分子發(fā)光分析法教學(xué).pptVIP

1,第五章 分子發(fā)光分析法,2,3,4,第五章 分子發(fā)光分析法,分子熒光、磷光分析法的基本原理 熒光分析儀器 分子熒光定量分析 簡介化學(xué)發(fā)光,5, 5- 1 概述,一、分子發(fā)光分析法及其分類 某些物質(zhì)的分子吸收一定能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，以光輻射的形式從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，這種現(xiàn)象稱為分子發(fā)光，在此基礎(chǔ)上建立起來的分析方法為分子發(fā)光分析法。,較高激發(fā)態(tài),基 態(tài),吸收能量受激,光輻射退激,6,根據(jù)分子受激時所吸收能源及輻射光的機理不同分為以下幾類： 光致發(fā)光：以光源來激發(fā)而發(fā)光 生物發(fā)光：以生物體釋放的能量激發(fā)而發(fā)光 化學(xué)發(fā)光：以化學(xué)反應(yīng)能激發(fā)而發(fā)光化學(xué)發(fā)光分析法,熒光熒光分析法 磷光磷光分析法,7,二、分子熒光分析法的特點,1. 靈敏度高 熒光強度隨激發(fā)光強度增強而增強。提高激發(fā)光強度，可提高熒光強度。,采用高靈敏度的檢測系統(tǒng)可大大提高靈敏度，檢測限熒光分析法比分光光度法低24個數(shù)量級。,8,2. 選擇性好 不同的物質(zhì)用不同的光進行激發(fā)，選擇不同的激發(fā)光波長 不同的物質(zhì)發(fā)射的熒光不同，選擇不同的檢測熒光波長 比較容易排除其它物質(zhì)的干擾，選擇性好 3. 實驗方法簡單 4. 待測樣品用量少；儀器價格適中；測定范圍較廣,根據(jù)發(fā)光強度可定量測定許多痕量的無機物和有機物，廣泛應(yīng)用在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)及農(nóng)牧產(chǎn)品分析、衛(wèi)生檢疫等領(lǐng)域。 熒光法比磷光法應(yīng)用廣泛，不如分光光度法,9, 5- 2 熒光和磷光光譜法,一、熒光和磷光光譜的產(chǎn)生 具有不飽和基團的基態(tài)分子光照后，價電子躍遷產(chǎn)生熒光和磷光 基態(tài)分子 價電子躍遷到激發(fā)態(tài),光照激發(fā),去激發(fā)光 * * n,基 態(tài),在光致激發(fā)和去激發(fā)光的過程中，分子中的價電子（ 、n電子）處于不同的自旋狀態(tài)，通常用電子自旋狀態(tài)的多重性來描述。,10,1. 電子自旋狀態(tài)的多重性,大多數(shù)分子含有偶數(shù)電子，基態(tài)分子每一個軌道中兩個電子自旋方向總是相反的 ，處于基態(tài)單重態(tài)（2S+1=1)。用 “S0” 表示 ；當(dāng)物質(zhì)受光照射時，基態(tài)分子吸收光能產(chǎn)生電子能級躍遷，由基態(tài)躍遷至更高的單重態(tài)，電子自旋方向沒有改變，凈自旋 = 0 ，這種躍遷是符合光譜選律的。,S0, S1, S2, S3分別代表基態(tài), 第一, 二, 三激發(fā)單重態(tài),單重態(tài)分子具有抗磁性，激發(fā)態(tài)的平均壽命約為10-8,11,若分子中電子躍遷過程中伴隨著自旋方向的改變，由基態(tài)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)，凈自旋 0。這種躍遷為禁阻躍遷 T1、T2、T3分別表示第一、二、三激發(fā)三重態(tài),自旋平行,三重態(tài)分子具有順磁性，激發(fā)態(tài)的平均壽命約為10-410S,12,傳遞途徑,輻射躍遷,無輻射躍遷,熒光,延遲熒光,磷光,振動弛豫,內(nèi)部轉(zhuǎn)移,系間竄躍,外部轉(zhuǎn)移,分子中電子受激躍遷到激發(fā)態(tài)后，處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，去激返回到較低激發(fā)態(tài)或基態(tài)時有兩種方式：無輻射去激和輻射去激.,13,2. 