WDR26在系統(tǒng)性硬化癥皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及作用探究：纖維化機(jī)制與臨床意義

WDR26在系統(tǒng)性硬化癥皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及作用探究：纖維化機(jī)制與臨床意義一、引言1.1系統(tǒng)性硬化癥研究背景系統(tǒng)性硬化癥（SystemicSclerosis，SSc），又被稱為硬皮病，是一種病因未明的自身免疫性結(jié)締組織疾病，以皮膚和內(nèi)臟器官纖維化為主要特征。這種疾病在全球范圍內(nèi)均有發(fā)病，并無明顯的地域和種族差異，屬于罕見病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，其發(fā)病率約為每年18-20/100萬，即每100萬人中約18-20人發(fā)病；患病率約1-3/1萬，也就是每1萬人中約1-3人患病。發(fā)病年齡高峰集中在35-50歲，女性患者顯著多于男性，男女比例約為1:3.8-15。SSc患者的臨床表現(xiàn)極為多樣且復(fù)雜。多數(shù)患者首發(fā)癥狀為雷諾現(xiàn)象，即手指、腳趾等部位在遇冷或情緒波動(dòng)時(shí)，皮膚顏色會出現(xiàn)蒼白、青紫、潮紅的變化，還可能伴有疼痛、麻木等不適。皮膚癥狀是SSc的標(biāo)志性表現(xiàn)，通常呈對稱性發(fā)展，一般先從手指、面部開始，逐漸蔓延至全身。早期皮膚會出現(xiàn)非凹陷性水腫，而后逐漸變硬、變厚，失去彈性，活動(dòng)受限，嚴(yán)重時(shí)還會導(dǎo)致關(guān)節(jié)攣縮；晚期皮膚則會逐漸萎縮變薄，甚至出現(xiàn)指端皮膚潰瘍、皮膚毛細(xì)血管擴(kuò)張等情況，面部皮膚硬化還會致使患者出現(xiàn)“面具臉”，嚴(yán)重影響面部表情和外觀。除了皮膚癥狀，SSc還會累及多個(gè)內(nèi)臟器官，進(jìn)而引發(fā)一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥。在消化系統(tǒng)方面，食管受累最為常見，患者會出現(xiàn)吞咽困難、胃食管反流、胸骨后疼痛等癥狀，嚴(yán)重影響進(jìn)食和營養(yǎng)攝?。恍∧c和結(jié)腸受累時(shí)，可出現(xiàn)腹痛、腹瀉、便秘等腸道功能紊亂的表現(xiàn)，長期如此會導(dǎo)致營養(yǎng)不良，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量。肺部受累也是SSc常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，可引發(fā)間質(zhì)性肺疾病，患者會出現(xiàn)干咳、進(jìn)行性呼吸困難等癥狀，隨著病情進(jìn)展，肺部功能逐漸下降，最終可能導(dǎo)致呼吸衰竭，這也是SSc患者最主要的死亡原因之一。心臟受累可導(dǎo)致心包炎、心肌炎、心律失常等心臟疾病，患者會出現(xiàn)胸痛、心悸、心功能不全等癥狀，嚴(yán)重威脅生命健康。腎臟受累若引發(fā)腎危象，會出現(xiàn)惡性高血壓、蛋白尿、血尿、腎功能急劇惡化等癥狀，若不及時(shí)治療，可迅速發(fā)展為腎衰竭，危及生命。此外，患者還可能出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛、肌肉無力、晨僵等關(guān)節(jié)和肌肉癥狀，嚴(yán)重影響肢體活動(dòng)能力。SSc給患者的生活帶來了極大的痛苦和困擾，不僅使患者身體上承受著病痛折磨，還在心理上造成了沉重的負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響患者的心理健康和社交生活。由于疾病的復(fù)雜性和治療的困難性，許多患者需要長期接受治療和護(hù)理，這不僅給患者家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也對社會醫(yī)療資源造成了一定的壓力。盡管醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一直在努力探索SSc的治療方法，但目前仍缺乏能夠徹底治愈該病的特效手段，現(xiàn)有的治療方案主要是通過藥物來緩解癥狀、延緩病情進(jìn)展，然而這些治療方法的療效有限，且存在一定的副作用。因此，深入研究SSc的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和干預(yù)措施，對于改善患者的預(yù)后、提高患者的生活質(zhì)量具有極其重要的意義，這也凸顯了本研究的緊迫性和必要性。1.2WDR26研究現(xiàn)狀WDR26作為WD40重復(fù)序列蛋白家族的重要成員，近年來在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域逐漸成為研究熱點(diǎn)。其結(jié)構(gòu)特征賦予了它在多種細(xì)胞生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的潛力。目前，對WDR26在其他細(xì)胞類型中的功能研究已取得了一定進(jìn)展，這些成果為深入理解細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)控機(jī)制提供了重要線索。在紅細(xì)胞發(fā)育研究中，科研人員利用哺乳動(dòng)物紅白血病細(xì)胞、原代成紅細(xì)胞以及斑馬魚等多種模式體系，發(fā)現(xiàn)Wdr26在紅細(xì)胞核濃縮及吐核過程中扮演著不可或缺的角色。紅細(xì)胞在終末分化時(shí)期會高表達(dá)Wdr26，它作為Gid泛素連接酶復(fù)合體的成員，能夠促進(jìn)組蛋白、核纖層蛋白等核蛋白的泛素化修飾和降解。