姜黃素對Hepa1-6 肝癌細胞凋亡及ROS 影響.doc

姜黃素對Hepa1-6肝癌細胞凋亡及ROS影響杜琴，鄧珊，沈克平，胡兵（上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院腫瘤科，中醫(yī)腫瘤研究所，上海20032）摘要目的：觀察姜黃素對小鼠肝癌Hepa1-6細胞凋亡及活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)水平的影響。方法：不同濃度姜黃素處理Hepa1-6肝癌細胞，MTT比色法檢測細胞增殖，Hoechst33258染色檢測細胞凋亡形態(tài)變化，流式細胞術檢測細胞凋亡，WesternBlot法檢測活化型caspase-3，2-7-二氯氫化熒光素乙二脂（DCFH-DA）染色法結合熒光酶標儀檢測姜黃素對胞內ROS產生的影響。結果：240mol/L姜黃素作用24h、48h均可抑制肝癌Hepa1-6細胞增殖，并呈現一定的時間與劑量依賴性。520mol/L姜黃素作用48h后Hepa1-6細胞呈現凋亡形態(tài)變化，細胞凋亡率呈一定程度劑量依賴性，同時可檢測到活化型caspase-3、以及ROS產生。結論：姜黃素可以抑制Hepa1-6細胞增殖，促使Hepa1-6細胞凋亡，可能與活化caspase-3及提高細胞內ROS水平相關。關鍵詞肝癌；姜黃素；細胞凋亡；caspase-3；ROSEffectsofCurcuminonROSproductionandapoptosisinMurineHepatocarcinomaHepa1-6CellsDuQin,DengShan,ShenKeping,HuBing（DepartmentofOncologyandInstituteofTraditionalChineseMedicineinOncology,LonghuaHospital,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai,20032）Objective：Toobservetheeffectsofcurcuminonapoptosisandreactiveoxygenspecies(ROS)productioninmurinehepatocarcinomaHepa1-6cellsinvitro.Methods：Hepa1-6cellsweretreatedwithdifferentdoseofcurcumin.CellproliferationwasdetectedwithMTTassay.Apoptoticmorphologywasvisualizedbyhoechst33258staining.Cellapoptosiswasdetectedbyflowcytometryanalysis.Caspase-3wasdetectedbywesternblot.IntracellularROSproductionwasdetectedby2,7-dichlorofluorescindiacetate(DCFH-DA)staining.Results：Comparedwiththecontrols,upontreatmentwith240mol/Lofcurcuminfor24hto48h,Hepa1-6cellsproliferationwassignificantlyinhibitedinatimeanddosedependentmanner.520mol/LofcurcuminalsoinducedapoptosisandapoptoticmorphologychangeinHepa1-6cells.Aftertreatmentwith520mol/Lcurcumin,caspase-3wasactivatedaccompaniedbygenerationofROS.Conclusion：Curcuminmayinhibitcellproliferation,induceapoptosisinmurinehepatocarcinomaHepa1-6cells,andmayinvolvementofcaspase-3activationandROSproduction.KeyWordsHepatocarcinoma；Curcumin；Apoptosis；Caspases-3；Reactiveoxygenspecies姜黃素（Curcumin)是從姜科植物姜黃、郁金等根莖中提取的一種有效組分，具有抗炎、抗突變及抗腫瘤等作用1，已證實姜黃素可抑制乳腺癌、肺癌及胃腸道腫瘤等多種腫瘤細胞基金資助：上海市基礎研究重點項目（09JC1413600）；龍華醫(yī)院國家中醫(yī)臨床研究基地“龍醫(yī)團隊、龍醫(yī)學者”項目（LYTD-04）。通訊作者：胡兵（1971-），男，博士，副研究員，碩士生導師。