無輻射去激不伴隨發(fā)光現(xiàn)象的過程叫無輻射去激，體系內(nèi)的多余的能量以熱的形式釋放。包括： 振動馳豫 內(nèi)部轉(zhuǎn)換 系間竄躍 外部轉(zhuǎn)移,14,T1,S0,吸光 吸光,S0,S1,S2,15,發(fā)生系間竄躍電子需轉(zhuǎn)向，S1T1間進行，比內(nèi)部轉(zhuǎn)換困難。 外部轉(zhuǎn)移指激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子的相互作用及能量轉(zhuǎn)移，使熒光或磷光強度減弱或消滅。,16,3. 熒光和磷光光譜的產(chǎn)生輻射去激,處于S1或T1態(tài)的電子返回S0態(tài)時，伴隨有發(fā)光現(xiàn)象，這種過程叫輻射去激 S1或T1 S0,發(fā)光,（1）熒光： 當(dāng)電子從第一激發(fā)單重態(tài)S1的最低振動能級回到基態(tài)S0各振動能級所產(chǎn)生的光輻射叫熒光,VR,VR,IC,吸光 吸光 熒光,S0,S1,S2,17,T1,S0,VR,VR,IC,吸光 吸光 熒光 圖7-1 分子熒光光譜產(chǎn)生過程示意圖,S0,S1,S2,VR：振動馳豫 IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換 ISC：系間竄躍,18,熒光是相同多重態(tài)間的允許躍遷，產(chǎn)生速度快，10-910-6s，又叫快速熒光或瞬時熒光，外部光源停止照射，熒光馬上熄滅。 無論開始電子被激發(fā)至什么高能級，它都經(jīng)過無輻射去激消耗能量后到S1的最低振動能級，發(fā)射熒光，熒光波長比激發(fā)光波長長。 熒激,19,（2） 磷 光,當(dāng)受激電子降到S1的最低振動能級后，未發(fā)射熒光，而是經(jīng)過系間竄躍到T1振動能級，經(jīng)振動馳豫到 T1最低振動能級，從T1最低振動能級回到基態(tài)的各個振動能級所發(fā)射的光叫磷光。,20,T1,S0,ISC,VR,VR,IC,吸光 吸光 熒光 磷光 圖5-1 分子熒光、磷光光譜產(chǎn)生過程示意圖,S0,S1,S2,VR：振動馳豫 IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換 ISC：系間竄躍,VR,21,從T1 S1要改變電子自旋，發(fā)光速度慢，約為 10-4 10s，光照停止后，磷光仍可持續(xù)一段時間 分子相互碰撞的無輻射能量損耗大，所以磷光的波長更長。 磷 熒 激 * 易產(chǎn)生熒光 n * 易產(chǎn)生磷光,22,二、熒光、磷光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,了解熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系，可以預(yù)測哪些物質(zhì)能產(chǎn)生熒光，在什么條件下產(chǎn)生，以及發(fā)射的熒光有什么特征以便更好地運用熒光分析技術(shù)，采取一些措施把不發(fā)熒光的物質(zhì)產(chǎn)生熒光，即把非熒光體變成熒光體，弱熒光體變成強熒光體。 （一）熒光效率熒光量子效率；量子產(chǎn)率 熒光強度常用熒光量子效率 f 來描述 熒光量子效率 f =, f 是一個物質(zhì)熒光特性的重要參數(shù)，反映了熒光物質(zhì)發(fā)射熒光的能力， f 越大，熒光越強，在01之間,23,若以各種躍遷速率常數(shù)來表示 Kf 為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)取決于物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。 Ki 為非輻射躍遷的速率常數(shù)之和主要取決于化學(xué)環(huán)境，也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。 分析上有應(yīng)用價值的熒光化合物的熒光效率在0.11之間。