解毒與活血配伍干預(yù)高脂血癥與動脈粥樣硬化的臨床及機理研究.ppt

解毒與活血配伍干預(yù) 高脂血癥與動脈粥樣硬化 的臨床及機理研究,張文高 吳 敏 劉美霞 劉龍濤 殷鏡海 孟紅艷 山東中醫(yī)藥大學及附屬醫(yī)院 中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院、西苑醫(yī)院 廣州中醫(yī)藥大學，山東省立醫(yī)院 2009-09-05,基金項目資助,高等學校博士學科點專項科研基金（No.20060441002） 中國博士后科學基金 （20070410622） 國家中醫(yī)藥管理局科技計劃項目 （04-05LP30） 山東省中醫(yī)管理局科技計劃項目,研究背景與研究思路,高脂血癥是動脈粥樣硬化（As）主要的病理基礎(chǔ) As導致的心腦血管疾病是當今人類死亡的首位原因 As易損斑塊（即“不穩(wěn)定斑塊”）的潰破、出血，隨后血栓形成，是引起急性冠脈綜合征（ACS）、急性腦梗死等心腦血管病急癥的主要內(nèi)因,研究背景與研究思路,如何調(diào)脂、抗As、抑制As斑塊形成和穩(wěn)定斑塊，對于防治心腦血管疾病、改善其預(yù)后有著極重要的價值 多種活血化瘀藥有調(diào)脂作用，活血化瘀防治As性疾病的療效已得到公認 如何進一步提高活血化瘀藥對于此類疾病的療效、尋求更有效的中醫(yī)藥治法？值得我們深思。,研究背景與研究思路,Ross教授1999年提出的“As是一種炎癥性疾病”已得到學術(shù)界共識。炎癥介質(zhì)在As斑塊的起始、進展以及斑塊的易損性（不穩(wěn)定性）和最終破裂過程中，都起著重要作用。,研究背景與研究思路,將這一現(xiàn)代醫(yī)學新進展聯(lián)系中醫(yī)藥理論和臨床，進行中西醫(yī)結(jié)合創(chuàng)新性思考，我們認為單純的活血化瘀對炎癥病理環(huán)節(jié)作用顯得不足，提出從毒邪致病理論對心血管病急重癥中醫(yī)病機與治則進行創(chuàng)新探討的思路,研究背景與研究思路,7年前提出，不穩(wěn)定型心絞痛作為心絞痛的特殊類型具有毒邪致病的特點，毒損心絡(luò)為不穩(wěn)定型心絞痛的重要病機，解毒為其重要治法； 5年前提出毒邪損心是充血性心力衰竭的重要病機，通過臨床研究驗證了益氣活血解毒的療效優(yōu)勢； 后來又提出“毒、瘀致易損斑塊”和“解毒活血法穩(wěn)定易損斑塊”的假說。,研究背景與研究思路,相應(yīng)提出清熱解毒與活血化瘀配伍可望進一步提高對相關(guān)疾病的療效。 沿著這一思路，進行了解毒與活血配伍，以及解毒與益氣活血配伍，防治高脂血癥、頸動脈粥樣硬化、不穩(wěn)定型心絞痛等臨床研究和干預(yù)As斑塊、穩(wěn)定斑塊相關(guān)的實驗研究。,C57BL株系,Jackson 實驗室,美國緬因州，世界上最重要的老鼠遺傳學研究中心之一,1986-1989年培育出第一只基因敲除小鼠,ApoE基因敲除小鼠于1992年培育成功,基因敲除小鼠,ApoE基因敲除小鼠,美國科學家于1992年培育成功的載脂蛋白E（ApoE）基因敲除小鼠，在正常飲食下即可形成明顯的高脂血癥及彌漫纖維增殖性As損傷病灶。成為研究As發(fā)病機理、干預(yù)措施、篩選抗As藥物及機理研究較理想的動物模型。,研究背景與研究思路,本課題組從2000年開始，在國內(nèi)外率先應(yīng)用ApoE基因敲除小鼠開展心血管病中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究，得到多項基金資助 山東省自然科學基金（Y2001C14） 國家自然科學基金（30472275） 山東省科技項目（200571-6） 高校博士點科研基金（20060441002）,研究背景與研究思路,進行血脂康、脂欣康、脈心康和多種單味活血化瘀、清熱解毒中藥以及多種解毒活血配伍藥對對ApoE基因敲除小鼠降脂、抗As及穩(wěn)定As易損斑塊作用與機理研究，為中醫(yī)藥防治高脂血癥、As及穩(wěn)定易損斑塊提供了科學依據(jù)，也為解毒與活血配伍抗As研究奠定了基礎(chǔ)。