工程 有限公司合成。m m p - 9 基因引物序列為5 一t 從c c ct 6 6t c ac c g g a ct t c - 3 ( 上游引物) 和5 吐t ac g tt c cc g gc t ga t ca 6 - 3 ( 下游引物) ；內(nèi)參照且一a c t i n 的引物為5 - a c a c r gt 6 cc c at c ta c 6a 6 6 - 3 ( j z 游引物) 和5 a 6 6g g cc g ga c tc 6 tc a ta c t 一3 ( 下 游引物) 。 2 2 3 反轉(zhuǎn)錄 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 在離心管中加入3 l lgr n a 模板，1 u 1 隨機引物o l i g o ( d t ) ，8 p 1d e p c 處理水，3 5 秒簡短離心，7 0 溫育5 分鐘，冰浴2 分鐘，再加入4pl5 r e a c t i o nb u f f e r ，1l ilr n a s e i n h i b i t o r ，2 工ll d n t p 3 5 秒離心，3 7 溫育5 分鐘，加入r e v e r t a i dm _ m u l vt r a n s c r i p t a s e 1pl ，共2 0pl 反應(yīng)體系4 2 溫育l d , 時后，7 0 溫育1 0 分鐘，冰浴2 分鐘。即可得n c d n a 產(chǎn)物。 2 2 4p c r 擴增 在離心管中加入1l llc d n a 產(chǎn)物，1 2 5l llt a k a r at a qm i x t u r e ，9 5pl d d h 2 0 , 2 0 p m o l 上下游引物，反應(yīng)體積共2 51 11 。p c r 反應(yīng)條件：預熱9 5 ，5 r a i n ；然后 9 4 變性，4 5 s e c ；6 0 退火，3 0 s c c ；7 2 延伸，4 5 s e c ，3 0 個循環(huán)；然后7 2 末延伸l o m j n 。 2 2 5 瓊脂糖凝膠電泳 向1 5 m l t a e 電泳緩沖液中加入1 5 m g 的瓊脂糖，在微波爐中加熱使其溶解，稍微冷卻后， 加入濃度為0 5 | ig i i1 5 3 e b ( 溴化乙淀) 2 2u1 ，混勻后將凝膠倒入制膠板中，室溫放置 2 0 m i n ，待凝固后，小心移去梳子，取p c r 反應(yīng)液3 5l il ，用微量移液器將樣品緩緩加入加 樣孔中，6 0 v 恒壓電泳3 0 m i n ，電泳完畢后，紫外燈下觀察結(jié)果，并用凝膠圖像系統(tǒng)掃描分 析電泳結(jié)果。 2 2 6 半定量及統(tǒng)計分析 以b - a c t i n 作內(nèi)參，重復進行3 洳4 m p 一9 和b - a c t i n 的p c r 擴增，對其產(chǎn)物進行凝膠電 泳檢測。運用u v i p r o 凝膠圖像分析系統(tǒng)攝像并掃描分析，以目的基因條帶的吸光度( a ) 值 與p - a c t i n 條帶a 值的比值作為目的基因m r n a 的相對表達強度。凝膠電泳圖的目的基因條 帶經(jīng)q u a n t i yo n e 軟件( b i a - r a d ) 掃描后，根據(jù)所得的各組數(shù)據(jù)計算出目的基因的相對 表達量，兩組均數(shù)間比較采用t 檢驗，多組均數(shù)間比較用方差分析，顯著性差異以p o 0 5 和 p ( o 0 1 為標準，數(shù)據(jù)以i s 表示，均采用s a s 8 1 軟件包進行統(tǒng)計分析。 2 3 子宮組織切片的制備 2 3 1 取材 小鼠處死后，應(yīng)快速取出所需的子宮組織。取材的刀要鋒利，嚴禁用手或鑷子擠壓， 以免損傷組織。