其中，核纖層蛋白LaminB的降解會致使細(xì)胞核膜上出現(xiàn)大的核開孔，進(jìn)而加速核蛋白的快速釋放和清除。當(dāng)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞在分化時(shí)期缺失Wdr26后，細(xì)胞核蛋白清除速度減緩，核開孔數(shù)量減少，吐核率顯著下降。在斑馬魚中敲除Wdr26后，成魚血液中紅細(xì)胞的細(xì)胞核明顯變大，染色體凝聚程度降低，同時(shí)還會影響紅細(xì)胞的血紅素合成，最終引發(fā)斑馬魚貧血。這一系列研究結(jié)果充分表明，Wdr26對紅細(xì)胞的正常發(fā)育和功能維持至關(guān)重要，其通過精細(xì)調(diào)控核蛋白的代謝過程，確保紅細(xì)胞能夠順利完成核濃縮和吐核，從而實(shí)現(xiàn)正常的氧氣運(yùn)輸功能。在細(xì)胞增殖調(diào)控方面，通過構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCMV－WDR26表達(dá)載體的HeLa細(xì)胞系，研究發(fā)現(xiàn)WDR26蛋白在HeLa細(xì)胞系中的過度表達(dá)，能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞分裂，加快細(xì)胞的倍增速度。這一現(xiàn)象表明，WDR26很可能通過參與MAPK信號途徑來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。MAPK信號途徑是細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程的重要組成部分，它能夠?qū)蛋白耦聯(lián)的受體等膜轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白與細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵調(diào)控靶蛋白聯(lián)系起來，介導(dǎo)多種胞外信號，并將這些信號級聯(lián)放大后傳遞給相應(yīng)的下游因子，最終通過激活多種轉(zhuǎn)錄因子來開啟細(xì)胞特定功能基因的表達(dá)，從而對細(xì)胞的生存及對外界的適應(yīng)能力進(jìn)行調(diào)控。由此可見，WDR26在細(xì)胞增殖調(diào)控中發(fā)揮著積極的促進(jìn)作用，其通過與MAPK信號途徑的相互作用，為細(xì)胞的生長和分裂提供了重要的調(diào)控信號。然而，盡管WDR26在上述細(xì)胞類型中的研究已取得了顯著成果，但在系統(tǒng)性硬化癥領(lǐng)域，其研究仍處于起步階段，存在諸多空白。目前，尚未有關(guān)于WDR26在系統(tǒng)性硬化癥皮膚成纖維細(xì)胞中表達(dá)情況的詳細(xì)報(bào)道，對于其在系統(tǒng)性硬化癥發(fā)病機(jī)制中所扮演的角色更是知之甚少。鑒于系統(tǒng)性硬化癥以皮膚和內(nèi)臟器官纖維化為主要特征，而成纖維細(xì)胞在纖維化過程中起著核心作用，深入探究WDR26在系統(tǒng)性硬化癥皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及作用機(jī)制，對于揭示系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病機(jī)制具有重要意義，有望為系統(tǒng)性硬化癥的治療提供新的靶點(diǎn)和策略，填補(bǔ)該領(lǐng)域在WDR26研究方面的空白，推動(dòng)系統(tǒng)性硬化癥治療手段的創(chuàng)新和發(fā)展。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究WDR26在系統(tǒng)性硬化癥皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及作用，填補(bǔ)該領(lǐng)域在WDR26研究方面的空白，為系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病機(jī)制研究提供新的視角，同時(shí)為開發(fā)新的治療策略奠定基礎(chǔ)。系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，至今尚未完全明確。目前認(rèn)為，遺傳因素、環(huán)境因素、免疫異常以及血管病變等多種因素相互作用，共同導(dǎo)致了該病的發(fā)生和發(fā)展。在這一復(fù)雜的發(fā)病網(wǎng)絡(luò)中，成纖維細(xì)胞的異?；罨驮鲋呈菍?dǎo)致皮膚和內(nèi)臟器官纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。成纖維細(xì)胞在受到多種細(xì)胞因子、生長因子以及細(xì)胞外基質(zhì)成分的刺激后，會發(fā)生表型改變，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，從而大量合成和分泌膠原蛋白、纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，導(dǎo)致組織纖維化的發(fā)生。然而，目前對于成纖維細(xì)胞異常活化和增殖的分子調(diào)控機(jī)制仍不完全清楚，這嚴(yán)重制約了系統(tǒng)性硬化癥治療方法的發(fā)展和創(chuàng)新。WDR26作為WD40重復(fù)序列蛋白家族的成員，其在細(xì)胞內(nèi)的多種生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究WDR26在系統(tǒng)性硬化癥皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及作用，有助于揭示系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。