實(shí)驗(yàn)二鹼性磷酸酶的動(dòng)力學(xué)鑒定

實(shí)驗(yàn)二 鹼性磷酸酶的動(dòng)力學(xué)鑒定Km測(cè)定一、原理當(dāng)溫度、PH及酶濃度恒定的條件下，酶促反應(yīng)的初速度隨作用物濃度S增大而增大，但增大到一定限度時(shí)，作用物濃度再增加，則反應(yīng)速度不再增加。此時(shí)反應(yīng)速度為最大速度（Vmax）。Michaelis Menten對(duì)酶促反應(yīng)速度與作用物濃度之間的這種關(guān)系進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)研究，并于1913年提出了數(shù)學(xué)方程式，即著名的米一曼方程式：式中Km即為米氏常數(shù)，Vmax為最大反應(yīng)速度，當(dāng)V=Vmax/2時(shí)，則Km=S。Km是酶的特征常數(shù)，測(cè)定Km是研究酶的一種方法。由于用Michaeis-Menten方程中的V與S作圖求Km，不方便，Lineweaver-Burk將上式變形，以4/V對(duì)1/S作圖，即： 作圖后，將各點(diǎn)連線延長(zhǎng)，直線與橫軸的交點(diǎn)為 ，根據(jù)在橫軸上的截距，可以計(jì)算出該酶的Km。 本實(shí)驗(yàn)以鹼性磷酸酶為例，用磷酸苯二鈉為其作用物，鹼性磷酸酶能分解磷酸苯二鈉產(chǎn)生酚和磷酸，酚在鹼性溶液中與4氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色的醌衍生物，根據(jù)紅色深淺可測(cè)出酶活力高低。其反應(yīng)式如下： 利用在不同作用物濃度的條件下，測(cè)定的酶活性（A），按Lieweaver-Burk二氏法作圖，從x軸上的截距求得其Km值。 二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（一）儀器 1.恒溫水浴2.滴定管3.有塞錐瓶4.721型分光光度計(jì)（二）試劑1. 0.04mol/L作用物液： 稱取10.16g磷酸苯二鈉（C6H5PO4Na22H2O），用煮沸后冷卻的蒸溜水溶解，并稀釋至1,000ml，加4ml氯仿防腐，貯于棕色瓶?jī)?nèi)，置冰箱內(nèi)保存，可用一周。2. 0.1mol碳酸鹽緩沖液（pH10.0）： 稱取無(wú)水碳酸鈉6.36g及碳酸氫鈉3.36g，溶解于蒸餾水中，并稀釋至1,000ml.3. 鹼性磷酸酶液： 取純化的鹼性磷酸酶5mg，用pH10緩沖液配制成100ml，放置冰箱內(nèi)保存。或用自己提取的鹼性磷酸酶液，用pH10緩沖液稀釋至57倍。4. 0.5mol/L NaOH溶液5. 0.3%4氨基安替比林： 稱取3g4氨基安替比林及碳酸氫鈉42g，用蒸餾水溶解，并稀釋至1,000ml，貯于棕色瓶中，放冰箱內(nèi)保存。6. 0.5%鐵氰化鉀： 稱取10g鐵氰化鉀及30g硼酸各溶于800ml蒸餾水中，溶解后兩液混合加水至2,000ml。置棕色瓶中，放冰箱內(nèi)保存。三、操作1. 取大試管7支，按下表操作：加入酶液，混勻之后立即計(jì)時(shí)，各管在37水浴中準(zhǔn)確保溫15分鐘后，立即加入0.5Mol NaOH液1.0ml以終止反應(yīng)。2. 顯色 各管中加入0.3%4氨基安替比林1.0ml和0.5%鐵氰化鉀2.0ml，充分混勻，放置10分鐘，以0管為對(duì)照，在波長(zhǎng)510nm下比色，記錄各管的吸光度。3. 作圖 所策測(cè)各管的吸光度代表各管中反應(yīng)速度V，以之為縱軸，以作用物濃度S為橫軸，在坐標(biāo)紙上連接各點(diǎn)作圖，觀察曲線的形狀。以各管吸光度值的倒數(shù) 為縱坐標(biāo)，以作用物濃度的倒數(shù) 為橫坐標(biāo)，作圖并求此酶的Km值。注意：采用兔肝提取堿性磷酸酶來(lái)測(cè)定其Km時(shí)，一般可稀釋2-3倍，由于各實(shí)驗(yàn)室所用試劑等各種條件差異，酶活性可能有不同，所以在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)作調(diào)節(jié)，按本實(shí)驗(yàn)條件，用最高的作用物濃度管做實(shí)驗(yàn)，所得到的吸光度應(yīng)調(diào)節(jié)在0.8以下，如酶活性過(guò)大，在規(guī)定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)作用物分解過(guò)快，所測(cè)到的數(shù)值將與反應(yīng)初速度相差較遠(yuǎn)，則所測(cè)的Km不準(zhǔn)。如酶活性過(guò)低則受測(cè)定方法的靈敏度限制。如從第一管加入酶液開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔1分鐘向下一