,研究背景與研究思路,在此實驗研究基礎(chǔ)上，結(jié)合長期臨床經(jīng)驗，重點研究了若干解毒與活血配伍的創(chuàng)新藥對: 虎杖與山楂配伍 大黃與紅曲配伍 虎杖與芎芍膠囊配伍,虎杖與山楂,虎杖具有解毒消腫、利濕等功效 山楂擅長活血行滯而消積 兩者配伍不僅有前期實驗論證的基礎(chǔ)，而且已經(jīng)應(yīng)用于臨床科研，療效顯著。,虎杖與山楂,虎杖,解毒消腫,利 濕,虎杖苷,抗炎作用,保護血管內(nèi)皮,抑制血小板聚集,抑制內(nèi)皮細胞增殖,抑制血管平滑肌細胞增殖,抗 As,山楂,活血行滯,消 積,山楂提取物,調(diào)節(jié)血脂作用,抗氧化作用,降壓作用,抑制血小板聚集,為了深入研究解毒（虎杖）與活血（山楂）配伍的調(diào)脂、抗As、穩(wěn)定斑塊作用及其作用機制 臨床研究高脂血癥 頸動脈粥樣硬化斑塊 實驗研究ApoE基因敲除小鼠腹腔巨噬細胞源性泡沫細胞試驗,第一部分 解毒與活血配伍干預(yù)高脂血癥與動脈粥樣硬化的臨床研究,一、解毒與活血配伍（虎杖山楂配伍）治療中老年高脂血癥合并脂肪肝的臨床研究 二、解毒與活血配伍（虎杖山楂配伍）對頸動脈粥樣硬化斑塊及其穩(wěn)定性干預(yù)作用研究,一、解毒與活血配伍（虎杖山楂配伍）治療中老年高脂血癥合并脂肪肝的臨床研究,研究方法與內(nèi)容,參照血脂異常防治建議標準、非酒精性脂肪性肝病診斷標準及腹部疾病超聲診斷制定。,本研究納入病例來自濟南市機床二廠集團職工及家屬。,符合上述高脂血癥及脂肪肝診斷標準者。年齡在4069歲之間者。,診斷標準,病例來源,納入標準,空白對照組 20例,山楂虎杖配伍組 （活血解毒配伍組）,虎杖組（解毒組） 20例,山楂組（活血組） 20例,洛伐他汀組 20例,分 組 及 治 療 方 法,山楂提取物,虎杖提取物,山楂提取物及 虎杖提取物,洛伐他汀,不給予藥物,20例,A,B,C,D,E,空白組,山楂組,觀察項目,安全性觀察,療效性觀察,臨床癥狀總療效,對血脂的影響,降脂療效,對肝功能的影響,對脂肪肝超聲聲像分度改善療效,對炎癥因子的影響,結(jié) 論,解毒活血配伍（虎杖山楂配伍）方案治療高脂血癥合并脂肪肝療效可靠， 優(yōu)于單純解毒（虎杖）或活血（山楂）， 其作用機制與降脂、抗炎和保肝等有關(guān)。,二、解毒與活血配伍（虎杖山楂配伍）對頸動脈粥樣硬化斑塊及其穩(wěn)定性干預(yù)作用研究,頸動脈粥樣硬化斑塊檢測意義,頸動脈粥樣硬化的病變程度與心腦血管疾病的發(fā)生有直接的相關(guān)性 通過觀察頸動脈粥樣硬化程度，可客觀地估計以As為病理基礎(chǔ)的心腦血管疾病的發(fā)病危險性及治療效果,頸動脈粥樣硬化及斑塊的診斷,頸動脈內(nèi)中膜厚度（IMT） 是指動脈內(nèi)膜和中膜平滑肌的厚度，即由管腔內(nèi)膜面的前緣到中膜平滑肌與外膜交界面前緣的垂直距離。,穩(wěn)定性斑塊,扁平斑,硬斑,軟斑,潰瘍斑,不穩(wěn)定性斑塊,解毒組（虎杖提取物組， A組） 活血組（山楂提取物組 ，B組） 解毒活血配伍組（虎杖提取物與山楂提取物配伍組， C組） 洛伐他汀對照組（D組） 空白對照組（E組） 各30例，療程6個月,各組病例治療后臨床癥狀總療效比較,各組病例治療前后中醫(yī)癥狀積分比較,*,*,*,*,頸動脈粥樣硬化斑塊超聲檢測指標比較,*,*,#,#,#,#,#,#,#,#,#,*,*,頸動脈粥樣硬化斑塊超聲檢測指標比較,*,#,#,#,*,頸動脈粥樣硬化斑塊超聲檢測指標比較,頸動脈粥樣硬化斑塊超聲檢測指標比較,*,*,頸動脈血流動力學檢測比較,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,頸動脈血流動力學檢測比較,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,斑塊穩(wěn)定性血清指標檢測,*,*,*,*,斑塊穩(wěn)定性血清指標檢測,*,*,*,*,#,#,#,*,*,斑塊穩(wěn)定性血清指標檢測,第二部分 研究結(jié)果,斑塊穩(wěn)定性血清指標檢測,#,*,*,血壓水平比較,*,*,*,*,血脂水平比較,*,*,*,*,小 結(jié),解毒與活血配伍 顯著改善患者癥狀 顯著減小頸動脈IMT、IMTarea、MIMT、斑塊積分，增大管腔內(nèi)徑，緩解管腔狹窄程度，改善頸動脈斑塊超聲病理分型及頸動脈血流動力學 