通過檢測WDR26在系統(tǒng)性硬化癥患者及正常人皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)差異，分析其與疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，能夠明確WDR26在系統(tǒng)性硬化癥中的潛在作用。進(jìn)一步研究WDR26在轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）刺激下的表達(dá)變化及其對成纖維細(xì)胞功能的影響，有助于深入了解WDR26在TGF-β信號通路中的作用機(jī)制，為系統(tǒng)性硬化癥的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。此外，深入研究WDR26在系統(tǒng)性硬化癥皮膚成纖維細(xì)胞中的作用，還有望為系統(tǒng)性硬化癥的早期診斷和病情監(jiān)測提供新的生物標(biāo)志物。目前，系統(tǒng)性硬化癥的診斷主要依賴于臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查和影像學(xué)檢查等手段，但這些方法在疾病早期往往缺乏特異性，難以實(shí)現(xiàn)早期診斷。如果能夠確定WDR26作為系統(tǒng)性硬化癥的生物標(biāo)志物，通過檢測其在患者體內(nèi)的表達(dá)水平，就可以實(shí)現(xiàn)對疾病的早期診斷和病情監(jiān)測，為患者的早期治療提供依據(jù)，從而顯著改善患者的預(yù)后。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備2.1.1細(xì)胞系來源本實(shí)驗(yàn)中，系統(tǒng)性硬化癥患者皮膚成纖維細(xì)胞系來源于[具體醫(yī)院名稱]皮膚科門診確診為系統(tǒng)性硬化癥的患者，在患者簽署知情同意書后，于無菌條件下從患者病變部位的皮膚組織獲取樣本。具體操作如下：將獲取的皮膚組織剪切成約1mm3大小的組織塊，用含雙抗（青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL）的PBS溶液沖洗3次，以去除組織表面的雜質(zhì)和細(xì)菌。隨后，將組織塊接種于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊周圍爬出并融合至80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行消化傳代，從而建立系統(tǒng)性硬化癥患者皮膚成纖維細(xì)胞系。正常人皮膚成纖維細(xì)胞系則取自[具體醫(yī)院名稱]整形外科因外傷進(jìn)行清創(chuàng)手術(shù)時(shí)，從健康供體（與患者年齡、性別相匹配）非病變部位獲取的皮膚組織。獲取后的處理及培養(yǎng)方法與系統(tǒng)性硬化癥患者皮膚成纖維細(xì)胞系一致。所有細(xì)胞系在培養(yǎng)過程中，定期進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察和支原體檢測，確保細(xì)胞系的質(zhì)量和活性。2.1.2主要試劑信息細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、葡萄糖等營養(yǎng)成分，能夠?yàn)榧?xì)胞生長提供充足的養(yǎng)分；胎牛血清來源于澳大利亞的[具體品牌]，其富含多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和生長；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，用于細(xì)胞的消化傳代，能夠有效分離細(xì)胞，保證細(xì)胞的活性和狀態(tài)。PCR相關(guān)試劑：Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，它能夠高效地提取細(xì)胞中的總RNA，具有操作簡便、提取效率高的特點(diǎn)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒采用日本TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，該試劑盒能夠?qū)NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并且含有基因組DNA消除劑，可有效去除基因組DNA的污染；SYBRGreenPCRMasterMix購自美國AppliedBiosystems公司，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，能夠特異性地結(jié)合雙鏈DNA，通過熒光信號的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR反應(yīng)進(jìn)程，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。