安絡(luò)小皮傘液體深層發(fā)酵條件優(yōu)化的研究

吉林大學(xué)遠(yuǎn)程教育本 科 生 畢 業(yè) 論 文 （ 設(shè) 計(jì) ）中文題目 安絡(luò)小皮傘液體深層發(fā)酵條件優(yōu)化的研究學(xué) 生 姓 路 園 園 專 業(yè) 藥 學(xué) 層 次 年 級(jí) _1409 學(xué) 號(hào) 201409960544 指 導(dǎo) 教 師 張 新 茹 職 稱 講 師 _學(xué) 習(xí) 中 心 高 邑 奧 鵬 學(xué) 習(xí) 中 心 成 績(jī) 2016 年 9 月 18 日摘要安絡(luò)小皮傘菌是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用真菌，不僅在藥用方面有很好的功效，在食用和保健方面有很高的價(jià)值，因此，對(duì)小皮傘菌液體深層發(fā)酵研究具有重要的意義和價(jià)值。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)小皮傘菌發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：以提高安絡(luò)小皮傘菌生物量為目的，對(duì)小皮傘菌培養(yǎng)基及其發(fā)酵條件進(jìn)行系統(tǒng)的優(yōu)化。對(duì) C 源和 N 源種類進(jìn)行篩選，在此基礎(chǔ)上對(duì)其濃度進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)小皮傘菌培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，最終確立了最優(yōu)培養(yǎng)基為玉米粉：3 %、麩皮： 3 %、Mg SO4：0.1 %、KH 2PO4：0.3 %、VB 1：10 mg、水：1000 m L；通過(guò)對(duì)小皮傘菌液體發(fā)酵時(shí)間、溫度、轉(zhuǎn)速及其培養(yǎng)基的初始 p H、接種量、裝液量進(jìn)行篩選，確立了最適發(fā)酵條件為:發(fā)酵時(shí)間：6 d、溫度：25 、轉(zhuǎn)速：150 r/min、初始 p H：5、接種量：9 %、裝液量：90 m L。 關(guān)鍵詞：安絡(luò)小皮傘菌，發(fā)酵條件，培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件目錄摘要 .I ABSTRACT . III1 前言 . 11.1 安絡(luò)小皮傘的概述介紹 . 11.1.1 安絡(luò)小皮傘簡(jiǎn)介 . 11.1.2 安絡(luò)小皮傘的形態(tài)特征 . 21.1.3 安絡(luò)小皮傘的生態(tài)習(xí)性5 . 31.1.4 安絡(luò)小皮的主要成分 . 41.2 安絡(luò)小皮傘液體深層發(fā)酵技術(shù) . 41.3 安絡(luò)小皮傘的藥用價(jià)值 . 51.3.1 抗氧化作用 . 51.3.2 增強(qiáng)免疫的作用 . 51.3.3 抗腫瘤作用 . 51.3.4 鎮(zhèn)痛作用 . 61.4 立題的依據(jù)及意義 . 71.5 本研究的主要內(nèi)容 . 81.5.1 安絡(luò)小皮傘發(fā)酵條件的優(yōu)化 . 82 安絡(luò)小皮傘液體發(fā)酵條件的優(yōu)化 . 92.1 材料和試劑 . 92.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種 . 92.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 . 92.1.3 儀器設(shè)備 . 92.1.4 培養(yǎng)基 . 102.2 實(shí)驗(yàn)方法 . 102.2.1 菌種復(fù)壯 . 102.2.2 菌種培養(yǎng) . 102.2.3 生物量的檢測(cè) . 102.2.4 培養(yǎng)基的優(yōu)化 . 112.2.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 . 122.3 結(jié)果與分析 . 