GB4789.31-2013食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌的腸桿菌科噬菌體診斷檢驗.pdf

中華人民共和國國家標準中華人民共和國國家標準 GB 4789.312013 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌、 志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌的腸桿菌科噬菌體診斷檢驗 2013-11-29 發(fā)布 2014-06-01 實施 GB 4789.312013 I 前 言 本標準代替 GB/T 4789.31-2003食品衛(wèi)生微生物學檢驗 沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌的腸桿菌科噬菌體檢驗方法 。 本標準與 GB/T 4789.31-2003 相比, 主要變化如下： 修改了操作步驟； 增加了附錄 B。 GB 4789.312013 1 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌的 腸桿菌科噬菌體診斷檢驗 1 范圍 本標準規(guī)定了應用腸桿菌科噬菌體診斷方法檢驗食品中沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌。 本標準適用于各類食品和食源性疾病事件樣品中沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌的檢驗。 本標準適用于食品行業(yè)從業(yè)人員腸道沙門氏菌和志賀氏菌帶菌檢驗。 2 設備和材料 除微生物實驗室常規(guī)滅菌、培養(yǎng)的設備外，其他設備和材料如下： a) 恒溫培養(yǎng)箱：36 1 , 42 1 ，50 1 ; b) 厭氧培養(yǎng)裝置：41.5 0.5 ; c) 顯微鏡：10 倍100 倍; d) 水平儀：噬菌體試驗的工作臺面應調整至水平位置; e) 已滅菌 1 mL 一次性注射器（應為塑料材質） ，針頭無編號，使用前測定每滴 5 L10 L（每 mL 有 100200 滴）可用; f) 微量移液器及吸頭（10 L 和 5 L）; g) 定量移液器及吸頭（100 L 和 50 L）; h) 無菌吸管：10 mL、5 mL、1 mL; i) 無菌毛細管; j) 無菌培養(yǎng)皿：90 mm; k) 無菌棉簽; l) 帶蓋的滅菌小試管：8 mm50 mm; m) 載物玻片。 3 培養(yǎng)基和試劑 3.1 亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液：見附錄 A 中的 A.1。 3.2 四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液：見附錄 A 中的 A.2。 3.3 志賀氏菌（BCT）增菌液：見附錄 A 中的 A.3。 3.4 營養(yǎng)肉湯（NB） ：見附錄 A 中的 A.4。 3.5 營養(yǎng)瓊脂（NA） ：見附錄 A 中的 A.5。 3.6 營養(yǎng)半固體瓊脂（NSA） ：見附錄 A 中的 A.6。 GB 4789.312013 2 3.7 三糖鐵瓊脂（TSI） ：見附錄 A 中的 A.7。 3.8 葡萄糖銨瓊脂：見附錄 A 中的 A.8。 3.9 腸桿菌科診斷用噬菌體，7 種和 3 種。