切取的組織塊厚度一般為0 5 - 1 o c m ，大小1 5 - 2 o c m ，以免影響固定效 果。 2 3 2 固定 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 固定是將組織塊用福爾馬林浸泡，使組織內(nèi)的蛋白質(zhì)等成分迅速凝固或沉淀，停止 細胞瀕死前或死亡后的變化。同時組織固定后不易變形，有利于以后的組織處理。所以 組織一旦離體必須及時固定，固定液的量大約為組織的5 倍。常用1 0 的福爾馬林、z e n k e r 氏等固定液。固定時間約為2 4 h 。 2 3 3 沖洗 固定好的組織塊需經(jīng)流水沖洗2 4 h ，沖洗不徹底容易造成脫片和染色不佳。 2 3 4 脫水和透明 脫水就是利用脫水劑將組織內(nèi)的水分置換出來，以利于有機溶劑的滲入。脫水是否 徹底，直接關(guān)系到組織能否充分透明。脫水一般采取上行梯度酒精，從8 0 酒精、9 5 酒精至無水酒精。還要注意組織在無水酒精內(nèi)時間過久，容易發(fā)脆，一般約為4 h 。組織 塊脫水后就進入透明步驟，即經(jīng)過一種既能與脫水劑混合，又能與石蠟相溶的媒介物質(zhì)。 目前最好的透明劑是二甲苯，但二甲苯容易使組織發(fā)脆，所以在二甲苯中時間也不宜過 長，一s t 4 0 - 6 0 m i n 。 2 3 5 浸蠟 組織透明后，在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過程稱為浸蠟。浸蠟溫度過高( 超過7 0 ) ，會 導致組織發(fā)硬，還會使組織內(nèi)的抗原受到破壞。浸蠟用的石蠟熔點一般在5 6 2 3 - 6 0 2 2 ， 浸蠟溫度控制在6 0 c - 7 0 c 。浸蠟時間的長短直接影響組織切片，不同的組織浸蠟時間不 同，通常較脆組織如肝、甲狀腺、脾等浸蠟2 - 3 h ，含有結(jié)締組織的器官如胃、膀胱、腸 等浸蠟時間要延長6 h 。所用的石蠟如有雜質(zhì)盡可能過濾，以防附著在組織上，影響切片 與觀察。鼠塊組織時問量化自動脫水，透明，浸蠟流程： 乙醇溶液 7 5 3 5h 804h 9 5 i2h 9 5 i i2h 1 0 0 i 1h2 0m i n 1 0 0 i i2h2 0m i n 1 ：1 二甲苯與酒精 1 0m i n 二甲苯i 3 0m i n 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 二甲苯i i 石蠟i 石蠟i i 石蠟 2 3 6 包埋 3 0m i n 1 0m i n 1 5 m i n 3 5h 用包埋劑來支持組織的過程稱為包埋。最常用的是石蠟包埋法。包埋的關(guān)鍵是平整 和方位。包埋時，要求用鑷子輕壓組織塊拱起部份，使之平貼于底部，通常采用組織的 最大面包埋；囊壁、管腔組織應(yīng)豎直包埋。修去兩邊的余蠟( 指切片時與切片刀垂直的兩 側(cè)) 。 2 3 7 切片 切片的第一步需粗切。粗切的厚度2 0 - 4 0um ，粗切至組織全部暴露后，再進行細切。 細切至組織塊表面均勻一致，無白點。切片時要求用力均勻、柔和，切片厚度一般為3 5 l im ，切下的蠟膜大小、形狀應(yīng)與組織塊上的組織大小形狀一致。如氣溫較高，石蠟組織 塊較軟可用冰塊局部冰凍( 操作狀態(tài)下) ，使組織塊變硬便于做連續(xù)性切片；如氣溫較低、 石蠟組織塊較硬時可用大拇指熱敷或用嘴吹氣加溫，使組織塊變軟再做連續(xù)性切片。 2 3 8 展片與撈片 把切片放人溫水中展開即為展片。展片水溫應(yīng)在4 8 c - 5 5 c ，這主要和包埋蠟的熔 點有關(guān)：水溫過高，會引起組織細胞散開；水溫過低，切片皺摺無法攤平。展開片子上 的皺摺，有兩個方法：在切片時邊切邊向蠟片吹氣，這樣片子放到熱水里會自然展平； 切片結(jié)束后，先把切片放在3 0 酒精水溶液中，讓酒精的張力自動把皺摺展開，然后 再將切片移到熱水中，酒精濃度不宜過高，否則容易引起切片破碎，出現(xiàn)裂隙。