分解纖維素的微生物的分離.ppt

復習課題一： 1、培養(yǎng)基的基本成分有哪些？除了這些成分外還需要滿足哪些條件？ 2、培養(yǎng)基的分類有哪些？ 3、應用微生物的前提是什么？舉例說明幾個無菌操作。 4、實驗室常用的消毒方法有哪些？各需要什么樣的條件? 5、實驗室常用的滅菌方法有哪些？各需要什么樣的條件？ 6、制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基需要哪些成分？各成分提供的什么營養(yǎng)物質？ 7、制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的操作過程是什么？ 8、培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿分別采用哪種滅菌方法？各滅菌方法的條件是什么？ 9、微生物接種常用的兩種方法是什么？各用的哪種接種工具？哪種方法需要稀釋？哪種方法可以用來菌落計數(shù)？計的是全部菌落數(shù)還是活菌數(shù)？ 10、如何檢測培養(yǎng)基是否滅菌合格？菌種的保藏方法有哪些？各需要接種的什么培養(yǎng)基上？在多少溫度下保藏？,復習課題二： 1、土壤中的細菌為什么可以將尿素分解？尿素分解以后變成了什么？它會使pH升高還是降低？可以使哪種指示劑變色？變成什么顏色？ 2、利用什么培養(yǎng)基可以篩選出能夠分解尿素的細菌？該培養(yǎng)基中提供碳源和氮源的物質分別是什么？該培養(yǎng)基按物理狀態(tài)劃分屬于什么培養(yǎng)基？ 3、統(tǒng)計菌落數(shù)目常用的方法有哪些？哪個用于統(tǒng)計全部菌落數(shù)？哪個用于統(tǒng)計活菌數(shù)？ 4、為保證結果準確，一般選擇菌落數(shù)為多少的平板進行計數(shù)？實驗統(tǒng)計的菌落數(shù)往往要比活菌的實際數(shù)目低還是高？為什么？ 6、為什么分離不同的微生物要選擇不同的稀釋度？目的是什么？第一次做實驗的時候一般選用多少的稀釋度？ 7、如何檢測該選擇培養(yǎng)基具有選擇作用？,課題三 分解纖維素的微生物的分離,一、關于纖維素,閱讀P27課題背景及基礎知識第一段，回答： 1、纖維素的化學本質是什么？它的基本組成單位是 什么？ 2、纖維素主要分布在哪里？ 3、自然界中纖維素含量最高的天然產物是什么？ 4、纖維素的作用是什么？ 5、地球上每年產生的纖維素超過70億噸，為什么不會造成堆積？ 6、哪些生物能夠分解纖維素？人能夠分解纖維素嗎？,多糖,植物的根、莖、葉等器官以及木材、作物秸稈中,與果膠共同構成植物的細胞壁，具有支持保護功能,棉花,葡萄糖,土壤中的某些微生物可以合成纖維素酶，將纖維素分解為葡萄糖,某些微生物（細菌、真菌、放線菌）和反芻動物（食草動物）,掌握： 1、纖維素是一種多糖，它是由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物。,2、纖維素主要存在于植物的根、莖、葉等器官和木材、作物秸稈中。其中棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產物。,3、土壤中的微生物能夠分解纖維素是因為它們能合成纖維素酶，纖維素在纖維素酶的作用下會分解成葡萄糖。,二、關于纖維素酶,閱讀P27基礎知識第二段及小字部分，回答： 1、纖維素酶包括哪些組分？它們分別起什么作用？,掌握： 纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括三種組分，即C1酶(內切酶)、CX酶（外切酶）和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。,纖維素酶分解纖維素的實驗,實驗過程： 甲試管：濾紙+緩沖液11mL 乙試管：濾紙+緩沖液10mL+纖維素酶1mL 實驗結果： 甲試管濾紙仍在，乙試管濾紙被完全分解,思考： 1、本實驗的自變量是什么？ 2、濾紙?zhí)峁┑氖鞘裁矗?3、乙試管的濾紙為什么會消失？甲試管的作用是什么？ 4 、甲乙兩試管如何構成對照？甲試管多加的1mL緩沖液能不能換成蒸餾水？,有無纖維素酶,纖維素,纖維素被分解,對照,乙試管有纖維素酶，甲試管沒有，加入了等量的緩沖液,三、纖維素分解菌的篩選,土壤中有眾多的微生物，但只有一部分能夠分解纖維素，那么如何從眾多的微生物中把纖維素分解菌篩選出來呢？,閱讀P28（二）纖維素分解菌的篩選，回答： 1、篩選纖維素分解菌用的是什么方法？這種方法是通過什么反應對微生物進行篩選的？ 2、該方法的作用原理是什么？ 3、剛果紅培養(yǎng)基從功能上劃分屬于什么培養(yǎng)基？