必要時可再購置大腸埃希氏菌分型噬菌體（6 種）一套。安瓿開啟后用無菌毛細管吸出移入滅菌小試管內，如果每次使用量很少，可分裝于 23 支試管內，保存于5 冰箱備用。 3.10 沙門氏菌因子血清，志賀氏菌分型因子血清，致瀉大腸埃希氏菌分型因子血清。因子血清的種類視需要而定。 4 檢驗程序 4.1 沙門氏菌的檢驗程序 沙門氏菌的檢驗程序見圖 1。 GB 4789.312013 3 圖 1 沙門氏菌的檢驗程序 4.2 志賀氏菌的檢驗程序 志賀氏菌的檢驗程序見圖 2。 ONPG 甘露醇、山梨醇 檢 樣 O-1 裂解 其他均不裂解 非如左述的 各種反應結果 沙門氏菌 血清學試驗證實 非沙門氏菌 沙門氏菌 血清學試驗證實 沙門氏菌 血清學試驗證實 非沙門氏菌 非沙門氏菌 報 告 前增菌、增菌和分離 挑取可疑菌落 TSI(斜面、底面、產氣、H2S) 蛋白胨水（靛基質） 尿素（pH7.2）,KCN,賴氨酸 H2S+,靛基質， 尿素，KCN， 賴氨酸 噬菌體試驗 H2S+，靛基質+， 尿素，KCN， 賴氨酸+ 各種噬菌體 均不裂解 非如左述的 各種裂解結果 H2S，靛基質， 尿素，KCN， 賴氨酸+/ , , + GB 4789.312013 4 圖 2 志賀氏菌的檢驗程序 Sh 裂解， 并呈現(xiàn) 各種裂解模式 Sh 不裂解 血清學試驗與裂解模式相符 且被 1 RTD Sh 裂解 血清學試驗與裂模式不相符 或不被 1 RTD Sh 裂解 生化分群試驗 葡萄糖銨試驗 必要時加做乙酸鈉、 克氏檸檬酸鹽、黏液酸、七葉苷、水楊苷試驗 志賀氏菌屬 分群及分型結果 葡萄糖銨+ 或任何其他陽性結果 非志賀氏菌 報 告 非志賀氏菌 非志賀氏菌 噬菌體試驗 非如左述的各種反應結果 檢 樣 挑取可疑菌落 TSI， 葡萄糖半固體 增菌和分離 TSI 底層產酸,斜面產堿，H2S 不產氣，無動力 GB 4789.312013 5 4.3 致瀉大腸埃希氏菌的檢驗程序 致瀉大腸埃希氏菌的檢驗程序見圖 3。 圖 3 致瀉大腸埃希氏菌的檢驗程序 檢 樣 E 和或 Sh、E4 噬菌體不裂解 其他噬菌體裂解 不同來源分離的菌株 其裂解模式具有同一性 TSI，靛基質， pH7.2 尿素，KCN, 賴氨酸，動力 TSI 底層，H2S, KCN，尿素 非如左述 各種反應結果 血清學試驗 ETEC+ 增菌和分離 E 和或 Sh、E4 噬菌體裂解 各種噬菌體均不裂解 氧化酶，G桿菌 EPEC+ 產腸毒素 大腸埃希氏菌 非大腸 埃希氏菌 賴氨酸，靛基質+， 動力(O124 動力+/) 腸毒素+ EIEC+ 非如左述 各種反應結果 非大腸 埃希氏菌 非致瀉大 腸埃希氏菌 腸道侵襲性 大腸埃希氏菌 腸道致病性 大腸埃希氏菌 乳糖發(fā)酵或不發(fā)酵 的菌落 35 個 噬菌體試驗 STEC(O157) stx1,stx2,hly+ 產志賀毒素 大腸埃希氏菌 eae+ 報告 GB 4789.312013 6 5 操作步驟 5.1 前增菌、增菌和分離 5.1.1 沙門氏菌的前增菌、增菌和分離按 GB 4789.4 進行。沙門氏菌增菌液靈敏度的測定見附錄 B。在食品行業(yè)從業(yè)人員的腸道沙門氏菌帶菌檢驗時，采集的標本應增菌，不應前增菌。食物中毒標本不應前增菌，所采集的標本同時做增菌和不增菌步驟。 5.1.2 志賀氏菌的增菌和分離按GB 4789.5進行。 沒有厭氧培養(yǎng)條件的實驗室可以采用附錄A中的BCT增菌液。食物中毒患者的糞便標本同時做增菌和不增菌步驟。 5.1.3 致瀉大腸埃希氏菌的增菌和分離按 GB 4789.6 和 GB 4789.36 進行。