脂肪類 組織遇到酒精會散開，故不能用此法。撈片時，要選擇那些完整、無皺摺的切片，粘貼 于載玻片上。 2 3 9 烤片和脫蠟 烤片是烤干切片上多涂的水分和石蠟，并使切片與載玻片牢固粘貼。一般在6 0 c 的 溫箱內(nèi)進行，溫度過高，會引起切片的組織細胞收縮；時間太短( 少于2 0 分鐘) ，容易造 成脫片。脫蠟也相當重要，如果脫蠟不干凈，切片不易著色或著色不勻。所以在脫蠟過 程中，脫蠟劑( 松節(jié)油) 要常更換( 用1 5 - 2 0 次) ?？酒Y(jié)束后立即將切片放在溫箱內(nèi)預熱( 4 0 c - 4 5 c ) 的松節(jié)油i 、i i 中1 5 m i n ，然后經(jīng)下行梯度酒精洗去松節(jié)油至水。 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 2 3 1 0 染色 染色理想的切片在顯微鏡下應(yīng)是細胞核與細胞質(zhì)藍紅相映，色澤鮮艷，核漿對比明 顯，核膜及核染色質(zhì)顆粒清晰可見。常用臟染色，以增加組織細胞結(jié)構(gòu)各部分的色彩差 異，利于觀察。蘇木精( h e m a t o x y l i n ，h ) 是一種堿性染料，可將細胞核和細胞內(nèi)核糖體 染成藍紫色，被堿性染料染色的結(jié)構(gòu)具有嗜堿性。伊紅( e o s i n ，e ) 是一種酸性染料，能 將細胞質(zhì)染成紅色或淡紅色，被酸性染料染色的結(jié)構(gòu)具有嗜酸性。染色前，須用二甲苯 脫去切片中的石蠟，再經(jīng)由高濃度到低濃度酒精，最后入蒸餾水，就可染色。呱染色過 程是： 將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘。 酸水及氨水中分色，各數(shù)秒鐘。 流水沖洗i 小時后入蒸餾水片刻。 入7 0 和9 0 酒精中脫水各1 0 分鐘。 入酒精伊紅染色液染色2 - 3 分鐘。 2 3 i i 脫水和封片 切片脫水采用上行梯度酒精。濃度低的酒精比濃度高的酒精更容易脫水，但也容易 使伊紅退色故脫水時間要短( 1 2 m i n ) ，也可無須用酒精脫水而直接晾干。切片經(jīng)二甲苯 透明。用中性樹膠封片，一定要避免氣泡的產(chǎn)生。 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 結(jié)果與分析 1 總8 n a 提取結(jié)果 提取的總r n a 經(jīng)紫外分光光度計測得a 2 “a 瑚在1 8 到2 0 之間，并且在o 8 瓊脂 糖凝膠電泳上可清晰看到2 8 s 和1 8 s 兩條帶( 圖2 ) ，其亮度比為2 ：1 ，并可見5 s 帶， 表明所提的r n a 純度高，未降解，可作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板。 圖2 總p , n a 電泳圖 2 退火溫度、循環(huán)次數(shù)和引物濃度的選擇 2 1 退火溫度 根據(jù)合成引物的t m 值：采用2 ( a + t ) + 4 ( g + c ) ，正反義平均數(shù)上下波動4 5 進行 檢測，瓊脂糖凝膠電泳確定以6 0 c 為最佳退火溫度。 2 2 循環(huán)次數(shù)的選擇 內(nèi)參循環(huán)次數(shù)的確定( 見圖3 ) ，從1 - 1 0 號帶分別為1 5 ，1 7 3 1 ，3 3 個循環(huán)，檢測結(jié)果 以2 7 個循環(huán)為最佳循環(huán)次數(shù)。