研究方向：腫瘤生物學、功能基因組與抗癌中藥作用及配伍E-mail:生長24，本研究在Hepa1-6細胞模型中觀察了姜黃素對肝癌細胞的作用及可能機制。1材料與方法1.1試驗用藥姜黃素（Curcumin）購于sigma（Cat.C7727-100MG，純度94%），用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成10mmol/L儲備液，0.22m濾器過濾除菌，-20保存?zhèn)溆?。實驗前用DMEM稀釋成工作液，DMSO終濃度0.1%。1.2細胞株小鼠肝癌Hepa1-6細胞購自中國科學院上海細胞庫。培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含青、鏈霉素各100U/ml）中，37，5%CO2飽和濕度環(huán)境的條件下連續(xù)培養(yǎng)。1.3試劑MTT（美國Amresco產品），DMEM高糖培養(yǎng)基（ThermoFisher產品），胎牛血清（SAFCBiosciences公司），caspase-3、-Tubulin抗體（CellSignalingTechnology公司），AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒（Invitrogen公司），細胞凋亡熒光Hoechst33258檢測試劑盒（南京凱基生物），活性氧檢測試劑盒（江蘇碧云天生物技術研究所），其他試劑均為分析純。1.4儀器細胞培養(yǎng)箱（美國NAPCO-5410型），酶標儀（美國ThermoVarioskan），倒置顯微鏡(日本NikonDXM1200)，流式細胞儀(美國BDcalibur公司)，電泳和轉膜裝置（美國BIO-RAD公司），Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描儀（美國LI-COR）。1.5方法1.5.1細胞增殖檢測取對數生長期Hepa1-6細胞，常規(guī)胰酶消化、計數，按3103/100L/孔接種于96孔板中，過夜貼壁后實驗組加入不同濃度姜黃素（2mol/L、5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L），對照組加入等體積DMSO，空白組不做處理。每組3個復孔；分別繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h每孔加入新鮮配制的濃度為5mg/mL的MTT溶液20l，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄培養(yǎng)基，每孔加DMSO150l，輕輕振蕩10min，用酶標儀于490nm處檢測各孔光密度值(opticaldensity，OD)值，按公式計算細胞存活率：存活率=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）100%。細胞實驗重復3次。1.5.2細胞凋亡形態(tài)觀察常規(guī)消化、接種Hepa1-6細胞于24孔板，貼壁24小時后加入終濃度5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黃素干預Hepa1-6細胞，對照組加入等體積DMSO，48h后棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，加入4%甲醛溶液，4固定10min，PBS洗滌2次，滴加Hoechst33258熒光染色液100L，室溫染色10min，熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)并隨機拍照。1.5.3流式細胞儀檢測收集終濃度5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黃素作用后細胞，PBS洗滌三次，調細胞濃度3105/ml，4，1500rpm，離心5min，加入100L結合緩沖液重懸細胞，加入0.5LAnnexinV-FITC混勻后，加入5LPI混勻，室溫、避光、反應10min，上機，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。1.5.4ROS活性檢測終濃度為5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黃素作用Hepa1-6細胞48h后，更換含DCF-DA10mol/L無血清DMEM培養(yǎng)液，37孵育20min后，棄培養(yǎng)液，無血清DMEM培養(yǎng)液洗滌3次，鏡下觀察；同時收獲細胞，調整細胞濃度2106/mL，黑色96孔板每孔100L細胞懸液，每組設3復孔，熒光酶標儀測DCFOD值，488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波。