具有調(diào)脂、降壓、抗炎（降低hs-CRP、sICAM-1、sVCAM-1）、減少細胞外基質(zhì)降解（降低MMP-1及MMP-1/TIMP-1比值）等作用,小 結(jié),解毒與活血配伍具有抗動脈粥樣硬化、穩(wěn)定斑塊的作用 解毒與活血配伍療效優(yōu)于單純解毒組、活血組及洛伐他汀組,第二部分 解毒與活血配伍干預(yù) 載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈 粥樣硬化泡沫化細胞形成機制研究,一、解毒與活血配伍（虎杖山楂配伍）干預(yù)載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化泡沫化細胞形成的炎癥機制研究 二、從PPAR、ABCA1、CD36途徑探討解毒活血中藥配伍干預(yù)載脂蛋白E基因敲除小鼠巨噬細胞源性泡沫細胞的分子機制,ApoE基因敲除小鼠的腹腔巨噬細胞較普通小鼠更容易攝取ox-LDL而形成泡沫細胞，是進行體外培養(yǎng)巨噬細胞源性泡沫細胞研究的理想選擇。 單核巨噬細胞經(jīng)外源性致炎物質(zhì)脂多糖（LPS）激活，攝取ox-LDL，并吞噬大量脂質(zhì)形成泡沫細胞，是早期As的標志。,一、解毒與活血配伍（虎杖山楂配伍） 干預(yù)載脂蛋白E基因敲除小鼠 動脈粥樣硬化泡沫化細胞形成 的炎癥機制研究,ApoE（-/-）小鼠,腹腔巨噬細胞培養(yǎng),分為B-G組與ox-LDL+LPS 共孵育，并分別加藥干預(yù),B 虎 杖 苷,C 山 楂 提 取 物,D 虎杖 苷山 楂提 取物 組,E 洛 伐 他 汀 組,F 羅 格 列 酮 組,G 模 型 組,A 空 白 對 照,分別觀察0、24、48h 三個不同時相的 以下指標變化,Western blot,ELISA,TLR4 NF-B,TNF- IL-1,數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計分析,技 術(shù) 路 線,這部分工作明天上午將由 劉美霞、劉龍濤博士匯報,IL-1含量,TNF-含量,NF-B蛋白表達,TLR4蛋白表達,結(jié) 論,解毒活血中藥配伍能顯著減少ox-LDL、LPS誘導的ApoE基因敲除小鼠腹腔巨噬細胞源性泡沫細胞內(nèi)TLR4的表達， 抑制NF-B的激活， 進而減弱TLR4/NF-B信號途徑及IL-1、TNF的合成與釋放， 抑制炎癥反應(yīng)，干預(yù)巨噬細胞泡沫化，延緩As的發(fā)生與發(fā)展； 解毒活血配伍的上述作用優(yōu)于羅格列酮，也優(yōu)于單純解毒或活血。,二、從PPAR、ABCA1、CD36途徑 探討解毒活血中藥配伍 干預(yù)載脂蛋白E基因敲除小鼠 巨噬細胞源性泡沫細胞的分子機制,PPAR、 CD36與ABCA1,過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）調(diào)控體系是目前As研究中的熱點之一。PPAR屬于核受體超家族中PPARs家族的成員，是配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、脂肪細胞分化和能量代謝中起關(guān)鍵性作用。,PPAR、 CD36與ABCA1,B類清道夫受體CD36、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1 (ABCA1)都是PPAR轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游靶基因。 PPAR配體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已被證實具有抗As作用。近年研究表明PPAR可通過其活化后對下游靶基因CD36、ABCA1轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控及相關(guān)細胞因子的釋放來影響As泡沫細胞的形成。