1 0 1 p - 9 循環(huán)次數(shù)的確定( 見圖4 ) ，1 號帶為內(nèi)參，從2 - 1 0 號帶分別為2 5 ，2 7 3 9 ，4 1 個循環(huán)，檢測結(jié)果以3 7 個循環(huán)為最佳循環(huán)次數(shù)。 1284 5678 91 012345 67891 0 圖3內(nèi)參照不同循環(huán)次數(shù)電泳圖4m l p - 9 不同循環(huán)次數(shù)電泳圖 2 3 引物濃度的選擇 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 引物濃度的確定( 見圖5 ) ，l 、2 、3 、4 號帶分別為引物濃度5 ，1 0 ，2 0 ，3 0 p m o i ，檢測 結(jié)果以4 號帶2 0 p m o i 為最佳引物濃度。 l234 圖5 砌i p - 9 不同引物濃度電泳圖 3 未妊組、妊娠組和抑制組小鼠子宮刪p _ 9 瓊脂糖電泳檢測結(jié)果 3 1 未妊組小鼠子宮m m p - 9 的表達檢測結(jié)果 在與對照組和抑制組的附植前期、附植期、附植后期相同日期采取未交配小鼠子宮 進行檢測，其m m p - 9 在各時期都有相當近似的表達( 見圖6 ) ，電泳圖第一條帶為m a r k e r 第2 - 6 號帶為內(nèi)參，7 - 9 號帶為m m p - 9 。 123 456789 圖6 未妊組小鼠子宮刪p _ 9 電泳圖 3 2 妊娠對照組m m p - 9 的表達檢測結(jié)果 在小鼠交配見陰栓后的第2 天、第4 天和第7 天注射生理鹽水0 1 m l 只，4 8 小時后 處死小鼠采取子宮進行檢測，各時期都有m 咿- 9 的表達且有明顯的差異( 見圖7 ) ，電泳圖 從上到下分別為附植前期( 1 - 5 號帶為內(nèi)參，6 - 1 0 號帶為m m p - 9 ) ，附植期( 1 - 5 號帶為內(nèi) 參，6 一1 0 號帶為r a p - 9 ) 和附植后期( t - 3 號帶為內(nèi)參，4 - 6 號帶為r a p - 9 ) 。 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 圖7 妊娠對照組小鼠子宮m m p - 9 電泳圖 3 3 抑制組m m p - 9 的表達檢測結(jié)果 在小鼠交配見陰栓后的第2 天、第4 天和第7 天分別注射n o s 抑制劑0 5 m g 只，4 8 小時后處死小鼠采取子宮進行檢測。在附植前期檢測不到m m p - 9 的表達，在附植期和附植 后期均有不同程度的表達( 見圖8 ) 。電泳圖中1 - 5 號帶為內(nèi)參，6 一1 0 號帶為m m p - 9 。 圖8n o s 抑制組m m p 一9 電泳圖 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 4 試驗各組子宮m 肝啕基因的相對表達量 根據(jù)凝膠電泳圖目的基因條帶的掃描，對各組在附植前期、附植期、附植后期的m m p 一9 基因的相對表達量進行了分析，結(jié)果見表5 。鋤4 p - 9 基因的相對表達量的最低值為0 ( 抑 制組附植前期) ，最高值為1 5 4 ( 妊娠對照組附植期) 。 表5m 咿一9 基因條帶掃描的相對表達量 t a b l e5t h er e l a t i v eq u a n t i t yo f 蛐儼9g e n ee x p r e s s i o n 5 正常附植過程中子宮m 肝一9m r n a 的表達特征 如圖9 顯示，m m p - 9 的表達在正常附植前期和附植期呈增長趨勢，附植期達到最高， 與未妊小鼠子宮內(nèi)膜的表達量相比有極顯著的提高( p o 0 1 ) ；在附植后期m m p - 9 的表達 又恢復到未妊小鼠的水平。 