1.5.5Westernblot收集藥物作用后Hepa1-6細胞，常規(guī)裂解，離心去除DNA，加入蛋白質上樣緩沖液100變性15min，用10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳，濕轉法將蛋白質轉移至硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉封閉1h后，加入Caspase-3或-Tubulin抗體4孵育過夜，PBST洗膜后與熒光標記二抗（1:2500）37孵育1h，PBST反復洗滌34次后Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描圖像入計算機。1.6統(tǒng)計學處理數據以xs表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異比較采用單向方差分析，按=0.05的檢驗水準，P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1姜黃素對Hepa1-6細胞增殖作用MTT實驗結果顯示，240mol/L姜黃素可以不同程度地抑制Hepa1-6細胞增殖，濃度在5mol/L或以上與對照組比較，差異顯著（P0.05），并隨姜黃素濃度增加和作用時間延長抑制作用明顯增強。見表1。表1姜黃素對Hepa1-6肝癌細胞增殖影響(xs，n=3)組別劑量（mol/L）存活率（%）24h48h對照組0100.002.12100.001.93姜黃素296.343.8195.424.47姜黃素591.170.59*87.711.57*姜黃素1087.022.45*82.960.05*姜黃素2079.882.21*62.572.98*姜黃素4042.010.81*13.381.39*注：與對照組比較，：*P0.05,*P0.012.2姜黃素對Hepa1-6細胞凋亡形態(tài)觀察研究采用Hoechst33258染色觀察姜黃素對Hepa1-6細胞凋亡形態(tài)的影響，結果如圖1所示，對照組Hepa1-6細胞呈弱熒光染色，不同濃度姜黃素作用后Hepa1-6細胞可以吸收Hoechst33258，發(fā)出較強烈的藍色熒光，細胞核或細胞質內可見濃染致密的藍色熒光顆粒，染色質凝聚、邊緣化及細胞核裂解等凋亡細胞核形態(tài)。見圖1。圖1姜黃素對Hepa1-6細胞凋亡形態(tài)影響（100）2.3姜黃素對Hepa1-6細胞凋亡率影響AnnexinV-FITC/PI雙標流式細胞儀檢測顯示，終濃度5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黃素作用48h，Hepa1-6細胞凋亡率分別為（6.031.08）%、（11.390.24）%、（16.550.94）%，其中10mol/L、20mol/L組細胞凋亡率與對照組比較有明顯統(tǒng)計學差異（P0.01）。見圖2。Cur10mol/LControlCur5mol/LCur20mol/LControlCur5mol/LCur10mol/LCur20mol/L圖2姜黃素對Hepa1-6細胞凋亡影響2.4姜黃素對Hepa1-6細胞內ROS影響DCFH-DA熒光染色后，姜黃素組細胞可見綠色熒光，ROS熒光強度隨姜黃素濃度增加而增強，熒光酶標儀檢測顯示終濃度5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黃素作用后ROS熒光強度分別為對照組1.21、2.09、11.73倍（P0.05）。見圖3。圖3姜黃素對Hepa1-6細胞ROS影響（100）2.5Caspase-3活化蛋白的表達Caspase-3是細胞凋亡過程中關鍵執(zhí)行分子，caspase-3以酶原形式存在于胞漿中，在細胞凋亡早期階段，caspase-3被激活剪切后產生的17kD和12kD片斷，Hepa1-6細胞經5、10、20mol/L姜黃素作用48h后可以檢測到caspase-317kD產物，提示姜黃素可以活化caspase-3，見圖4。圖4姜黃素對Hepa1-6細胞caspase-3活化作用3討論原發(fā)性肝癌（簡稱肝癌）是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居全球第7位，我國及東南亞國家發(fā)病率尤高，預后極差，5年生存率為3%5%5,6。肝癌隱匿，進展迅速，大多肝癌患者就診時已失去手術機會，同時由于肝癌對放射及細胞毒性藥物治療不敏感或因肝功能異常不能耐受常規(guī)治療，亟待尋找高效、低毒的新的治療手段。