,剛果紅染色法,顏色,鑒別,剛果紅可以與纖維素形成紅色復合物，但不能 和纖維二塘以及葡萄糖發(fā)生這種反應。當纖維 素被纖維素酶分解后，紅色復合物就無法形成， 出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈,掌握： 1、篩選纖維素分解菌的方法剛果紅（CR）染色法。該方法可以通過顏色反應直接對微生物進行篩選。,2、其作用原理是：剛果紅可以與纖維素形成紅色復合物，當纖維素被纖維素酶分解后，紅色復合物就無法形成，出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，可以通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。,實驗流程圖,四、實驗過程,1、土壤取樣：,掌握：應該在富含纖維素的環(huán)境中進行取樣。纖維素分解菌大多生活在富含纖維素的環(huán)境中，所以我們從這種土壤中進行取樣。,思考： 1、應該選擇什么樣的環(huán)境進行取樣？根據(jù)是什么？ 2、將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾紙應該埋進土壤多深？,富含纖維素,篩選目的菌株 要根據(jù)它對生 存環(huán)境的要求， 到相應的環(huán)境 中尋找,聚集纖維素分解菌,10cm左右,2、選擇培養(yǎng)（可省略）,掌握：選擇培養(yǎng)的目的是增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。,思考： 進行選擇培養(yǎng)的目的是什么？,思考： 1、該選擇培養(yǎng)基含有哪些成分，各成分提供的什么營養(yǎng)？ 2、該選擇培養(yǎng)基按物理狀態(tài)劃分屬于什么培養(yǎng)基？為什么？ 3、為什么用液體培養(yǎng)基？ 4、該選擇培養(yǎng)基是如何對微生物進行選擇的？ 5、如果判斷該培養(yǎng)基是否起到了選擇作用？ 6、如何進行選擇培養(yǎng)？ 7、為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？,碳源,氮源、無機鹽,無機鹽,碳源、氮源,氮源,水,液體,無瓊脂,使菌株大量繁殖,掌握： 纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基的作用原理：以纖維素作為主要碳源，只有纖維素分解菌能夠分解纖維素，以纖維素為碳源大量繁殖，而其它的微生物因為不能分解纖維素，缺乏碳源而無法生存。這樣就可以把纖維素分解菌篩選出來了。,按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進行等比稀釋101107倍。,3、梯度稀釋,4、涂布,將稀釋度為104106的菌懸液各取0.1ml涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上，30倒置培養(yǎng)。,思考： 1、該選擇培養(yǎng)基含有哪些成分，各成分提供的什么營養(yǎng)？ 2、該選擇培養(yǎng)基按物理狀態(tài)劃分屬于什么培養(yǎng)基？,碳源,碳源、氮源,無機鹽,作凝固劑,碳源,水,固體,掌握： 剛果紅染色有兩種方法： 方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅（CR）進行顏色反應。 方法二：在倒平板時就加入剛果紅。,5、剛果紅染色,思考：1、方法一中為什么要加入NaCl溶液？ 漂洗作用，洗去與纖維素結合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。 2、這兩種方法中剛果紅需要滅菌嗎？ 第一種CR無需滅菌，第二種倒平板前CR需要滅菌。 3、這兩種方法各有什么優(yōu)缺點？,顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用,1.操作繁瑣 2.剛果紅會使菌落之間發(fā)生混雜,操作簡便 不存在菌落混雜問題,1.產生淀粉酶的微生物也產生模糊透明圈 2.有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈。,將產生明顯透明圈的菌落，挑取并接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基上，在300C370C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，可獲得純化培養(yǎng)。