食物中毒標本同時做增菌和不增菌步驟。 5.2 噬菌體試驗 5.2.1 培養(yǎng)基的準備 營養(yǎng)瓊脂平板 （含瓊脂 1%1.5%， 為防止變形桿菌的蔓延生長， 可按 0.02%量加入十二烷基硫酸鈉） ，營養(yǎng)瓊脂加熱溶化后，加入每個 9 cm 平皿中約 20 mL25 mL，放在水平臺面上待其凝固。翻轉平板，在 36 1 培養(yǎng)箱內半開皿倒置約 1 h，或 50 1 培養(yǎng)箱內半開皿倒置約 30 min，以烘干培養(yǎng)基表面水分。 5.2.2 試驗菌液的準備 5.2.2.1 自選擇性瓊脂平板上分別挑取 2 個以上典型或可疑菌落，檢驗沙門氏菌時，挑取乳糖陰性產H2S 或不產 H2S 的菌落，和乳糖陽性產 H2S 的菌落。檢驗大腸埃希氏菌時挑取乳糖陽性或乳糖陰性的菌落。檢驗志賀氏菌時挑取典型或可疑菌落分別接種 TSI、半固體和營養(yǎng)瓊脂斜面各一管，置 36 1 培養(yǎng) 20 h24 h 后選取三糖鐵底層產酸、斜面產堿，不產 H2S，不產氣無動力的菌落。下述兩種方法可供制備試驗菌液時選用。 5.2.2.2 方法一：將待檢菌落接種于營養(yǎng)肉湯管內，于 36 1 培養(yǎng) 14 h24 h。挑取此肉湯培養(yǎng)物1 滿環(huán)（約 5 L） ，稀釋于盛有 1 mL2 mL 的營養(yǎng)肉湯管內，使成為 1:2001:400 稀釋菌液，含菌量約為1106 CFU/mL。 5.2.2.3 方法二：用接種針在鑒別平板上挑取可疑菌落，稀釋于盛有 1mL2 mL 營養(yǎng)肉湯管內，含菌量約為 1106 CFU/mL。 5.2.3 涂抹試驗菌液 5.2.3.1 斑點涂抹法： 將營養(yǎng)瓊脂表面自圓心起分為三等分或二等分， 每等分可供涂抹 1 株細菌培養(yǎng)物。每挑取試驗菌液 1 滿環(huán)，涂抹直徑約 1 cm 的菌斑一個。每株培養(yǎng)物涂抹菌斑 7 個，外圈 5 個，內圈 2個。 5.2.3.2 棉簽涂抹法： 用無菌棉簽蘸取試驗菌液并略擠去過多液體， 在如上瓊脂平板表面三分之一的區(qū)域內涂抹。三個涂抹區(qū)之間保持適當距離，待菌液干燥。 5.2.4 滴加噬菌體 用定量為 1 mL 的一次性注射器（針頭無編號，1 mL 約有 100200 滴，每滴相當于 5 L10 L） ，在每一個菌斑上滴加噬菌體?；蛴枚繛?10 L 或 5 L 的微量移液器在每一個菌斑上滴加噬菌體一滴，每滴加一種噬菌體應更換一副注射器或一個吸頭，但是每副注射器或每一個吸頭可以滴完各株細菌的同一種噬菌體。滴加的噬菌體依次為 O-I、C、Sh、E、CE、E-4 和 Ent。滴加噬菌體時應將瓊脂平板放在水平臺面上，液滴應懸空滴下，不要污染針頭或滴頭。待 7 種噬菌體均滴加完畢后，略等數(shù)分鐘待噬菌GB 4789.312013 7 體液干燥。翻轉平板，放在 36 培養(yǎng) 5 h6 h，和 14 h24 h 各觀察一次結果。 如果僅有少數(shù)幾株細菌作噬菌體試驗，可用直徑為 3 mm 的接種環(huán)挑取噬菌體，每一滿環(huán)相當于 5 L，依次加在菌斑上，盡量減少在室溫放置的時間。 5.2.5 試驗結果的判定 必要時（例如不能測定到完整的血清型） ，可吸取少許剩余的蛋白胨水培養(yǎng)物作靛基質試驗，大腸埃希氏菌一般為靛基質陽性，沙門氏菌為靛基質陰性。噬菌體試驗的結果見表 1。 