,24,至今對激發(fā)態(tài)分子的性質(zhì)了解不深，無法定量地描述熒光與分子結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系 一般情況，有機芳香族化合物及金屬離子配合物是最強最有用的熒光體 （二）熒光磷光與有機化合物結(jié)構(gòu)的關(guān)系 1. 躍遷類型 大多數(shù)熒光物質(zhì)首先吸收紫外可見光,產(chǎn)生 *，n *躍遷激發(fā)，經(jīng)過非輻射躍遷，再發(fā)生* * n躍遷產(chǎn)生熒光。 *與n *躍遷相比，摩爾吸收系數(shù)大102103倍，壽命短。 *躍遷常產(chǎn)生較強的熒光， n *躍遷產(chǎn)生的熒光弱，但可產(chǎn)生系間竄躍，產(chǎn)生更強的磷光。,25,2. 共軛效應(yīng)有較強的熒光 具有共軛體系的芳環(huán)或雜環(huán)化合物， 電子共軛程度越大，越易產(chǎn)生熒光; 環(huán)越多，共軛程度越大，產(chǎn)生熒光波長越長，發(fā)射的熒光強度越強,f ex /nm em /nm,26,芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光。 多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測定 例： 3，4 - 苯并芘是強致癌物, ex = 386 nm em = 430 nm,27,3. 剛性平面結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定的平面結(jié)構(gòu),具有強熒光的分子多數(shù)有剛性平面結(jié)構(gòu),熒光素：氧橋把兩個環(huán)固定在一個平面上，具有平面結(jié)構(gòu)，強熒光物質(zhì),酚酞：無氧橋把兩個環(huán)固定，不能很好的共平面，為非熒光物質(zhì),28,例 1，2 - 二苯乙烯,反式：平面構(gòu)型 強熒光體,順式：非平面構(gòu)型 非熒光體,29,4. 取代基效應(yīng),取代基對熒光物質(zhì)的熒光特征和強度也有很大影響。分成三類： （1）增強熒光的取代基 有 -OH、-OR、 -NH2、-NHR、-NR2等給電子基團。 由于基團的 n 電子（孤對電子）的電子云與苯環(huán)上的 軌道平行，共享了共軛 電子，擴大了共軛體系，使熒光波長長移，熒光強度增強。,30,（2）減弱熒光的取代基 -COOH 、 -NO2 、-COOR 、-NO、-SH 吸電子基團, 使熒光波長短移，熒光強度減弱 芳環(huán)上被F、Cl、Br、I 取代后，使系間竄躍加強，磷光增強，熒光減弱。其熒光強度隨鹵素原子量增加而減弱，磷光相應(yīng)增強，這種效應(yīng)為重原子效應(yīng)。 （3）影響不明顯的取代基 -NH3+、-R、 SO3H等 取代基的空間位阻對熒光也有影響，熒光減弱,31,5. 電子躍遷類型,含N、O、S雜原子的不飽和有機物，如喹啉和芳酮類物質(zhì)都含有未鍵合的孤對n電子，電子躍遷多為n * ，系間竄躍強烈，熒光很弱或不發(fā)熒光。 不含N、O、S雜原子的有機熒光體多發(fā)生 * 類型的躍遷，摩爾吸收系數(shù)大，約為104，熒光強。,32,（三）金屬螯合物的熒光,大多數(shù)無機鹽類金屬離子，不能產(chǎn)生熒光，但某些螯合物都能產(chǎn)生很強的熒光，可用于痕量金屬離子的測定。 不少有機配體是弱熒光體 或不發(fā)熒光，但與Mn+形成螯合物后變?yōu)槠矫鏄?gòu)型，就會使熒光加強或產(chǎn)生熒光。 例：8-羥基喹啉為弱熒光體，與Mn+ Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成剛性結(jié)構(gòu)，熒光加強,33,三、環(huán)境對熒光、磷光的影響,1. 溶劑的影響 同一熒光物質(zhì)在不同的溶劑中可能表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì) 一般來說，溶劑的極性增強，熒光波長長移，熒光強度增大,2. 溫度的影響低溫下測定，提高靈敏度 大多數(shù)熒光物質(zhì)都隨溶液溫度升高熒光效率下降，熒光強度減弱。 