圖9 正常附植過程中小鼠子宮j 6 1 p - 9m r n a 的表達特征 f i g 9t h em l 姒e x p r e s s i o no fe n d o m e t r i a lm m p - 9i nm i c ed u r i n gi m p l a n t a t i o np h a s e 6 附植各時期n o s 抑制組m 肝一9 m r n a 的表達特征 如圖1 0 顯示，用n o s 抑制劑處理后，小鼠子宮內(nèi)膜m m p - 9 的表達在附植前期完全抑 制，附植期和附植后期的表達量分別達到0 4 7 和0 5 5 ，的較低水平。 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 圖l o 抑制組刪p 9 m 蹦 的表達特征 f i g 1 0t h em 烈ae x p r e s s i o no fe n d o m e t r i a l 帥- 9i nm i c ed u r i n gi m p l a n t a t i o np h a s e w i t hn o si n h i b i t i o n 7 對照組與n o s 抑制組小鼠附植各時期m 腫一鈾r n a 的表達量差異 如圖l l 顯示，對照組小鼠子宮m m p - g m r n a 的相對表達在附植前期和附植期分別為 0 8 1 和1 5 4 ，明顯著高于抑制組；附植后期則在兩組之間差異不明顯。 圖1 1 小鼠胚胎附植各組m m p - 9m r n a 表達的結(jié)果比較 f i g 11t h em l me x p r e s s i o no fe n d o m e t r i a l 砌艫9i nm i c ed u r i n gi m p l a n t a t i o np h a s e 8 子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學觀察結(jié)果 8 1 附植前期子宮內(nèi)膜形態(tài)的觀察 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 子宮壁由外到內(nèi)分為外膜、肌肉和內(nèi)膜三層。子宮內(nèi)膜的一般結(jié)構(gòu)是由單層柱狀上 皮( 纖毛細胞和分泌細胞) 和固有層( 基底層和功能層) ，固有層主要由基質(zhì)細胞、子宮腺、 螺旋動脈組成。在附植前期，形態(tài)學觀察顯示，妊娠對照組和抑制組的子宮內(nèi)膜均有一 定程度發(fā)育，但妊娠對照組子宮內(nèi)膜發(fā)育明顯，腺體數(shù)量明顯增多( 圖1 2 ) 。 圖1 2 附植前期子宮切片圖( 1 0 0 x ；左圈為對照組，右圈為抑制組) f i g 1 1e n d o m e t r i a ls e c t i o ni ne a r l yi m p l a n t a t i o np h a s e ( 1 0 0 ： l e f t ：c o n t r o lg r o u p ；r i g l l t ：i n h i b i t o rg r o u p ) 8 2 附植期子宮內(nèi)膜的觀察 在附植期，形態(tài)學觀察顯示。妊娠對照組的子宮內(nèi)膜進一步發(fā)育，柱狀上皮細胞增 高，腺體發(fā)達，羽狀突起非常明顯；抑制組子宮內(nèi)膜柱狀上皮細胞相對較低，腺體數(shù)少， 腔表面上完整，羽狀突起較少( 見圖1 3 ) 。對照組螺旋動脈豐富且擴張，基質(zhì)細胞形成蛻 膜細胞，發(fā)生明顯的蛻膜樣變，基質(zhì)變得疏松，同時子宮內(nèi)膜腺呈現(xiàn)出明顯的活動狀態(tài)： 而抑制組子宮內(nèi)膜基質(zhì)則相對致密( 見圖1 4 ) 。 圖1 3 附植期子宮切片圖( 1 0 0 x ：左圖對照組，右圖抑制組) 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 f i g 1 3e n