,研究方法,ApoE（-/-）小鼠,腹腔巨噬細胞培養(yǎng),分為B-G組與 ox-LDL+LPS 共孵育，并 分別加藥干預(yù),B 虎 杖 苷,C 山 楂 提 取 物,D 虎杖 苷山 楂提 取物,E 洛 伐 他 汀,F 羅 格 列 酮,G 模 型 組,A 空 白 對 照,分別觀察0、24、48h 三個不同時相的以下 指標變化,RT-PCR,PPAR CD36 ABCA1,數(shù)據(jù)整理 統(tǒng)計分析,PPAR上游引物為5-CCC TGG CAA AGC ATT TGT AT -3， 下游引物為5-AAT CCT TGG CCC TCT GAG AT-3（403bp）； ABCA1上游引物為5-CAG ATG CCC TAC CCC TGT TA-3， 下游引物為5- GGG AGA AGA GCG TGC TAA TG-3（364bp）； CD36 上游引物為5-CCT TAA AGG AAT CCC CGT GT -3，下游引物為5-CCA ATG GTC CCA GTC TCA TT-3（418bp）； -actin上游引物為5- TCC TCC CTG GAG AAG AGC TA -3，下游引物為5- TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG -3（302bp）。,各引物序列,細胞總RNA提取及RT-PCR反應(yīng)均采用RT-PCR檢測細胞因子試劑盒（購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司）。 收集107細胞沉淀提取細胞總RNA，取1ug逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行PCR擴增（所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行）。,RNA提取和RT-PCR反應(yīng),擴增條件 94度1分鐘，58度1分鐘，72度 1分鐘，共35個循環(huán)，最后72度延長7分鐘。 取各基因擴增產(chǎn)物10ul，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，多功能紫外投射反射分析儀下觀察并拍照，采用美國Kodak凝膠分析系統(tǒng)，應(yīng)用1 D Image Analysis Software進行產(chǎn)物灰度圖像分析，以各基因與-actin的電泳條帶光密度值的比值作為各基因的相對表達量。,研究結(jié)果1,解毒活血中藥配伍對ApoE(-/-)小鼠巨噬細胞PPARmRNA表達的影響,研究結(jié)果 1,解毒活血中藥配伍對ApoE(-/-)小鼠巨噬細胞PPARmRNA表達的影響,#,#,#,#,與模型組比較,與解毒活血配伍組比較,研究結(jié)果2,解毒活血中藥配伍對ApoE(-/-)小鼠巨噬細胞ABCA1mRNA表達的影響,研究結(jié)果2,解毒活血中藥配伍對ApoE(-/-)小鼠巨噬細胞ABCA1mRNA表達的影響,#,#,#,與解毒活血配伍組比較,與模型組比較,#,研究結(jié)果3,解毒活血中藥配伍對ApoE(-/-)小鼠巨噬細胞CD36mRNA表達的影響,研究結(jié)果3,解毒活血中藥配伍對ApoE(-/-)小鼠巨噬細胞CD36mRNA表達的影響,#,#,#,#,與解毒活血配伍組比較,#,小 結(jié),用ox-LDL、LPS刺激ApoE(-/-)小鼠腹腔巨噬細胞，可以誘導泡沫細胞的形成， 細胞內(nèi)PPAR、ABCA1、CD36的mRNA表達均顯著增高。,小 結(jié),與模型組比較， 以洛伐他汀、羅格列酮作為對照， 以解毒中藥虎杖、活血中藥山楂及其配伍作為主要研究藥物進行干預(yù)48h后， 各用藥組PPAR、ABCA1的mRNA表達均顯著增高， 各用藥組CD36mRNA的表達顯著降低， 解毒活血配伍組優(yōu)于單純解毒組、活血組及洛伐他汀組，相當于或優(yōu)于羅格列酮組。,研究提示,解毒活血中藥配伍具有與羅格列酮相似的PPAR激動作用， 可能通過激活PPAR，從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)下游靶基因CD36、ABCA1及炎癥因子的表達， 干預(yù)ox-LDL-PPAR-CD36與ox-LDL-PPAR-ABCA1兩條信號通路，使ABCA1mRNA表達上調(diào)、CD36mRNA表達下調(diào)， 從而起到顯著抑制巨噬細胞泡沫化過程，最終達到抗As的作用。 解毒活血中藥配伍有望成為中醫(yī)藥領(lǐng)域抗As泡沫細胞形成的新型藥