溫度對磷光影響更大,34,3. pH的影響,大多數(shù)含有酸性或堿性基團的芳香族化合物的熒光性質(zhì)受溶液pH的影響很大 共軛酸堿對是具有不同熒光性質(zhì)的兩種型體，具有各自的熒光效率和熒光波長。,6,pH1 有熒光,pH13 無熒光,無熒光,有熒光,另外，表面活性劑也會影響熒光強度和特性,35,四、熒光強度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系,用強度為I0的入射光，照射到液池內(nèi)的熒光物質(zhì)時，產(chǎn)生熒光，熒光強度If 用儀器測得，在熒光濃度很稀時，熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光強度If 與濃度有下面的關(guān)系。,Ia為吸收的輻射強度 I0為入射光強度,If = f （I0- I010-A ） = f I0 （1-10-A ）,I = I010-A,將上式展開,If = f Ia= f （I0- I ）,36,當(dāng)A0.05時，方括號中其它各項與第一項相比可忽略不計，上式簡化 If = 2.3 f I0A =2.3 f I0 cL,當(dāng)A0.05時， If與 f 、I0、 和c 有關(guān)，對一給定物質(zhì)，當(dāng)激發(fā)光波長和強度一定時， f 、I0、 和L為常數(shù)，合并為K If = Kc Ip = Kc,定量分析依據(jù),37,熒光強度與物質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，If=Kc只有在濃度低時使用，熒光物質(zhì)測定的是微量或痕量組分，靈敏度高。 濃度高時， If與c不呈線性關(guān)系，有時c增大， If反而降低。因為公式 中后面影響，有時發(fā)生熒光猝滅效應(yīng)。,If=Kc,38,熒光猝滅 熒光物質(zhì)與溶劑或其它物質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，或發(fā)生碰撞后使熒光強度下降或熒光效率f 下降稱為熒光猝滅。 使熒光強度降低的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑Q 氧分子及產(chǎn)生重原子效應(yīng)的溴化物、碘化物等都是常見的熒光猝滅劑。 碰撞猝滅* M +激 M* M* + Q MQ +熱 自熄滅熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光被熒光物質(zhì)的基態(tài)分子所吸收，即自吸收現(xiàn)象。,39,（一）熒光分析儀器主要由光源、單色器、液槽、檢測器和顯示器組成,與分光光度計有兩點不同 兩個單色器 檢測器與激發(fā)光互成直角,五、熒光和磷光分析儀器,40,熒 光 分光光度計 示 意 圖,光源,第一單色器,樣品池,第二單色器,光電倍增管,顯示器,41,1、光源,激發(fā)光源一般要求比吸收測量中的光源有更大的發(fā)射強度；適用波長范圍寬 熒光計中，常使用鹵鎢燈作光源 熒光光度計中常用高壓汞燈和氙弧燈,利用汞蒸氣放電發(fā)光的 光源；常用其發(fā)射365 nm、 405 nm、 436 nm 三條譜線 以365 nm 的譜線最強,應(yīng)用最廣泛的一種光 源，可發(fā)射250800nm 很強的連續(xù)光源,42,2、單色器,熒光計用濾光片作單色器，熒光計只能用于定量分析，不能獲得光譜。 大多數(shù)熒光光度計一般采用兩個光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜。 第一單色器作用：分離出所需要的激發(fā)光，選擇最佳激發(fā)波長 ex ，用此激發(fā)光 ex激發(fā)液池內(nèi)的熒光物質(zhì)。（VB2 ex為471nm） 第二單色器作用：濾掉一些雜散光和雜質(zhì)所發(fā)射的干擾光，用來選擇測定用的熒光波長 em。 在選定的 em 下測定熒光強度，定量分析。 （VB2 em為525nm）,43,3、樣品池,盛放測定溶液. 