【SN商檢標(biāo)準(zhǔn)】snt 1129.1-2002 牛病毒性腹瀉粘膜病病毒微量血清中和試驗(yàn)操作規(guī)程.doc

protocol of serum neutralization micro test for bovine viral dmiuacrorshaeladiseasesnt 1129.1 2002前言本標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法是參考國(guó)際獸疫局診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)介紹的方法，并經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期實(shí)踐、改進(jìn)，使之進(jìn)一步具體化，而形成現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)。 本標(biāo)準(zhǔn)的附錄a為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口。 本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國(guó)云南出入境檢驗(yàn)檢疫局。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張曉丁、蘇衛(wèi)、王濤、李凌楓。 本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布的出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛病毒性腹瀉粘膜病微量血清中和試驗(yàn)方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)物牛病毒性腹瀉粘膜病中和抗體的檢測(cè)。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期時(shí)引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用 于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。gbt 6681 99分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法3 縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。cpe細(xì)胞病變作用。tcid50半數(shù)組織培養(yǎng)感染量。bvdmd牛病毒性腹瀉粘膜病。4 原理 動(dòng)物感染bvd后，能在體內(nèi)產(chǎn)生特異性中和抗體。這種特異性中和抗體與病毒結(jié)合后，能使病毒失去對(duì)敏感細(xì)胞的感染能力，從而阻止病毒的繁殖。這一反應(yīng)不但表現(xiàn)為一種病毒只能被相應(yīng)的免疫血清所中和，而且還表現(xiàn)中和一定數(shù)量的病毒，必須有一定效價(jià)的免疫血清。血清中和試驗(yàn)以測(cè)定病毒的感染力為基礎(chǔ)，中和抗體滴度的判定以比較病毒受免疫血清中和后的殘存感染力為依據(jù)，所以必須選用對(duì)病毒敏感的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，以保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和敏感性。5 試劑和材料5.1 水本標(biāo)準(zhǔn)所用水應(yīng)符合gbt 6681992中二級(jí)水的規(guī)格。5.2 病毒bvd病毒oregon2c4v株。牛病毒性腹瀉粘膜病病毒微量血 清中和 試驗(yàn) 操作 規(guī)程5.3 對(duì)照血清5.5 細(xì)胞5.4 被檢血清 在無(wú)菌條件下采取血樣，分離血清。胞。按常規(guī)胰酶消化方法制備(所用犢牛應(yīng)無(wú)bvd污染)。5.6 本標(biāo)準(zhǔn)所用溶液 配方(包括培養(yǎng)液、維持液、稀釋液、細(xì)胞分散液)及配制方法見(jiàn)附錄a。6 器械和設(shè)備6.1 倒置光學(xué)顯微鏡6.2 微型振蕩器6.3 二氧化碳培養(yǎng)箱6.4 冰箱：-20保存血清，-70保存種毒。6.5 9組織培養(yǎng)板6.6 單頭和多頭微量移液器(20l200l)及滴頭7 種毒繁殖將bvd病毒oregon2c4v株接種到細(xì)胞單層，37吸附1后h 加入維持液，置37培養(yǎng)，逐日觀察。待cpe達(dá)75以上，收獲病毒培養(yǎng)物凍融，2000r min離心20 mi。取上清液分裝小瓶，每瓶1 m，置-70保存?zhèn)溆谩? 毒價(jià)測(cè)定將病毒在96孔板上作(10010-10)倍稀釋，每個(gè)稀釋度接種8孔，每孔病毒懸液為50l，補(bǔ)充50 l稀釋液，加入細(xì)胞懸液100l(3105個(gè)細(xì)胞ml)，每塊板設(shè)8孔細(xì)胞對(duì)照。