外源化學(xué)物致突變作用.ppt

第七章 外源化學(xué)物致突變作用,案例3分析討論,鐮刀型細(xì)胞貧血是遺傳物質(zhì)DNA中血紅蛋白基因序列中一個(gè)CTT變成CAT，即發(fā)生基因顛換，血紅蛋白鏈中N端第六位氨基酸由Glu變?yōu)閂al，血紅蛋白分子發(fā)生遺傳缺陷，以至產(chǎn)生病變。這種疾病可以遺傳。 通過這個(gè)案例，一方面了解從堿基改變，到編碼產(chǎn)物的改變，再到表現(xiàn)型的改變最后到健康效應(yīng)的出現(xiàn)之間的因果關(guān)系。另一方面要認(rèn)識到基因突變的發(fā)生會引起嚴(yán)重的健康危害。,第四節(jié) 機(jī)體對致突變作用的影響,遺傳物質(zhì)在外源性因素的損傷仍能 代代相傳的原因：,DNA可執(zhí)行高保真度的復(fù)制，對復(fù)制中的錯(cuò)誤能及時(shí)修復(fù)，從而達(dá)到高度的保真。 細(xì)胞能夠通過對DNA損傷的修復(fù)而保護(hù)親代DNA鏈，使之避免由于內(nèi)、外各種因素的損傷而發(fā)生改變。,一、DNA損傷的修復(fù),（一）直接修復(fù)：依賴酶的作用。 光復(fù)活： 依賴光的過程，通過光裂合酶切下DNA上嘧啶二聚體，將毗連的嘧啶接回原結(jié)構(gòu)上?？梢酝耆迯?fù)紫外線誘發(fā)的嘧啶二聚體，使其在原位上恢復(fù)為單體。 “適應(yīng)性”反應(yīng)： 通過烷基轉(zhuǎn)移酶修復(fù)DNA烷化損傷，保護(hù)細(xì)胞免受烷化劑的毒性影響。,（二）堿基切除修復(fù),DNA糖基酶作用于受損的DNA，識別并切除損傷堿基，通過切斷堿基與脫氧核糖連接的鍵，使受損的堿基脫落，留下一個(gè)無嘌呤或無嘧啶的AP位點(diǎn)。AP內(nèi)切酶將DNA鏈切斷，由聚合酶和連接酶完成修復(fù)過程。 堿基切除修復(fù)是細(xì)胞對堿基氧化損傷的主要防御系統(tǒng)。,（三）核苷酸切除修復(fù) 使細(xì)胞具有從DNA上移除較大損傷。 所有生物體最常見的修復(fù)機(jī)制?；究梢孕迯?fù)所有種類的DNA損傷。 過程：內(nèi)切酶， 損傷識別；損傷兩側(cè)切除損傷鏈；切除寡聚核苷酸；修復(fù)合成填補(bǔ)產(chǎn)生的缺口；DNA連接酶封閉，恢復(fù)原有DNA序列。,（四）雙鏈斷裂修復(fù),未修復(fù)的雙鏈斷裂啟動(dòng)DNA損傷反應(yīng)系統(tǒng)，使細(xì)胞阻滯于周期的某一期或誘發(fā)細(xì)胞凋亡。 不是修復(fù)，是一種耐受過程，以容忍損傷繼續(xù)存在和高突變率情況來換取細(xì)胞繼續(xù)生存的耐受過程。,（五）交聯(lián)修復(fù)： 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生DNA鏈內(nèi)交聯(lián)，會造成雙鏈的斷裂，機(jī)體啟動(dòng)無誤交聯(lián)修復(fù)或易誤交聯(lián)修復(fù)。,小結(jié),修復(fù)的結(jié)果不全是有益的。 修復(fù)的途徑是多種。 修復(fù)與突變不可分。 損傷修復(fù)突變,二、遺傳因素對致突變作用的影響,（一）代謝酶遺傳多態(tài)性 1、氧化代謝酶 芳烴羥化酶：催化多環(huán)芳烴等致癌物活化。 2、酯酶 環(huán)氧水化酶：活化酶，參與苯并（a）比代謝為終致癌物。 3、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶 缺乏易患肺癌,（二）修復(fù)功能的個(gè)體差異,修復(fù)酶的多態(tài)性造成機(jī)體對損傷的反應(yīng)不一。 1、O6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶： 功能：恢復(fù)堿基的原有配對性。 缺乏或活性降低：腫瘤發(fā)生 2、聚（二磷酸腺苷核糖）多聚酶： 功能：氧化損傷的修復(fù)方式，對外來因素造成基因突變和腫瘤發(fā)生可產(chǎn)生抑制或促進(jìn)作用。,小 結(jié),遺傳因素是化學(xué)毒物的作用靶部位，是決定化學(xué)毒物毒作用性質(zhì)和強(qiáng)度的一個(gè)重要因素。 