通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上邊 4、檢測器 把光信號轉(zhuǎn)化成電信號, 放大, 直接轉(zhuǎn)成熒光強度 熒光的強度一般較弱，要求檢測器有較高的靈敏度，熒光光度計采用光電倍增管。 5、讀出裝置 記錄儀記錄或打印機打印出結(jié)果，掃描激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。 熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，是因為熒光強度與激發(fā)光強度成正比，提高激發(fā)光強度可大大提高熒光強度。,44,（二）激發(fā)光譜和熒光、磷光光譜,激發(fā)光譜：熒光和磷光均為光致發(fā)光，合適的激發(fā)光波長需根據(jù)激發(fā)光譜確定激發(fā)光譜是在固定熒光波長下，測量熒光體的熒光強度隨激發(fā)波長變化的光譜。,激發(fā)光譜 固定em 熒光波長,獲得方法：先把第二單色器的波長固定，使測定的em不變，改變第一單色器波長，從200700 nm 掃描，讓不同波長的光照在熒光物質(zhì)上，測定它的熒光強度，以I 為縱坐標(biāo)， ex為橫坐標(biāo)得左圖，即熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜,從曲線上找出ex，實際上選波長較長的高波長峰,45,熒光光譜 固定 ex 激發(fā)光波長,獲得方法：先把第一單色器的波長固定，使激發(fā)的ex不變，改變第二單色器波長，讓不同波長的光掃描，測定它的發(fā)光強度，以I 為縱坐標(biāo)， em為橫坐標(biāo)得左圖，即熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜 從曲線上找出最大的 em,46,激發(fā)光譜和熒光光譜,熒光強度,波長（nm),300,400,500,硫酸奎寧的兩個光譜,I,ex,max,fl,max,47,磷 熒 激,吸收峰,熒光峰,磷光峰,吸收光譜、熒光光譜和磷光光譜,48,（三）磷光分析儀器,與熒光分析儀器相似，主要差異如下： 1. 試樣室 測定低溫磷光時試樣需在液氮溫度（77K，-196 ）下進行，將液池放在盛放液氮的杜瓦瓶內(nèi)。 固體表面室溫磷光分析需特制試樣室。 2. 磷光鏡 有些物質(zhì)既可產(chǎn)生熒光，又能產(chǎn)生磷光。用機械切光裝置磷光鏡區(qū)別熒光和磷光。利用熒光壽命短，磷光壽命長消除熒光干擾。,49,六、 熒光、磷光分析及應(yīng)用,（一）定量分析方法 定量分析依據(jù) If = Kc Ip = Kc 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法最常用的定量分析方法 將已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試樣在相同條件下處理，配制一系列標(biāo)準(zhǔn)液，測定它們的相對發(fā)光強度。 以相對熒光強度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo) 濃度 c1 c2 c3 c4 c5 cx 熒光強度 If1 If2 If3 If4 If5 Ifx,50,2. 比較法較簡單,如果試樣數(shù)量不多，可用比較法進行測量 配一標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為cs， cs與未知液濃度cx相近，并在相同條件下測定它們的熒光強度 未知液 If x = K cx 標(biāo)準(zhǔn)液 If s = K cs,比較,51,3. 