132.3.1 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 . 132.3.2 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果 . 142.3.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果 . 162.4 討論 . 203 結(jié)論與展望. 393.1 結(jié)論 . 39 3.2 展望. 40參考文獻(xiàn). 43致謝 . 471 前言1.1 安絡(luò)小皮傘的概述介紹1.1.1 安絡(luò)小皮傘簡(jiǎn)介安絡(luò)小皮傘學(xué)名為 Marasmius androsaceus 是一種生長(zhǎng)于密林中的真菌，因?yàn)槠溆泻谏苌尼槧罹?，所以又稱其為鬼毛針，茶褐小皮傘等，屬于擔(dān)子菌綱、傘菌目(Agaricales)、白蘑科(Thicho Lomataceae)、小皮傘屬(Marasmius)1，如圖 1-1。安絡(luò)小皮傘始載于新華本草綱要 ，性溫，微苦，歸肝經(jīng)。具有消炎、止痛的功能。主要分布于我國(guó)吉林、遼寧、湖南、湖北、廣東等省 2。我國(guó)民間早有用野生安絡(luò)小皮傘的根狀菌索來(lái)治療骨折疼痛、跌打損傷等?，F(xiàn)在臨床和市場(chǎng)上用小皮傘菌制成的藥物有很多，主要的有“安絡(luò)痛” （其制劑分為膠囊和注射液兩種） 、 “安絡(luò)痛酊” 、 “安絡(luò)解痛片”等 3-4。小皮傘菌含有水溶性多糖等成分，具有一定的抗氧化作用，其內(nèi)含有的皮傘堿具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜作用，此外，安絡(luò)小皮傘中含有多種氨基酸，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值，經(jīng)研究其主要表現(xiàn)在能促進(jìn)神經(jīng)組織和纖維結(jié)締組織的炎癥消失，改善局部的血流循環(huán)和組織營(yíng)養(yǎng)狀況，恢復(fù)神經(jīng)功能 5。隨著安絡(luò)小皮傘菌液體發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用和對(duì)安絡(luò)小皮傘菌營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥理作用的研究，安絡(luò)小皮傘菌的大量生產(chǎn)和深入探究安絡(luò)小皮傘菌所具有的更多藥理特性，使其在藥品制劑、功能食品、保健品等方面得到廣泛的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，具有良好的市場(chǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。圖 1-1 野生安絡(luò)小皮傘菌1.1.2 安絡(luò)小皮傘的形態(tài)特征 安絡(luò)小皮傘子實(shí)體小群生或散生，長(zhǎng)在基物上或根狀菌索上。其菌蓋呈半球狀，直徑約為 0.5cm2cm，菌蓋的上面有溝條，其中間部位呈臍狀。安絡(luò)小皮傘的膜質(zhì)中間厚邊緣薄，堅(jiān)韌而光滑，但是比較干燥，它的顏色為紅褐色或茶褐色，從中間到兩邊顏色逐漸變淺。菌褶比較稀疏，有長(zhǎng)有短，顏色為白色，直生至離生。菌柄中生 3-5cm，長(zhǎng)在基物上的柄長(zhǎng)，長(zhǎng)在菌索上的柄短，粗 1 毫米或稍粗，細(xì)針狀，黑褐色或稍淺，平滑，彎曲，中空軟骨質(zhì)。菌索特別發(fā)達(dá)，脆骨質(zhì)，呈黑褐色至黑色，頂部色淺為淡黃色，光滑無(wú)毛，直徑0.5mm1mm，如果環(huán)境和溫度比較適合，菌索可達(dá) 150cm 以上，形狀非常像細(xì)鐵絲或馬鬃毛，有的分支有的不分枝。孢子無(wú)色無(wú)臭味，呈長(zhǎng)方橢圓形，光滑，6m9m3m4.5 m 6。（1）菌絲安絡(luò)小皮傘的菌絲為白色，呈絲狀，顯微鏡下觀察為無(wú)色，有內(nèi)含物，有橫隔，有分枝，寬 2.5-3m，斜面培養(yǎng)比深層培養(yǎng)的菌絲可以觀察到更多鎖狀聯(lián)合。