熒光定量PCR技術(shù)簡介劉偉11課件

熒光定量PCR技術(shù)簡介主講：劉偉

—1—概念一檢測模式二應(yīng)用三

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一概念多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)1985年，Kary.B.Mullis教授發(fā)明了具有劃時代意義的PCR技術(shù)。1993年，Kary.B.Mullis因該技術(shù)的發(fā)明而獲得諾貝爾化學獎。

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循環(huán)次數(shù)DNA的鏈數(shù)

1

2122

2243

23810

210102420

220

1,048,57630

230

1,073,741,82410億

PCR特點：高效擴增、忠實復制PCR技術(shù)原理

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缺憾無法對初始模板精確定量無法實時監(jiān)測擴增情況跑膠繁瑣、易污染常規(guī)PCR電泳鑒定

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熒光定量PCR

在體系中引入熒光染料實時檢測擴增階段：指數(shù)期平臺期

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熒光定量PCR定義

是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。目的

對起始模板進行定量優(yōu)點

靈敏，重復性，動態(tài)范圍寬，高通量

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普通PCR實時熒光定量PCR開管操作、需要后處理、易造成污染，假陽性率高。閉管操作、無需后處理、避免了污染，防止假陽性。PCR結(jié)束后，對終點產(chǎn)物進行分析，不能定量，重復性差。實時監(jiān)測PCR擴增，在指數(shù)擴增期對起始模板進行定量，重復性好。人工分析結(jié)果，操作復雜，存在誤差。儀器自動分析，操作簡單，增加了靈敏度和客觀性。

熒光定量PCR與普通PCR的區(qū)別

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1.SYBRGreenI2.Taqman水解探針3.分子信標二檢測模式

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熒光定量PCR檢測模式染料標記：

SYBRGreenI探針標記：水解探針：

TaqMan非水解探針：Molecularbeacon

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1.SYBRGreenISYBRGreenI

是一種與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料。SYBRGreenI只與雙鏈DNA結(jié)合才能發(fā)出熒光。熒光信號與雙鏈DNA分子數(shù)成正比，隨著擴增產(chǎn)物增加而增加。

熒光信號強度與反應(yīng)體系中所有雙鏈DNA分子成正比。

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5’3’5’3’SGSGSGSG5’3’5’3’SGSGSGSGEmissionExcitation--變性時，DNA雙鏈分開，無熒光信號。--延伸結(jié)束時，采集熒光信號。

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優(yōu)點：

使用方便，成本低--僅需設(shè)計兩個引物通用性好--對DNA模板沒有選擇性需要在反應(yīng)結(jié)束時，對產(chǎn)物做融解曲線分析。缺點：SYBRGreen與所有雙鏈DNA結(jié)合--引物二聚體或錯誤擴增產(chǎn)物造成假陽性--只能檢測單一模板，無法進行多重檢測

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探針與靶序列配對（一段序列，兩個基團，5’報告基團、3’淬滅基團）完整的探針，報告基團R發(fā)射的熒光被淬滅基團Q淬滅，沒有熒光產(chǎn)生。聚合酶的5’外切酶活性報告基團R與淬滅基團Q分離，發(fā)射熒光。RQReporterQuencherRQ熒光信號強度與結(jié)合探針的DNA分子成正比。2.Taqman水解探針

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在退火過程中，探針與靶序列結(jié)合探針被Taq酶的5’-3’外切酶活性剪切成片斷游離報告基團發(fā)出熒光在延伸過程中，探針部分與靶序列分離

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Taqman特異性高--與特異靶序列結(jié)合對模板有選擇性--可進行多重PCR反應(yīng)

SYBRGreenI使用方便，成本低--僅需設(shè)計兩個引物通用性好--對DNA模板沒有選擇性

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熒光信號強度與結(jié)合探針的DNA分子成正比。標記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標序列互補莖由互補配對序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑發(fā)夾型雜交探針

3.分子信標

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模板不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光基團和淬滅基團緊緊靠近而被淬滅。當存在模板時，環(huán)序列將與模板配對，此時分子信標成鏈狀而非莖環(huán)狀，熒光基團與淬滅劑分開，使得熒光基團發(fā)出熒光。

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高特異性：對目標序列檢測SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu)點

只能用于一個特定目標設(shè)計困難價格比較高缺點

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醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用科學研究方面的應(yīng)用公安系統(tǒng)內(nèi)的應(yīng)用動植物檢疫考古學方面的應(yīng)用三應(yīng)用

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醫(yī)療方面的部分應(yīng)用遺傳病診斷：等位基因檢測多基因遺傳病的突變檢測基因表達異常所致遺傳病檢測

腫瘤診斷：腫瘤相關(guān)基因表達的檢測：包括癌基因抗癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移基因及轉(zhuǎn)移抑制基因腫瘤標志物如癌胚抗原、同功酶、抗體、激素、細胞因子、受體等腫瘤耐藥基因（MDR）

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研究方面的部分應(yīng)用分子生物學方面：研究各種處理對細胞mRNA含量變化的影響比較染病組織與正常組織中各種mRNA含量差異DNA或RNA的轉(zhuǎn)染量與實驗結(jié)果關(guān)系的研究植物學方面：轉(zhuǎn)基因植物中基因拷貝數(shù)與性狀的關(guān)系監(jiān)測轉(zhuǎn)基因