多組分混合物的熒光分析,(1) 如果兩組分的熒光峰相互不干擾,可直接測定 可分別在各自的熒波長處測定,求出它們的含量 (2) 如果兩組分的熒光峰相互干擾,但激發(fā)光譜有顯著區(qū)別,在某一激發(fā)光下一個組分產(chǎn)生熒光峰,另一組分不產(chǎn)生熒光; 可選用不同的激發(fā)光進行測定,52,(3) 如果兩組分的熒光光譜和激發(fā)光譜相互干擾,利用熒光強度的加和性（If=If1+If2+If3+），在適宜的熒光波長處測定，用聯(lián)立方程來求解 例：硫胺熒 CT ex =385nm em=435nm 吡啶硫胺熒CP ex =410nm em=480nm,相互干擾熒 光光譜重疊,在385nm下激發(fā)，在435和480nm下分別測熒光強度, 或410nm下激發(fā)在435和480nm下分別測熒光強度,53,在385nm下激發(fā)，在435和480nm下分別測熒光強度,If =KcK: 純物質(zhì)在選定波長下測If,求K,或410 nm激發(fā)，在435和480nm下分別測熒光強度,54,（二）熒光分析法的應(yīng)用,熒光分析法具有靈敏度高、取樣量少等優(yōu)點 1. 無機化合物的分析 無機化合物中，能直接產(chǎn)生熒光并應(yīng)用于測定的為數(shù)不多，但與有機化合物生成發(fā)熒光的有機配合物后，進行熒光分析的元素達70多種，其中較常采用熒光法測定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素。,能夠同金屬離子形成熒光配合物的有機試劑絕大多數(shù)是芳香族化合物，形成五元環(huán)或六元環(huán)的螯合物，分子的剛性平面結(jié)構(gòu)增大，變?yōu)閺姛晒怏w。 熒光猝滅法也是熒光分析中經(jīng)常采用的方法。可采用熒光猝滅法間接測定的離子有：F-、S2-、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+等。,55,2. 有機化合物的分析,脂肪族有機化合物的分子結(jié)構(gòu)較為簡單，本身能發(fā)熒光的很少，一般需要與某些試劑反應(yīng)后才能進行熒光分析。 芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)熒光；可直接用熒光法測定。對于具有致癌活性的多環(huán)芳烴熒光分析法是最主要的測定方法。 為提高測定的靈敏度，有時也將芳香族化合物與適當(dāng)試劑反應(yīng)之后進行測定。,56,可測定結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大量有機物質(zhì)，如：各種維生素、葉綠素、氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和輔酶以及各種藥物、毒物和農(nóng)藥等。,57,例： VB2,又稱核黃素，是一種生長促進劑，常存在于動物肝臟、肉類、蛋黃、豆類、花生、蘑菇和海藻中， VB2易溶于強酸或強堿性溶液。 在低濃度情況下，I= Kc，I與c呈線性關(guān)系。 在 ex光照射下，發(fā)出綠色熒光， em = 525 nm下測 I ，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定。,缺VB2會得口角炎、舌炎、 唇炎、脂溢性皮炎,維生素B2,58,例：3，4 苯并芘的測定,3，4 苯并芘為強致癌物質(zhì),煤炭、石油、天然氣等燃料不完全燃燒以及吸煙、焚燒垃圾都會產(chǎn)生3，4 苯并芘，汽車尾氣也是主要來源。 食品加工過程也會產(chǎn)生3，4 苯并芘，尤其是煙熏、油炸、烘烤食品。 分析測定：用環(huán)己烷將3，4 苯并芘從試樣中提取出來，用堿將提取液的脂肪類物質(zhì)皂化，然后用色譜法分離純化，用95%C2H5OH稀釋，用熒光分光光度計測定相對熒光強度進行定量。,59,（三）磷光分析法應(yīng)用,能產(chǎn)生磷光的物質(zhì)數(shù)量很少，磷光分析不及熒光分析普遍，但磷光分析法已在藥物分析、臨床及環(huán)境分析領(lǐng)域得到一定的應(yīng)用。 低溫磷光分析已應(yīng)用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多環(huán)芳烴及含O、S、N的雜環(huán)化合物分析。 固體表面室溫磷光分析法已成為多環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物的快速、靈敏的分析手段。,60, 5-3化學(xué)發(fā)光分析法,一、概述 化學(xué)發(fā)光是利用化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的光輻射現(xiàn)象所建立的分析方法。 