在斜面培養(yǎng)和平板培養(yǎng)時(shí)，菌絲容易出現(xiàn)老化現(xiàn)象，菌苔從白色變成棕褐色，最后變成黑色。（2）菌球搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，接種后，菌絲萌發(fā)伸長(zhǎng)和分枝，然后縱橫交錯(cuò)，相互纏繞而形成菌球。剛開(kāi)始形成的菌球，菌絲交織疏松， “毛刺”比較長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌絲和菌球纏繞的越來(lái)越緊密， “毛刺”變短，形成球形或者近球形，直徑大多在 3-5mm，也有小至 1mm 大至 14mm 的，菌球的大小受接種量、培養(yǎng)基成分和搖床轉(zhuǎn)速影響很大，接種量大菌球大且少，液體培養(yǎng)基中沉淀或粉狀物質(zhì)太多，菌球的數(shù)量會(huì)多小，搖床轉(zhuǎn)速越快，菌球多而且小，若轉(zhuǎn)速太快則形成不定型的菌絲體，不能形成菌球。菌球有空心和實(shí)心兩種，表明具有短絨毛或放射狀的“毛刺” 7。1.1.3 安絡(luò)小皮傘的生態(tài)習(xí)性小皮傘菌生長(zhǎng)于深山密林，陰涼潮濕，近水，酸性土上面的枯枝、腐木、落葉、竹林枯木或竹枝上，產(chǎn)生根狀菌索的時(shí)間為每年的 5 月10 月（林下溫度約為 1528） ，產(chǎn)生子實(shí)體以 6 月8 月較多，溫度以 2226為佳。子實(shí)體和跟狀菌索的形成和生長(zhǎng)發(fā)育皆需要很高的濕度，特別是空氣濕度需要飽和或接近飽和，往往是在下雨時(shí)或剛下雨后形成，并在此條件下繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育?？諝鉂穸忍?，子實(shí)體和根狀菌索不能形成，已形成的也會(huì)停止生長(zhǎng)，當(dāng)空氣濕度飽和時(shí)，又會(huì)恢復(fù)生長(zhǎng)或菌索會(huì)產(chǎn)生分枝。如果長(zhǎng)期處在低濕度空氣條件下，小皮傘菌生長(zhǎng)受阻，容易污染霉菌?？諝鈼l件差的情況下，子實(shí)體和菌索也易被雜菌污染。在完全黑暗的地方，菌絲體可以生長(zhǎng)，但不能形成子實(shí)體和菌索。當(dāng)菌索和子實(shí)體形成以后，長(zhǎng)期黑暗，其生長(zhǎng)也會(huì)受到抑制，斷續(xù)的光照，生長(zhǎng)不受影響。子實(shí)體形成適宜的光照強(qiáng)度為 10-20 萬(wàn) lx 即可以滿足。 小皮傘菌是一種腐生菌，但其根狀菌索在生長(zhǎng)過(guò)程中如果遇到合適的活體植物，便會(huì)在植物上長(zhǎng)出白色的菌絲，生長(zhǎng)一段時(shí)間后會(huì)變成褐色，菌索會(huì)攀援植物的莖、枝或葉向上生長(zhǎng)。若纏繞活植物的菌索較多，會(huì)引起植物的病變或死亡。 小皮傘菌生長(zhǎng)時(shí)如果某種原因致使其根狀菌索斷裂，它可以在斷裂處從新長(zhǎng)出白色菌絲一段時(shí)間后，菌絲由白色變成褐色，長(zhǎng)出新的菌索，繼續(xù)生長(zhǎng)。菌索與菌索相遇可以彼此相連長(zhǎng)出菌絲。采收期 6-10 月為宜，由于皮傘菌易吸濕發(fā)霉，所以樣品采集后烘干保存?zhèn)溆谩?1.1.4 安絡(luò)小皮的主要成分安絡(luò)小皮傘中含有多種成分 8，有多糖、氨基酸、腺苷、甘露醇、膽甾醇醋酸酯、伴半萜內(nèi)酯、有機(jī)酸、異香豆素、三十碳酸、2,3,5,6-四氯-1,4- 二甲氧基苯、B 谷甾醇棕櫚酸酯、 5,8-過(guò)氧麥角甾醇、B 谷甾醇、麥角甾醇、總生物堿等。有鎮(zhèn)痛作用的成分為三十碳酸、2,3,5,6- 四氯-1,4- 二甲氧基苯、伴半萜內(nèi)酯和麥角甾醇。 1.2 安絡(luò)小皮傘液體深層發(fā)酵技術(shù)液體深層發(fā)酵技術(shù)屬于現(xiàn)代生物技術(shù)之一，該項(xiàng)技術(shù)的權(quán)威是美國(guó)弗吉尼亞大學(xué)生物工程專家 Elmer L、Gaden Jr，其在 20 世紀(jì) 40 年代設(shè)計(jì)出生物反應(yīng)器用來(lái)培養(yǎng)微生物系統(tǒng)。