目前國內外多項研究已證實，姜黃素可通過抑制微管的動態(tài)不穩(wěn)定性、激活有絲分裂點、誘導凋亡及阻滯細胞周期等多種途徑抑制腫瘤細胞生長2,7，本研究結果發(fā)現姜黃素對Hepa1-6肝癌細胞增殖有顯著的抑制作用，提示姜黃素對肝癌細胞具有一定程度抗癌作用。細胞凋亡或程序性細胞死亡（Programmedcelldeath），是細胞在一定的生理或病理條件下，受內在基因調控的自動結束生命的過程，是腫瘤藥物治療主要效應機制之一；凋亡細胞可以呈現特殊的形態(tài)學改變，如染色質濃縮、凝聚，細胞核碎裂，產生凋亡小體等8。本研Cur20mol/LCur10mol/LCur5mol/LControl-TubulinCleavedcaspase-3Curcumin(mol/L)020105究顯示姜黃素作用后Hepa1-6細胞可吸收Hoechst33258，發(fā)出強烈的藍色熒光，細胞核或細胞質內可見濃染致密的藍色熒光顆粒及明顯核形態(tài)變化；同時AnnexinV-FITC/PI，流式細胞儀檢測顯示不同濃度姜黃素作用后Hepa1-6細胞出現明顯凋亡，提示姜黃素可誘導Hepa1-6細胞發(fā)生凋亡，細胞凋亡可能參與姜黃素抗肝癌作用。caspase-3是細胞凋亡執(zhí)行蛋白酶，正常情況下，caspase-3以酶原形式存在于胞漿中，在細胞凋亡過程中，多種凋亡信號最終引起caspase-3活化，被剪切后產生的17kD和12kD片斷，進而裂解下游蛋白底物，誘發(fā)細胞凋亡，因此，細胞凋亡研究常以檢測caspase-3活化產生的17kD產物的形式來鑒定其活化8,9。本研究結果顯示姜黃素作用后Hepa1-6細胞可以檢測到caspase-3剪切產生17kD產物，提示姜黃素可以活化caspase-3，參與誘導Hepa1-6細胞凋亡。目前研究廣泛地證實ROS與細胞凋亡、細胞生長抑制之間有密切關系，細胞內ROS水平的變化可以引起腫瘤細胞一系列與細胞增殖、凋亡相關信號通路的變化，如NF-B、ASK1/JNK等信號通路，活化caspase-3；ROS產生先于caspase-3的活化，提高結腸癌細胞或肝癌細胞內ROS水平能抑制癌細胞生長1014。本實驗結果發(fā)現姜黃素可以顯著提高細胞內ROS水平，提示ROS可能參與姜黃素誘導Hepa1-6細胞生長抑制及細胞凋亡，具體的凋亡信號通路有待進一步研究。參考文獻1.GodA,KunnumakkaraAB,AggarwalBB.CurcuminasCurecuminFromkitchentoclinic.BiochemicalPharmaeo,2008；5(4):7878092.BanerjeeM,SinghP,PandaD.Curcuminsuppressesthedynamicinstabilityofmicrotubules,activatesthemitoticcheckpointandinducesapoptosisinMCF-7cells.FEBSJ,2010；277(16):343734483.SahaA,KuzuharaT,EchigoN,eta1.Apoptosisofhumanlungcancercellsbycurcuminmediatedthroughup-regulationofgrowtharrestandDNAdamageinduciblegenes45and153.BiolPharmBull,2010；33(8):129112994.PatelBB,GuptaD,ElliottAA,eta1.CurcumintargetsFOLFOX-survivingcoloncancercellsviainhibitionofEGFRsandIGF-1R.AnticancerRes,2010；30(2):319325.5.JemalA,BrayF,CenterMM,eta1.Globalcancerstatistics(2011).CACancerJClin,2011；61(2):69906.HagymsiK,TulassayZ.Epidemiologyriskfactorsandmolecularpathogenesisofprimarylivercancer.OrvHetil,2008；149(12):5415487.TeitenMH,GaaschtF,CronauerM,eta1.Anti-proliferativepotentialofcurcumininandrogen-dependentprostatecancercellsoccursthroughmodulationoftheWinglesssignalingpathway.IntJOncol,2010；38(3):6036118.deBruinEC,MedemaJP.Apoptosisandnon-apoptoticdeathsincancerdevel