遺傳因素對致突變作用的影響的研究，是預(yù)防和治療腫瘤的新思路。,第五節(jié) 觀察外源化學(xué)物致突變作用的基本方法*,致突變試驗(yàn)的應(yīng)用,中國預(yù)防醫(yī)學(xué)博士張學(xué)明:煎炸魚中合有強(qiáng)致癌物雜環(huán)胺。 雜環(huán)胺的形成量主要受煎炸、烤的溫度影響，其次是煎烤時(shí)間。煎炸溫度小于200，雜環(huán)胺的形成量就很少；如果煎炸溫度超過200，煎炸時(shí)間少于2分鐘，雜環(huán)胺的形成量也很少；在煎炸的魚外面掛上一層淀粉糊再炸，也能預(yù)防雜環(huán)胺形成。 美國加州科研人員發(fā)現(xiàn)，高溫烹調(diào)或油炸的肉食中合有突變源，對經(jīng)過高溫烹調(diào)的牛肉、雞、魚等進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果測出10種致癌化合物，這次研究證實(shí)，突變源不是由于炭火等熱源將肉燒糊所致，而是肉食本身成分在加溫200以上時(shí)的產(chǎn)物。,檢測化學(xué)物的致突變性的目的：,鑒定生殖細(xì)胞和體細(xì)胞的致突變物； 預(yù)測潛在致癌物 環(huán)境致突變物的監(jiān)測與評價(jià)。,一. 觀察項(xiàng)目的選擇 （一）觀察的效應(yīng)終點(diǎn)類型 遺傳學(xué)終點(diǎn)(genetic endpoint )： 基因突變和染色體畸變的檢測可直接反映外源化學(xué)物的致突變性，是評價(jià)化學(xué)物致突變性唯一可靠的方法。有許多試驗(yàn)所觀察到的現(xiàn)象并不反映基因突變,染色體畸變和染色體分離異常,而僅反映致突變過程中發(fā)生的其他事件。因此，將試驗(yàn)觀察到的現(xiàn)象所反映的各種事件統(tǒng)稱為遺傳學(xué)終點(diǎn)。 包括：基因突變，染色體畸變，染色體組畸變，DNA原始損傷,（二）成套觀察項(xiàng)目 1.原則 選擇的遺傳毒性試驗(yàn)應(yīng)包括每一類型的遺傳學(xué)終點(diǎn)。 應(yīng)包括多種進(jìn)化程度不同的物種,如原核細(xì)胞,低等和高等真核細(xì)胞。 體內(nèi)試驗(yàn)與體外試驗(yàn)配合。,2. HIC(1997)對于藥品的遺傳毒性評價(jià)建議的實(shí)驗(yàn)組合為：,細(xì)菌基因突變試驗(yàn) 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)或體外小鼠淋巴瘤細(xì)胞tk試驗(yàn)； 體內(nèi)嚙齒類造血細(xì)胞染色體損傷試驗(yàn)； 對標(biāo)準(zhǔn)致突變實(shí)驗(yàn)組合的結(jié)果進(jìn)一步研究時(shí)，可以選擇其他一些實(shí)驗(yàn)，如DNA加合物測定、DNA鏈斷裂檢測、DNA修復(fù)實(shí)驗(yàn)等。,二、常用的致突變試驗(yàn) 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn) 微核試驗(yàn) 染色體畸變分析 姐妹染色單體交換試驗(yàn) 果蠅伴性隱性致死試驗(yàn) 顯性致死試驗(yàn) 程序外DNA合成試驗(yàn) 單細(xì)胞凝膠電泳,(一)細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)Ames試驗(yàn)*,是利用突變體的測試菌株，觀察受試物能否糾正或補(bǔ)償突變體所攜帶的突變改變，判斷其突變型。,常用的指示菌株：鼠傷寒沙門菌和大腸桿菌。,廣泛應(yīng)用鼠傷寒沙門菌突變試驗(yàn)。,(一)細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)Ames試驗(yàn)* 1. 原理： 是人工誘變的突變株在組氨酸操縱子中有一個(gè)突變，突變的菌株必需依賴外源性的組氨酸才能生長，而在無組氨酸的選擇性培養(yǎng)基上不能存活。