表 1 噬菌體試驗結果 序號 噬菌體裂解模式 判定結果 O-I C Sh E CE E-4 Ent 1 CL - - - - - - 沙門氏菌屬 2 CL - - - - CL - 沙門氏菌屬(靛基質-),大腸埃希氏菌(靛基質+) 3 - CL - - (-) (-) - 弗勞地氏檸檬酸桿菌群a 4 - - CL v v v - 志賀氏菌屬b,大腸埃希氏菌 5 CL - CL v v v - 大腸埃希氏菌 6 v - - CL v v - 大腸埃希氏菌 7 - - - - CL v - 弗勞地氏檸檬酸桿菌群a,大腸埃希氏菌 8 - - - - - CL - 大腸埃希氏菌 9 - (-) v - - - CL 陰溝腸桿菌 0 - - - - - - - 噬菌體不裂解培養(yǎng)物,用生化試驗鑒定 注：CL 表示融合性裂解； 表示不裂解； （）表示少量菌株裂解；v 表示裂解或不裂解。 a含弗勞地氏檸檬酸桿菌、楊氏檸檬酸桿菌、布雷克氏檸檬酸桿菌、沃克曼氏檸檬酸桿菌和吉倫氏檸檬酸桿菌。 b按表 3 檢索并做血清學分型試驗。 5.2.6 供快速檢驗沙門氏菌的噬菌體簡化診斷法 采用如下 3 種噬菌體：沙門氏菌 O-I 噬菌體；E 多價噬菌體，內含 E 和 Sh；C 多價噬菌體，內含 C、CE 和 Ent。培養(yǎng)基和試驗菌液的準備均同前法。 涂抹試驗菌液： 斑點涂抹法將瓊脂平板表面分為 4 等分或 6 等分， 每等分可供涂抹一株細菌培養(yǎng)物，每株培養(yǎng)物涂抹 3 個菌斑，外圈 2 個，內圈 1 個。棉簽涂抹法可將試驗菌液在瓊脂平板上涂抹成帶狀，每個平板約可涂抹 5 條菌帶，置數(shù)分鐘，待菌斑干燥。 依次滴加上述 3 種噬菌體。斑點涂抹法，一般可把 O-I 噬菌體滴加在內圈的菌斑上。帶狀涂抹法，可將 O-I 噬菌體滴加在菌帶的左邊。待噬菌體液滴干燥后，翻轉平板，在 36 培養(yǎng) 5 h 6 h，和 14 h 24 h 各觀察一次結果。按表 2 判定結果。 表 2 噬菌體試驗簡化診斷法 O-I E 多價 C 多價 判定結果 CL - - 沙門氏菌屬 v CL v 大腸埃希氏菌 - - CL 弗勞地氏檸檬酸桿菌群a - - - 噬菌體不裂解培養(yǎng)物 注：CL 表示融合性裂解； 表示不裂解；v 表示裂解或不裂解。 a除表 1 的注中所述外，并含陰溝腸桿菌和少數(shù)大腸埃希氏菌。 GB 4789.312013 8 5.3 噬菌體不裂解培養(yǎng)物的補充生化試驗 少數(shù)沙門氏菌培養(yǎng)物不被 O-I 噬菌體裂解，少數(shù)大腸埃希氏菌培養(yǎng)物不被相應噬菌體裂解，不被各種噬菌體裂解的培養(yǎng)物接種三糖鐵瓊脂，按 GB 4789.4 做 5 項生化試驗，血清學分型鑒定后判定結果。 5.4 血清學分型鑒定及其他補充試驗 5.4.1 沙門氏菌分型鑒定 按 GB 4789.4 進行。如果判定為沙門氏菌時，應得出完整的血清學分型鑒定的結果。 5.4.2 致瀉大腸埃希氏菌鑒定 5.4.2.1 按 GB 4789.6 和 GB 4789.36 進行。分離的菌株應該同時被同樣的幾個噬菌體裂解后，用大腸埃希氏菌分型噬菌體試驗，這些菌株應該具有相同的裂解模式，同時測定 1 RTD 噬菌體的裂解情況。 5.4.2.2 產腸毒素大腸埃希氏菌，應有腸毒素試驗的證實。 5.4.2.3 侵襲性大腸埃希氏菌，典型的生化特性為：賴氨酸脫羧酶試驗陰性、無動力、產氣或不產氣（O124 血清型亦可以為有動力、不產氣） ，靛基質試驗陽性?？