化學(xué)發(fā)光與熒光的主要區(qū)別：受激發(fā)時所需的能量來源不同 化學(xué)發(fā)光：需要化學(xué)反應(yīng)過程中所提供的化學(xué)能激發(fā)而發(fā)光 熒光：光源激發(fā)而發(fā)光,61,化學(xué)發(fā)光分析具有以下特點,靈敏度高例：用熒光素酶和三磷酸腺苷ATP的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可測定低至210-17 molL-1 ATP 線性范圍寬 一般有56個數(shù)量級 儀器設(shè)備簡單，成本低廉 分析速度快，易實現(xiàn)自動化 局限性：可供發(fā)光用的試劑有限 發(fā)光機理有待進一步研究,62,二、化學(xué)發(fā)光分析的基本原理,（一）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的基本條件 發(fā)光反應(yīng)必須滿足以下條件 1. 化學(xué)反應(yīng)必須產(chǎn)生足夠的化學(xué)能 化學(xué)發(fā)光基于化學(xué)反應(yīng)提供足夠的能量 A + B C* +D 產(chǎn)物接受反應(yīng)能被激發(fā) 在可見光區(qū)觀察化學(xué)發(fā)光，需170300kJmol-1激發(fā)能。具有過氧化物中間產(chǎn)物的氧化還原反應(yīng)可滿足要求?；瘜W(xué)反應(yīng)多是在有O3、H2O2等參加的高能反應(yīng)中。 2. 處于激發(fā)態(tài)分子能夠以輻射躍遷的方式返回基態(tài) C* C + h ,63,（二）化學(xué)發(fā)光效率和發(fā)光強度,化學(xué)發(fā)光效率CL,激發(fā)態(tài)分子的化學(xué)效率,激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率,r 取決于發(fā)光所依據(jù)的化學(xué)反應(yīng)本身 f 與熒光效率的影響因素相同，既取決于發(fā)光體本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，也受環(huán)境的影響。,64,化學(xué)發(fā)光強度,具有高效率的化學(xué)發(fā)光是生物體中。亦稱生物發(fā)光。如：螢火蟲發(fā)光反應(yīng)的效率幾乎接近100%。非生物體的化學(xué)發(fā)光效率一般不超過1% 化學(xué)發(fā)光強度 ICL（t）與反應(yīng)速度、化學(xué)發(fā)光效率有如下關(guān)系,ICL隨時間和反應(yīng)物的消耗逐漸減小,65,A + B C* +D A為待測物質(zhì)，C為發(fā)光物質(zhì)，當(dāng)反應(yīng)物B的濃度遠遠過量于待測物濃度時，B的濃度可認為是常數(shù)。因此，發(fā)光反應(yīng)可視為一級反應(yīng),t 時刻的發(fā)光強度與該時刻的分析物濃度成正比 化學(xué)發(fā)光總強度與分析物濃度呈線性關(guān)系。根據(jù)已知時間內(nèi)的發(fā)光總強度來定量分析。,發(fā)光總強度,66,三、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型,1. 液相化學(xué)發(fā)光 研究和應(yīng)用的比較廣泛的有魯米諾（Luminol）光澤精、沒食子酸、洛粉堿、過氧草酸鹽等。 魯米諾是最常用的發(fā)光試劑，它可以測定Cl2、I2、HOCl、OCl-、H2O2、O2和NO2，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)時量子效率為0.010.05。 魯米諾（3 氨基苯二甲酰環(huán)肼）在堿性溶液中和H2O2等氧化劑反應(yīng)生成最大波長為425 nm的光輻射。,67,氧化劑,425 nm,反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)能被產(chǎn)物氨基鄰苯