致突變物可使其基因發(fā)生回復(fù)突變，使它在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上也能生長。計(jì)算誘發(fā)的回復(fù)菌落數(shù)即可判斷化學(xué)毒物的致突變性。,2. 常用菌株：鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型突變株為指示微生物。目前推薦使用 TA100 TA102 TA97 TA98 為增強(qiáng)對誘變物的敏感性加入一些附加突變：,試驗(yàn)中可供選用的測試菌株有多種，所攜帶的突變在不同的基因中，各有不同的特征，有的測定堿基置換，有的測定移碼突變，有的兩者都可測定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐涮走x擇。,(一)Ames試驗(yàn) 3. 方法： 點(diǎn)試法：用作定性試驗(yàn)，適用于短期大量篩選,平板摻入法：標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，用作定量測定,(二)微核試驗(yàn)(micronucleus test, MNT) 觀察受試物產(chǎn)生微核發(fā)生率或 有微核的細(xì)胞率為觀察指標(biāo)檢測 化學(xué)物染色體損害能力的試驗(yàn)， DNA斷裂劑，非整倍體誘變劑。 微核（micronucleus） ：染色體或染色單體的無著絲點(diǎn)斷片或因紡錘體受損傷而丟失的整個(gè)染色體，在細(xì)胞分裂的后期仍留在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，比主核小。,正常細(xì)胞、微核細(xì)胞,正常細(xì)胞、微核細(xì)胞和核異常細(xì)胞,指示正常細(xì)胞； 指示微核細(xì)胞； 指示核異常細(xì)胞 （2.5100）,骨髓多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn),大多數(shù)類型的細(xì)胞都可形成微核，但有核細(xì)胞的胞質(zhì)少，微核與正常核葉及核的突起難以鑒別。 常規(guī)：骨髓多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn) 多染紅細(xì)胞是成紅細(xì)胞發(fā)展為成熟紅細(xì)胞時(shí)，主核已排出，微核仍保留在細(xì)胞質(zhì)中，成為多染紅細(xì)胞（polychromatic erythrocytes PCE）,這些細(xì)胞保持其嗜堿性約24小時(shí)，然后成為正染紅細(xì)胞，并進(jìn)入外周血。 計(jì)數(shù)骨髓有微核多染紅細(xì)胞率可判斷受試物對骨髓細(xì)胞的染色體損傷作用。,骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)的不足,某些化學(xué)物在骨髓難以達(dá)到有效濃度。 骨髓中的SCE是動(dòng)態(tài)平衡，其不斷成熟為紅細(xì)胞，紅細(xì)胞又衰老死亡。 化學(xué)物毒物主要在肝臟活化，其活化中間產(chǎn)物可能在到達(dá)骨髓之前消失。 僅觀察體細(xì)胞其結(jié)果外推其他組織應(yīng)慎重。,微核實(shí)驗(yàn)進(jìn)展,體外微核試驗(yàn)：中國倉鼠肺細(xì)胞/中國倉鼠卵巢細(xì)胞/中國倉鼠成纖維細(xì)胞，易于操作和控制受試物濃度。 外周血微核實(shí)驗(yàn)：可能成為人群觀察化學(xué)毒物遺傳毒性的一種手段。 雙核細(xì)胞法：提高微核的靈敏度。 免疫熒光染色法、熒光原位雜交：靈敏度高，還可判斷來源（斷片還是染色體）。,(三)染色體畸變分析 chromosome aberration assay,觀察染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)目改變，又稱細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)。 觀察：用顯微鏡檢查細(xì)胞分裂中期相染色體畸變和染色體分離異常。 結(jié)果：裂隙，斷裂，斷片，微小體，染色體環(huán)等。