蛇M一步做豚鼠角膜試驗，結果應該為陽性，質粒電泳應證明具有 120140 Mdal 大質粒，PCR 試驗證明具有 ipaC 或 ipaH 基因。 5.4.2.4 產志賀毒素大腸埃希氏菌 O157:H7，典型的生化特性為：乳糖、蔗糖產酸，葡萄糖產酸并多數(shù)產氣，硫化氫陰性，靛基質陽性，山梨醇遲緩發(fā)酵。PCR 試驗證明具有產志賀毒素基因 stx1，stx2 和溶血毒素基因 hly。1RTD 的 E-2 噬菌體裂解試驗，能被 1RTD 的 E-2 噬菌體裂解（裂解程度包括從 CL到少數(shù)幾個噬斑） 。對于產志賀毒素和溶血毒素其他血清型的大腸埃希氏菌，按照 5.4.2.3 的程序進行鑒定。 5.4.2.5 腸道致病性大腸埃希氏菌 具有大腸埃希氏菌的典型生化特性，eae 基因（黏附屏蔽基因）的PCR 試驗為陽性。產志賀毒素大腸埃希氏菌 eae 試驗也可為陽性。EAF（黏附因子質?；颍┗?bfp（菌毛捆綁形成基因）的 PCR 試驗可進一步證實。 5.4.3 志賀氏菌分型鑒定 5.4.3.1 挑取三糖鐵瓊脂上的培養(yǎng)物，按噬菌體裂解模式，選用相應的志賀氏菌分型因子血清，做玻片凝集試驗。血清學分型鑒定結果見表 3。 表 3 噬菌體試驗的結果和志賀氏菌血清學分型鑒定的結果 序號 噬菌體裂解模式 志賀氏菌血清學分型鑒定的結果 O-I C Sh E CE E-4 Ent 1 - - CL CL CL CL - 福氏 1-5,(鮑氏 11) 2 - - CL CL CL - - 福氏 1,4,痢疾 2,鮑氏 5,7,11,16,17,(宋內氏 I) 3 - - CL CL - - - 宋內氏 I,痢疾 2,福氏 4,鮑氏 5,16 4 - - CL CL - CL - 宋內氏 II,福氏 3 5 - - CL - - - - 福氏 6,鮑氏 14,偶數(shù)型 618(除 16 外),痢疾 312 6 - - CL - CL - - 鮑氏 9,15 7 - - CL - - CL - 痢疾 1,(宋內氏 II) 8 CL - CL - - - - 鮑氏 13a 注：CL 表示融合性裂解； 表示不裂解。 a鮑氏 13 型 DNA 同源性測定不符合志賀氏菌。 5.4.3.2 如按噬菌體裂解模式結果為福氏志賀氏菌 15 型，先用福氏多價血清做凝集試驗。如呈現(xiàn)凝集，再分別用各型和群因子血清檢查，以確定所屬血清型和亞型（見 GB 4789.5） 。 5.4.3.3 如按噬菌體裂解模式結果為福氏 6 型，鮑氏各型或痢疾 312 型，先用福氏 6 型血清做凝集試GB 4789.312013 9 驗。福氏 6 型血清不凝集者，用鮑氏多價血清或痢疾 312 型多價血清做凝集試驗，如果呈現(xiàn)凝集，再分別用各型因子血清檢查。 5.4.3.4 如按噬菌體裂解模式結果為宋內氏 II 相菌而不被宋內氏血清凝集時，可直接按噬菌體裂解模式和粗糙型菌落特征判定之。 5.4.3.5 按噬菌體裂解模式結果做血清學試驗不凝集者， 或雖發(fā)現(xiàn)其被某一個分型因子血清凝集而與噬菌體裂解模式不相符者，或雖與噬菌體裂解模式相符但不被 1 RTD 的 Sh 噬菌體裂解者，均應做葡萄糖銨試驗以與大腸埃希氏菌相鑒別。葡萄糖銨試驗陽性者為大腸埃希氏菌。必要時可做如下生化試驗：醋酸鹽、克氏檸檬酸鹽和粘液酸的利用試驗，賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶試驗，七葉苷分解試驗。除宋內氏菌鮑氏 13 型為鳥氨酸脫羧酶陽性， 并有少數(shù)宋內氏菌菌株可利用黏液酸外， 志賀氏菌屬的培養(yǎng)物均為陰性結果。