液體發(fā)酵技術(shù)是指在生化反應(yīng)器中，模擬菌株在自然界中的生活環(huán)境，將其生長(zhǎng)所必需的糖類、氮元素化合物、無(wú)機(jī)鹽和微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)溶解在水中配制成菌株培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基，滅菌后進(jìn)行接種，控制適宜的溫度、轉(zhuǎn)速、通氧等外界條件對(duì)菌進(jìn)行大量培養(yǎng)繁殖的過(guò)程。第一次應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)的是美國(guó)的 H. Humfeld，對(duì)蘑菇進(jìn)行液體發(fā)酵并得到蘑菇菌絲體。 J. Szuecs 首次將發(fā)酵罐用于液體發(fā)酵技術(shù)，1958 年培養(yǎng)出羊肚菌。國(guó)內(nèi)對(duì)液體深層發(fā)酵較早的報(bào)道是 1960 年上海植物生理研究所陳美聿等人對(duì)香菇的液體發(fā)酵培養(yǎng)。林忠平等人在 1973 年對(duì)靈芝進(jìn)行深層發(fā)酵的研究。80 年代后，隨著此項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外對(duì)液體深層發(fā)酵技術(shù)紛紛展開(kāi)了研究與探討 9。安絡(luò)小皮傘是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用真菌，其液體深層發(fā)酵技術(shù)發(fā)展的比較早，已有成型的培養(yǎng)方案，但是應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的研究比較少。最早成功大規(guī)模生產(chǎn)安絡(luò)小皮傘菌的研究是廣州微生物所與廣州第一制藥廠聯(lián)合研制安絡(luò)痛。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖 3 %，玉米漿 0.5 %，酵母膏 0.2 %，Mg SO4 0.05 %，KH 2PO4 0.1 %，消沫油 0.1 %，p H 6.5。培養(yǎng)條件為：接種量 1.5 %-2 %，溫度 24-26 。通氣培養(yǎng)時(shí)間 4-5 d，通氣量每分鐘 1：1-1 ：1.5(v/v)；罐壓0.3-0.5 kg/cm2。制作安絡(luò)痛，此條件下培養(yǎng)得到的安絡(luò)小皮傘可滿足需求。李雪梅在安絡(luò)小皮傘菌液體發(fā)酵過(guò)程中還原糖與菌絲體干重、p H 值及產(chǎn)量的關(guān)系的研究中得到了在發(fā)酵過(guò)程中，隨著總糖的消耗，還原糖的含量逐漸降低，且與 p H 值的變化呈正相關(guān)，與菌絲體干重及產(chǎn)量的增加呈負(fù)相關(guān)，為安絡(luò)小皮傘發(fā)酵的生產(chǎn)提供了重要的理論依據(jù) 10。1.3 安絡(luò)小皮傘的藥用價(jià)值1.3.1 抗氧化作用王曦 11等人用醇沉法對(duì)安絡(luò)小皮傘菌絲體粗多糖進(jìn)行分級(jí)沉淀，其分級(jí)產(chǎn)物對(duì)OH 和O 2-都有很強(qiáng)的清除作用。分級(jí)產(chǎn)物對(duì)羥基自由基的清除能力隨著乙醇加入倍數(shù)的增大而增強(qiáng)，當(dāng)加入 4 倍體積乙醇時(shí)，對(duì)其清除率可達(dá)到 49.72 %此時(shí)產(chǎn)物濃度為 0.4 mg/m L，說(shuō)明安絡(luò)小皮傘多糖對(duì)OH 有很強(qiáng)的清除作用。不同乙醇體積的分級(jí)產(chǎn)物對(duì)O 2-清除能力不同，當(dāng)乙醇等量與溶液體積時(shí)，得到產(chǎn)物對(duì)O 2-的清除率最大可達(dá) 42.22 %。梁?jiǎn)?