,常染色體異常,Down syndrome (trisomy 21):先天愚型或唐氏綜合征,三體綜合征（13三體）：嚴(yán)重的眼，腦，循環(huán)系統(tǒng)缺陷以及腭裂。兒童生活很少超過幾個(gè)月。,(四)姐妹染色單體交換試驗(yàn)(sister-chromatid exchange,SCE) 指染色體同源座位上DNA復(fù)制產(chǎn)物的相互交換,其頻率與DNA斷裂和修復(fù)有關(guān)。檢測DNA損傷的靈敏指標(biāo)。,原理： 在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入5-溴脫氧尿嘧 啶（5-BrdU，嘧啶類似物），在 DNA合成期可與胸苷競爭摻入DNA 中，經(jīng)兩個(gè)分裂周期后，兩條染色 單體，其中一條DNA鏈的雙鏈內(nèi)T 被5-溴脫氧尿嘧啶核苷取代，另一 條只有一條鏈被取代。用染色劑處 理，使雙鏈含BrdU的染色單體著色 淺淡，單鏈含BrdU的染色單體著色 深。當(dāng)姐妹染色單體間發(fā)生同源片 段交換時(shí)，就可以根據(jù)每條染色單 體夾雜著深淺不一的著色片段加以 區(qū)分。,(五)果蠅伴性隱性致死試驗(yàn),原理 根據(jù)隱性基因在伴性遺傳中的交叉遺傳特征，即雄蠅的X染色體傳給F1代雌蠅。又通過F1代傳給F2代雄蠅。位于X染色體上的隱性基因能在半合子雄蠅中表現(xiàn)出來。據(jù)此推斷致死突變的存在。 結(jié)果： 能檢出點(diǎn)突變，小缺失，重排。,優(yōu)點(diǎn)：判斷突變終點(diǎn)客觀、不需活化。 不足：與哺乳動(dòng)物差異較大。,(六)顯性致死試驗(yàn) 1. 原理 對雄性動(dòng)物染毒，觀察一個(gè)精子發(fā)育周期中各個(gè)階段雌鼠出現(xiàn)受精卵在著床前死亡和胚胎早期死亡。 致突變物引起哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞染色體發(fā)生結(jié)構(gòu)和數(shù)目變化。 2.檢測整體哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞遺傳性（染色體畸變）損傷的方法。是評價(jià)化學(xué)毒物對雄性動(dòng)物的生殖細(xì)胞遺傳毒性較好的方法之一。,不足：靈敏度差，動(dòng)物數(shù)量大，一定的受孕率。,（七）程序外DNA合成試驗(yàn) (unschedule DNA synthesis， UDS),當(dāng)DNA受損傷時(shí)，損傷修復(fù)的DNA合成主要在S期以外的其他細(xì)胞周期，稱程序外DNA合成 *。 原理：觀察分離或培養(yǎng)的細(xì)胞，加入標(biāo)記DNA合成原料，如3H-胸苷，測定S期以外3H-胸苷摻入胞核的量，判斷受試物是否造成DNA損傷。因此發(fā)現(xiàn)UDS增高，即表明DNA發(fā)生過損傷。,39,(八)單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)(single cell gel electrophoresis，SCGE)（彗星試驗(yàn)(comet assay)）,一種快速檢測哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷的實(shí)驗(yàn)方法。 原理：DNA損傷后，斷裂的DNA片段比大片段DNA遷移的更快，電泳后出現(xiàn)彗星狀，即可判斷DNA損傷。,幾種遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)的哺乳動(dòng)物性細(xì)胞 致突變物篩檢可靠性評價(jià),試 驗(yàn) 靈敏性(%) 特異性(%) 準(zhǔn)確性() Ames試驗(yàn) 17/19 (89%) 3/10 (30%) 20/29 (69%) 骨髓細(xì)胞染色體畸 18/18 (100%) 2/10 (20%) 20/28 (71%) 變試驗(yàn)或微核試驗(yàn) 顯性致死試驗(yàn) 18/18 (100%) 8/10 (80%) 26/28 (93%),常用的遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)的特點(diǎn),（九）觀察方法的新進(jìn)展（自學(xué)） 1.