上述試驗任何陽性結果均提示為大腸埃希氏菌（按 GB 4789.5） 。 5.4.3.6 檢出的志賀氏菌培養(yǎng)物應符合該群的生化特性。福氏志賀氏菌 6 型符合鮑氏志賀氏菌的特性。靛基質陽性的志賀氏菌血清型有痢疾 2 型、7 型和 8 型，鮑氏 5、7、9、11、13、15、16 和 17 型。福氏志賀氏菌 15 型的靛基質反應較弱。靛基質陰性的志賀氏菌血清型為痢疾 1 型、36 型、912 型、福氏6 型、鮑氏 14、6、8、10、12、14 和 18 型、宋內氏菌。 5.4.3.7 鮑氏志賀氏菌13型是唯一可被沙門氏菌O-I裂解的菌株， 該菌株只被高效價的Sh噬菌體裂解。 5.5 結果報告 5.5.1 沙門氏菌檢驗的結果報告 5.5.1.1 O-I 噬菌體裂解，其他噬菌體均不裂解者，經(jīng)沙門氏菌血清分型后報告。 5.5.1.2 各種噬菌體不裂解，生化試驗結果為沙門氏菌，經(jīng)沙門氏菌血清分型后報告，不可報告為未定型。 5.5.2 志賀氏菌檢驗的結果報告 5.5.2.1 Sh 噬菌體裂解，呈現(xiàn)各種裂解模式，血清學試驗與裂解模式相符者，可報告志賀氏菌血清型。罕見血清型要求被 1 RTD Sh 噬菌體裂解，并符合志賀氏菌生化分群結果。 5.5.2.2 非如 5.5.2.1 的試驗結果均報告非志賀氏菌。 5.5.3 致瀉大腸埃希氏菌檢驗的結果報告 5.5.3.1 E 和或 Sh、E-4 噬菌體裂解，不同來源菌株的裂解模式具有同一性，或各種噬菌體均不裂解，經(jīng)血清學分型確定者可分別報告為產腸毒素大腸埃希氏菌 （腸毒素試驗結果陽性） ， 侵襲性大腸埃希氏菌（賴氨酸陰性、動力陰性，O124 可為動力陽性） ，產志賀毒素大腸埃希氏菌（O157: :H7 和 O157: :NM，stx1, stx2, hly 試驗陽性）或腸道致病性大腸埃希氏菌（eae 試驗陽性） 。 5.5.3.2 非如 5.5.3.1 的結果均報告為非大腸埃希氏菌或非致瀉大腸埃希氏菌。 GB 4789.312013 10 附錄 A 培養(yǎng)基及試劑 A.1 亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液 A.1.1 成分 蛋白胨 5.0 g 乳糖 4.0 g 亞硒酸氫鈉 4.0 g 1% L-胱氨酸溶液 1.0 mL 磷酸氫二鈉（無水） 4.5 g 磷酸二氫鈉（無水） 5.5 g 蒸餾水 加至1 000.0mL A.1.2 制法 稱取 L-胱氨酸 0.1 g（或 DL-胱氨酸 0.2 g） ，加入 1 mol/L 氫氧化鈉溶液 1.5 mL，使胱氨酸溶解，再加入蒸餾水 8.5 mL，即為 1% L-胱氨酸溶液。 將蛋白胨、乳糖、胱氨酸加入于蒸餾水 800 mL 中，為基礎液。 將亞硒酸氫鈉加入于 100 mL 蒸餾水中，為 A 液。 將磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉加入于 100 mL 蒸餾水中，為 B 液。 取基礎液 4.0 mL，A 液 0.5 mL，B 液 0.5 mL 混合，測定 pH。校正 pH 至 7.07.1，將此 3 份溶液分別包裝，在 121高壓滅菌 15 min（從高壓滅菌器開始加熱到取出不超過 1 h） ，待其冷卻至常溫后放入5 冰箱內保存。臨用前將 3 份溶液按比例混合，分裝試管。3 份溶液混合后，其 pH 值小于 7.0，則應調整磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉的用量和亞硒酸氫鈉的用量。