偽狂犬病毒EPO基因的原核表達及其單克隆抗體的制備

偽狂犬病毒EPO基因的原核表達及其單克隆抗體的制備一、引言偽狂犬病（Pseudorabies,PR）是由偽狂犬病毒（Pseudorabiesvirus,PRV）引起的多種家畜和野生動物的一種急性傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。EPO基因是PRV的重要基因之一，對其功能及相關應用的研究具有重要意義。本研究旨在通過原核表達系統(tǒng)表達PRVEPO基因，并制備其單克隆抗體，為深入研究PRV的致病機制以及開發(fā)相關診斷試劑和疫苗奠定基礎。二、材料與方法（一）材料病毒與菌株：偽狂犬病毒毒株、大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞。載體：pET-32a(+)表達載體。工具酶及試劑：限制性內切酶、T4DNA連接酶、DNAMarker、蛋白Marker、IPTG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、PEG1500等。實驗動物：6-8周齡Balb/c小鼠。（二）方法PRVEPO基因的克隆提取PRV的基因組DNA，根據(jù)GenBank中公布的EPO基因序列設計特異性引物，引物兩端分別引入合適的限制性內切酶酶切位點。以PRV基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃終延伸10min。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段。重組表達載體的構建將回收的EPO基因片段和pET-32a(+)表達載體分別用相應的限制性內切酶進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收。用T4DNA連接酶將酶切后的EPO基因片段與pET-32a(+)表達載體連接，連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。挑取陽性克隆進行菌落PCR鑒定及雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質粒送往測序公司測序。PRVEPO基因的原核表達將測序正確的重組質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，按1:100的比例轉接至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值約為0.6時，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，誘導表達4h。收集誘導后的菌液，進行SDS分析，觀察目的蛋白的表達情況。表達產(chǎn)物的純化將誘導表達后的菌液離心收集菌體，用PBS重懸后超聲破碎。離心取上清，采用鎳離子親和層析柱對上清中的目的蛋白進行純化，收集洗脫峰，進行SDS分析，鑒定純化效果。單克隆抗體的制備動物免疫：將純化后的EPO蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后，皮下多點注射Balb/c小鼠，每只小鼠注射100μg蛋白。首次免疫后，間隔2周用相同劑量的蛋白與弗氏不完全佐劑乳化后進行加強免疫，共免疫3次。末次免疫后3天，取小鼠血清進行ELISA檢測，篩選抗體效價高的小鼠。細胞融合：取抗體效價高的小鼠脾臟，制備脾細胞懸液。將脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按5:1的比例混合，加入PEG1500進行融合。融合后細胞用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選出雜交瘤細胞。雜交瘤細胞的篩選與克隆化：采用間接ELISA方法對雜交瘤細胞進行篩選，選取陽性雜交瘤細胞進行有限稀釋法克隆化，直至獲得能穩(wěn)定分泌抗EPO單克隆抗體的雜交瘤細胞株。單克隆抗體的制備與鑒定：將篩選得到的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)，注入Balb/c小鼠腹腔，7-10天后收集腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化腹水，得到單克隆抗體。對單克隆抗體進行效價測定、特異性鑒定及亞型鑒定。三、結果（一）PRVEPO基因的克隆PCR擴增得到約[X]bp的特異性條帶，與預期的EPO基因大小一致，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示條帶清晰，無雜帶。（二）重組表達載體的構建菌落PCR及雙酶切鑒定結果表明，重組質粒構建成功。測序結果顯示，插入的EPO基因序列與GenBank中公布的序列一致，無堿基突變。（三）PRVEPO基因的原核表達SDS分析結果顯示，在誘導后的菌液中出現(xiàn)了一條約[X]kDa的特異性條帶，與預期的融合蛋白大小一致，表明PRVEPO基因在大腸桿菌中成功表達。（四）表達產(chǎn)物的純化經(jīng)鎳離子親和層析柱純化后，SDS分析顯示洗脫峰中目的蛋白純度較高，雜蛋白明顯減少。（五）單克隆抗體的制備動物免疫：經(jīng)ELISA檢測，免疫后的小鼠血清抗體效價均達到1:10000以上，表明免疫效果良好。細胞融合：融合后經(jīng)HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得了多個雜交瘤細胞克隆。雜交瘤細胞的篩選與克隆化：通過間接ELISA篩選及有限稀釋法克隆化，成功獲得了3株能穩(wěn)定分泌抗EPO單克隆抗體的雜交瘤細胞株。單克隆抗體的制備與鑒定：制備的單克隆抗體腹水效價可達1:100000以上，特異性鑒定結果表明該單克隆抗體只與EPO蛋白發(fā)生特異性反應，與其他無關蛋白無交叉反應。亞型鑒定結果顯示，3株單克隆抗體均為IgG1亞型。四、討論本研究成功克隆了PRVEPO基因，并構建了原核表達載體，實現(xiàn)了該基因在大腸桿菌中的高效表達。通過對表達產(chǎn)物的純化，獲得了高純度的EPO蛋白，為后續(xù)單克隆抗體制備提供了優(yōu)質的抗原。在單克隆抗體制備過程中，通過優(yōu)化免疫方案、細胞融合條件及篩選方法，成功獲得了能穩(wěn)定分泌抗EPO單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并制備出了高效價、高特異性的單克隆抗體。這些單克隆抗體將為深入研究PRVEPO基因的功能、PRV的致病機制以及開發(fā)相關診斷試劑和疫苗提供有力的工具。然而，本研究也存在一些不足之處，例如原核表達的蛋白可能存在折疊不正確等問題，影響其生物學活性。在后續(xù)研究中，可以嘗試采用真核表達系統(tǒng)進行EPO基因的表達，以獲得更接近天然狀態(tài)的蛋白。此外，還