轉(zhuǎn)基因小鼠致突變檢測系統(tǒng) 2.微核自動(dòng)化檢測技術(shù) 3.熒光原位雜交技術(shù),致突變試驗(yàn)的應(yīng)用實(shí)例如何設(shè)計(jì)？,分組（化合物） 選擇致突變實(shí)驗(yàn)組合 體外，體內(nèi) 觀察遺傳學(xué)終點(diǎn) 做出評價(jià),致突變實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用實(shí)例,致突變實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用實(shí)例空氣污染,家庭裝潢有害氣體致小鼠遺傳毒性實(shí)驗(yàn),三、致突變試驗(yàn)中的一些問題,（一）陰性和陽性對照的設(shè)立 陰性對照 為了獲取試驗(yàn)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。 陽性對照 證明試驗(yàn)方法的可靠；驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)者在本實(shí)驗(yàn)條件下，完成技術(shù)和鑒定致突變物的能力；證實(shí)經(jīng)一段時(shí)間后，本試驗(yàn)的重復(fù)性。,(二) 體外試驗(yàn)的活化系統(tǒng) 1哺乳動(dòng)物細(xì)胞介導(dǎo) 使用完整的細(xì)胞，特別是大鼠肝原代細(xì)胞，與測試細(xì)菌或細(xì)胞一起培養(yǎng)。 特點(diǎn)：這也是一種活化系統(tǒng)。它有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和各種酶及內(nèi)源性輔助因子，代謝能力優(yōu)于無細(xì)胞系統(tǒng)如S9。 不足：但不如體內(nèi)活化系統(tǒng)。,2S9 S9指經(jīng)酶誘導(dǎo)劑處理后制備的肝勻漿，再經(jīng)9000g離心分離所得上清液，加上適當(dāng)?shù)木彌_液和輔助因子。 特點(diǎn)：它主要含有混合功能氧化酶(MFO)，是國內(nèi)常規(guī)應(yīng)用于體外致突變試驗(yàn)的代謝活化系統(tǒng)。 缺點(diǎn)：S9隨實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬或器官不同而有差異；S9含有的大量親核物質(zhì)有可能影響試驗(yàn)的敏感性。,3純化酶和基因工程 純化酶：應(yīng)用純化細(xì)胞色素P-450、谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶及過氧化物水解酶，可嚴(yán)格控制代謝產(chǎn)物誘發(fā)突變的條件，但技術(shù)難度大。 基因工程：將人的細(xì)胞色素P-450基因，插入組合細(xì)胞內(nèi)，用上述細(xì)胞進(jìn)行致突變試驗(yàn)，使細(xì)胞具有代謝活化系統(tǒng)。 不足：不可能完全取代整體動(dòng)物代謝。,（三） 致突變試驗(yàn)與致癌試驗(yàn)的關(guān)系 已知致突變作用是致癌機(jī)制之一。 利用致突變試驗(yàn)預(yù)測致癌性時(shí)，應(yīng)該考慮敏感度與特異性。通過互補(bǔ)復(fù)合試驗(yàn)加以克服。 致突變試驗(yàn)僅可檢出遺傳毒性致癌物。,（四）試驗(yàn)結(jié)果在毒理學(xué)安全性評價(jià)中的作用,1. 實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制：盲法觀察； 陰性對照和陽性對照的設(shè)立；資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性。 2.陰性結(jié)果判定條件： 最高劑