置5c02培養(yǎng)箱于37培養(yǎng)，于4d 6逐d 日在倒置顯微鏡下觀察記錄cpe。按karber方法計(jì)算出病毒的tcid5050l值。根據(jù)測(cè)定結(jié)果將病毒液稀釋成100 tci5d050l的工作濃度。9 試驗(yàn)程序9.1 滅活bvd標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰性血清、被檢血清經(jīng)56，30 mi 活。9.2 對(duì)照設(shè)立細(xì)胞對(duì)照：設(shè)4孔正常細(xì)胞對(duì)照，每孔加細(xì)胞懸液100l、稀釋液100l。病毒回歸對(duì)照：將工作濃度的病毒液進(jìn)一步10倍稀釋成100、10、1、0.1 tci5d050l，每個(gè)稀釋度接種2孔，每孔加入病毒懸液50 l，再加 入細(xì)胞懸液100l，每孔補(bǔ)充稀釋液50l。陽(yáng)性對(duì)照：設(shè)4孔陽(yáng)性血清對(duì)照，每孔分別加入陽(yáng)性血清和100 tci5d050l病毒懸液各50l，再加入細(xì)胞懸液100l。陰性對(duì)照：設(shè)陰性血清對(duì)照4孔，每孔分別加入陰性血清和100 tci5d050l病毒懸液各50l，再加入細(xì)胞懸液100l。血清毒性對(duì)照：每份被檢血清按稀釋度各設(shè)1孔毒性對(duì)照，每孔加各稀釋度血清50l、稀釋液50 l和細(xì)胞懸液100l。9.3 中和試驗(yàn) 根據(jù)試驗(yàn)需要，將被檢血清從1：2開(kāi)始作倍比系列稀釋，每個(gè)稀釋度加三孔，每孔加已稀釋血清50l，第一孔作為血清毒性對(duì)照孔，加入稀釋液50l和細(xì)胞懸液100l；第二、三孔為試驗(yàn)孔，每孔加入100 tcid。5 50 l的病毒懸液50l，振蕩2 mi3 mi，置37二氧化碳培養(yǎng)箱中和l ，h然后加入細(xì)胞懸液100l。置5二氧化碳培養(yǎng)箱于37培養(yǎng)6，d 逐日觀察cpe并記錄。10 結(jié)果判定當(dāng)病毒對(duì)照滴度為100(30300)tcid5050l時(shí)，陽(yáng)性血清能完全抑制bvd病毒的cpe，陰性血清完全不能抑制bvd病毒的cpe，細(xì)胞對(duì)照孔和血清毒性對(duì)照孔內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)正常時(shí)，才能進(jìn)行結(jié)果判定。判定時(shí)間為4溶液配制清的稀釋度即為該份血清的中和抗體滴度。d 6，d 逐日記錄cpe。當(dāng)被檢血清的某一稀釋度出現(xiàn)50以上被保護(hù)時(shí)，該血試驗(yàn)所用的細(xì)胞為牛鼻甲骨傳代細(xì)胞(bt)、胎牛(或犢牛)鼻甲骨原代細(xì)胞、牛腎傳代細(xì)胞(mdbk)、胎牛(或犢牛)腎原代細(xì)胞、胎?；驙倥２G丸細(xì)附錄a (規(guī)范性附錄)199培養(yǎng)基(也可用mem或其他培養(yǎng)基)，加入10無(wú)bvd病毒抗體胎牛血清(56，30 mi菌。置-20保存?zhèn)溆?。a.2 維持液199培養(yǎng)基(也可用mem或其他培養(yǎng)基)，加入2無(wú)bvd病毒抗體胎牛血清(56，30 mi菌。置-20保存?zhèn)溆谩.3 細(xì)胞分散液胰酶2.50 g 乙二胺四乙酸二鈉(edta) 0.20 g 無(wú)鈣鎂離子pbs液1 000 ml 抽濾除菌分裝，置-20保存?zhèn)溆?。a.4無(wú)鈣鎂pbs氯化鈉8.0 g 氯化鉀0.2 g 磷酸氫二鈉1.15 g 磷酸二氫鈉0.2 g水1 000 ml活)，含青霉素200 i活)，含青霉素200 iml，鏈霉素200gml，抽濾除ml，鏈霉素200gml，抽濾除將上述成分依次溶解、分裝、高壓滅菌(68.94 kpa 15 m或in抽) 濾除菌，置4保存?zhèn)溆茫行跒橐荒?。a.5 hank液sa.5.1 1倍0 hanks母液的制備a液：氯化鈉80.0 g 氯化鉀4.0 g 氯化鈣1.4 g 硫酸鎂(7h20)2.0 g水450 ml液b ：磷酸氫二鈉0.6 g磷酸二氫鉀0.6 g水450 ml液c ：1酚紅16 ml將上述成分依次溶解，將b液慢慢加到a液中，同時(shí)不斷攪拌，再加入c液，補(bǔ)充水至1 0004保存?zhèn)溆茫行跒?個(gè)月。a.5.2 hank使s 用液的制備10倍hanks母液500 ml一級(jí)水4500 ml。ml抽濾除菌或高壓滅菌(103.41 kpa 10 m。in置)a.1 培養(yǎng)液將母液加到水中，搖勻分裝。抽濾除菌或高壓滅菌(103.41 kpa 10 m。in置) 4保存?zhèn)溆?，有效期?個(gè)月。使用前每1 00025 m。l加ml1.4碳酸氫鈉a.6 1.4碳酸氫鈉溶液碳酸氫鈉14.0 g一級(jí)水1 000 ml分裝抽濾除菌，置-20保存?zhèn)溆?，有效期?個(gè)月。a.7 1酚紅酚紅1.0 g1 mol/l naoh