使用前應測定其增菌靈敏度，方法見附錄 B。不同亞硒酸鹽和磷酸鹽的用量見表 A.1。 表 A.1 不同亞硒酸鹽和磷酸鹽的用量 亞硒酸鹽的種類和用量 g 磷酸鹽的種類和用量 g 主要種類 用量 NaH2PO4(無水) Na2HPO4(無水) 亞硒酸鈉H2O(100%) 5.0 8.6 0.8 亞硒酸鈉H2O (75%) 4.75 7.8 1.25 亞硒酸鈉H2O (50%) 4.5 7.0 2.65 亞硒酸氫鈉(75%) 4.25 6.25 3.58 亞硒酸氫鈉(100%) 4.0 5.5 4.5 亞硒酸氫鈉(75%) 3.85 4.7 5.4 亞硒酸氫鈉(50%) 3.7 3.9 6.35 亞硒酸(75%) 3.55 3.1 7.28 亞硒酸(100%) 3.4 2.3 8.2 注：表中所列均為在 1000mL 增菌液中的用量。 GB 4789.312013 11 A.2 四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液 A.2.1 成分 A.2.1.1 基礎液 多價胨或初蛋白胨 3.0 g 膽鹽 1.0 g 碳酸鈣 10.0 g 硫代硫酸鈉 30.0 g 0.1%煌綠水溶液 10.0 mL 蒸餾水 加至1 000.0 mL A.2.1.2 碘液 碘 6.0 g 碘化鉀 5.0 g 蒸餾水 20.0 mL A.2.2 制法 A.2.2.1 基礎液的配制：將基礎液的成分依次加到 800mL 蒸餾水中，成分溶解后加蒸餾水至 1000mL，校正 pH 至 7.00.1，經(jīng)高壓滅菌 121，15 min。冷卻后保存?zhèn)溆谩?A.2.2.2 碘液的配制： 先將碘化鉀溶解于蒸餾水中， 再加入碘片， 振搖至碘片完全溶解。 貯于棕色瓶內，密塞備用。臨用前將基礎液與碘液混合，分裝試管。使用前應測定其增菌靈敏度，方法見附錄 B。 注：為了防止變形桿菌的過度生長，可以在 1000 mL 中加入磺胺噻脞 1.25 mg。 A.3 志賀氏菌（BCT）增菌液 A.3.1 成分 蛋白胨 20.0 g 復合氨基酸 2.0 g 牛肉膏 5.0 g 三號膽鹽 4.5 g 檸檬酸鈉 4.5 g 硫代硫酸鈉 4.5 g 蒸餾水 加至1 000.0 mL A.3.2 制法 將 A.3.1 成分混合加熱溶解，冷卻至 25校正 pH 至 7.20.1，高壓滅菌 121，15 min，冷卻后分裝試管備用。 A.4 營養(yǎng)肉湯（NB） GB 4789.312013 12 A.4.1 成分 蛋白胨 15.0 g 牛肉膏 3.0 g 氯化鈉 5.0 g 蒸餾水 加至1 000.0 mL A.4.2 制法 將 A.4.1 成分混合加熱溶解，冷卻至 25校正 pH 至 7.20.2，高壓滅菌 121 ，15 min，備用。 A.5 營養(yǎng)瓊脂（NA） 成分和制法：在 1000 mL 營養(yǎng)肉湯（NB）內加入瓊脂 15 g（如用作噬菌體試驗，只加瓊脂 10 g） ，高壓滅菌 120 ，15 min，備用。 A.6 營養(yǎng)半固體瓊脂（NSA） 成分和制法：在 1000 mL 營養(yǎng)肉湯（NB）內加入瓊脂 3 g，高壓滅菌 120 ，15 min，備用。 