,6、純化培養(yǎng),思考：本實驗的流程與課題2中的實驗流程有哪些異同？,課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。 本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。,1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出了菌落 掌握： （1）、判斷所使用的培養(yǎng)基是否被雜菌污染或培養(yǎng)基是否合格時，應設置未接種的培養(yǎng)基進行空白對照。 （2）、判斷某個培養(yǎng)基是否具有選擇作用時，應設置接種了的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行對照。 2.分離的結果是否一致 由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學可能得到不同的分離結果。,五、結果分析與評價,菌種的進一步鑒定： 掌握： 為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進行發(fā)酵產纖維素酶實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵。 纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素所產生的葡萄糖含量進行定量測定。,六、課題延伸,總結： 一、纖維素： 化學本質、基本組成單位、分布 二、纖維素酶： 組成、作用原理 三、篩選纖維素分解菌： 方法、原理 四、實驗過程： 實驗流程、纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基、剛果紅染色的兩種方法 五、纖維素酶的測定方法,比較分解尿素的微生物的分離與分解纖維素的微生物的分離,以尿素為唯一氮源,以纖維素為唯一碳源,固體,液體,篩選目的菌,增加目的菌的濃度,酚紅指示劑,分解尿素的細菌可以合成脲酶，尿素在脲酶的作用下分解成氨，pH升高，使酚紅指示劑變紅,剛果紅染液,剛果紅可以與纖維素形成 紅色復合物，當纖維素被 纖維素酶催化分解后紅色 復合物無法形成，培養(yǎng)基 上就會出現(xiàn)以纖維素分解 菌為中心的透明圈,固體,固體,練一練,1、在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌，符合下列哪一生物學觀點？（ ） A、生物結構與功能相適應的觀點 B、生物結構與功能整體性觀點 C、生物與環(huán)境相適應的觀點 D、生物發(fā)展進化的觀點,2、從土壤中分離獲得某種微生物的步驟是（ ） 土壤取樣 梯度稀釋 選擇培養(yǎng) 菌懸液涂布平板 挑選出單個菌落 A、 B、 C、 D、,3、有關選擇培養(yǎng)正確的敘述是（ ）,A、可以增加纖維素分解菌的濃度 B、可以減少纖維素分解菌的濃度 C、所用培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基 D、所用培養(yǎng)基是平板培養(yǎng)基,4、分離纖維素分解菌的實驗過程中操作有誤的是（ ） A經選擇培養(yǎng)后將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上 B選擇培養(yǎng)這一步可省略，但培養(yǎng)纖維素分解菌少 C可通過定時測定葡萄糖產量的變化來衡量纖維素分解菌培養(yǎng)液中的纖維素酶產量 D對照組可用同樣量的培養(yǎng)液涂布到不含纖維素的培養(yǎng)基上,5、下列有關剛果紅染色法的敘述，不正確的是（ ) A剛果紅可以在細菌菌落形成前倒平板時加入 B剛果紅可以在菌落形成后加入 C剛果紅在菌落形成前倒平板時加入，加入的剛果紅不需要滅菌 D在菌落形成后加入剛果紅時，剛果紅不需要滅菌,6、利用剛果紅法可以篩選出纖維素分解菌，下列說法錯誤的是（）,A、剛果紅能與纖維素形成紅色復合物 B、剛果紅能與纖維二糖形成紅色復合物 C、剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復合物 D、若培養(yǎng)基上產生了透明圈，則說明已篩選出了纖維素分解菌,7、有些微生物能合成纖維素酶，通過對這些微生物的研究，使人們能夠利用秸稈等廢棄物生產酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。研究人員用化合物A、硝酸鹽、磷酸鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能