A.7 三糖鐵瓊脂（TSI） A.7.1 成分 蛋白胨 20.0 g 牛肉膏 3.0 g 乳 糖 10.0 g 蔗 糖 10.0 g 葡萄糖 1.0 g 硫酸亞鐵銨（含6個結晶水） 0.5 g 酚紅 0.025 g或5 gL溶液5 mL 氯化鈉 5.0 g 硫代硫酸鈉 0.5 g 瓊 脂 12.0 g 蒸餾水 加至1 000.0 mL A.7.2 制法 除酚紅和瓊脂外，將其他成分加入 400 mL 蒸餾水中，攪拌均勻，靜置約 10 min，加熱煮沸至完全溶解，校正 pH 至 7.40.1。另將瓊脂加入 600 mL 蒸餾水中，攪拌均勻，靜置約 10 min，加熱煮沸至完全溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再加入酚紅指示劑，混勻，分裝試管（12 mm100 mm） ，每管約 2 mL4 mL，高壓滅菌 120 10 min 或 115 15 min，滅菌后置成高層斜面，呈桔紅色。 A.8 葡萄糖銨瓊脂 A.8.1 成分 GB 4789.312013 13 氯化鈉 5.0 g MgSO4 7H2O 0.2 g NH4H2PO4 1.0 g 磷酸氫二鉀（無水） 1.0 g 葡萄糖 5.0 g 瓊脂 20.0 g 0.2%溴麝香草酚藍 40.0 mL 蒸餾水 加至 1 000.0 mL A.8.2 制法 將 A.8.1 成分混合加熱溶解，冷卻至 25校正 pH 至 6.80.1，高壓滅菌 121，15 min，放置成斜面，冷卻后備用。 A.8.3 試驗方法 用接種針輕輕觸及培養(yǎng)物的表面，在鹽水管內做成極稀的懸液，肉眼觀察不到混濁，以每一接種環(huán)內含菌數(shù)在20 CFU100 CFU之間為宜。 將接種環(huán)滅菌后挑取菌液接種， 同時再以同法接種普通斜面一支作為對照。于36 1 培養(yǎng)24 h。陽性者葡萄糖銨斜面上有正常大小的菌落生長；陰性者不生長，但在對照培養(yǎng)基上生長良好。如在葡萄糖銨斜面生長極微小的菌落可視為陰性結果。 GB 4789.312013 14 附錄 B 增菌液靈敏度測定方法 B.1 沙門氏菌增菌液靈敏度測定方法 B.1.1 試驗菌株為沙門氏菌鼠傷寒血清型，沙門氏菌腸炎血清型。 B.1.2 干擾菌株為大腸埃希氏菌。 B.1.3 將試驗菌株和干擾菌株接種營養(yǎng)肉湯管，在 36 1 培養(yǎng) 18 h24 h。菌液濃度約為109CFU/mL。 大腸埃希氏菌菌液濃度不需測定， 應測定沙門氏菌鼠傷寒血清型和腸炎血清型的菌液濃度。 B.1.4 每組 8 支 15 mm150 mm 試管，編號，單號試管內每管加入滅菌生理鹽水 4.5 mL，雙號試管內每管加入滅菌生理鹽水 5.0 mL。 B.1.5 在 1 號管內加入沙門氏菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液 0.5 mL，在 2 號管內加入沙門氏菌培養(yǎng)液 0.05 mL。再從 2 號管內吸取沙門氏菌稀釋菌液，加入到 3 號管內 0.5 mL，加入到 4 號管內 0.05 mL。按此法繼續(xù)稀釋到 8 號管。每次稀釋應更換一支吸管。 B.1.6 吸取 6 號管內的稀釋菌液各 0.1 mL，分別點加在 2 個營養(yǎng)瓊脂平板上，用彎曲的接種環(huán)將菌液均勻涂布，待平板表面的菌液干燥后，于 36 1 培養(yǎng) 14 h24 h。計算平板上生長的沙門氏菌菌落數(shù)，取其平均數(shù)，約為 100 CFU。 B.1.7 接 B.1.5，排好若干組每組 10 支需要測定的增菌液，第 8 管到第 10 管都加入 8 號稀釋管的稀釋菌液各 0.1 mL；第 7 管到第 1 管逆序加入該稀釋度的稀釋菌液各 0.1 mL。