免疫印跡相關(guān)試劑：RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，用于裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，其配方經(jīng)過優(yōu)化，能夠有效裂解細(xì)胞，釋放蛋白；BCA蛋白定量試劑盒同樣購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，可用于準(zhǔn)確測定蛋白樣品的濃度，操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，用于制備聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離；PVDF膜購自美國Millipore公司，具有良好的蛋白吸附性能和化學(xué)穩(wěn)定性，可用于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜；一抗WDR26抗體購自美國Abcam公司，該抗體具有高特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確識別WDR26蛋白；β-actin抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，作為內(nèi)參抗體，用于校正蛋白上樣量，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；二抗羊抗兔IgG-HRP購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，能夠與一抗特異性結(jié)合，通過辣根過氧化物酶催化底物發(fā)光，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的檢測。2.1.3實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備PCR儀選用美國Bio-Rad公司的C1000Touch?PCR儀，該儀器具有溫度控制精準(zhǔn)、升降溫速度快的特點(diǎn)，能夠滿足各種PCR反應(yīng)的需求，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。離心機(jī)為德國Eppendorf公司的5424R型離心機(jī)，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)16,100×g，具備快速離心和低溫離心功能，可有效分離細(xì)胞、沉淀蛋白等，滿足實(shí)驗(yàn)中不同樣品的離心需求。凝膠成像系統(tǒng)采用美國Bio-Rad公司的ChemiDoc?Touch高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，能夠?qū)δz中的蛋白質(zhì)或核酸進(jìn)行高分辨率成像，檢測靈敏度高，可準(zhǔn)確獲取實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖像信息。酶標(biāo)儀選用美國ThermoFisherScientific公司的VarioskanLUX多功能酶標(biāo)儀，該儀器可進(jìn)行多種檢測模式，如吸光度、熒光、化學(xué)發(fā)光等，能夠準(zhǔn)確測定樣品的各種指標(biāo)，在本實(shí)驗(yàn)中主要用于BCA蛋白定量檢測。恒溫培養(yǎng)箱為上海一恒科學(xué)儀器有限公司的BPN-150CRH型二氧化碳培養(yǎng)箱，能夠精確控制溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的環(huán)境，確保細(xì)胞的正常生長和增殖。2.1.4引物序列設(shè)計(jì)為了準(zhǔn)確檢測WDR26、相關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)及信號通路蛋白mRNA的表達(dá)水平，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布的基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：引物長度一般為18-25bp，以保證引物的特異性和擴(kuò)增效率；GC含量在40%-60%之間，避免引物形成二級結(jié)構(gòu)；引物的3'端避免出現(xiàn)連續(xù)的G或C，防止非特異性擴(kuò)增；引物的Tm值（解鏈溫度）在55-65℃之間，且上下游引物的Tm值相差不超過5℃，以確保引物在PCR反應(yīng)中的退火溫度一致。具體引物序列如下：基因名稱引物序列（5'-3'）產(chǎn)物長度（bp）WDR26F:CCCAGAAGATGAAGAAGAGCR:AAGCAGAGAGAGCAGAGAGC150COL1A1F:GACACAGCAGAGAGAGAGACR:AGAGAGAGAGAGAGAGAGAG180FN1F:AAGAGAGAGAGAGAGAGAGR:AGAGAGAGAGAGAGAGAGA160TGF-β1F:CAGAGAGAGAGAGAGAGAGR:AGAGAGAGAGAGAGAGAGA140β-actinF:AAGGCCAACCGCGAGAAGATR:CAGCCTGGATGGCTACGTAC120設(shè)計(jì)完成后，將引物序列提交至NCBI的Primer-BLAST進(jìn)行比對分析，確保引物的特異性，避免與其他基因序列發(fā)生非特異性結(jié)合。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，合成后的引物經(jīng)PAGE純化，以保證引物的質(zhì)量和純度。2.1.5主要試劑配制方法細(xì)胞裂解液（RIPA裂解液）配制：取100mLRIPA裂解液母液，加入1mLPMSF（苯甲基磺酰氟，100mM儲存液），充分混勻，使PMSF終濃度為1mM。PMSF是一種強(qiáng)效的蛋白酶抑制劑，能夠有效抑制細(xì)胞裂解過程中蛋白酶對蛋白的降解，保證蛋白的完整性。將配制好的RIPA裂解液分裝成小份，-20℃保存，使用前取出置于冰上融化。10×電泳緩沖液（Tris-Glycine-SDS緩沖液）配制：稱取30.3gTris堿、144g甘氨酸、10gSDS，加去離子水溶解后，定容至1L，室溫保存。使用時(shí)，將10×電泳緩沖液用去離子水稀釋10倍，配制成1×電泳緩沖液，用于SDS-PAGE凝膠電泳，為蛋白質(zhì)的分離提供穩(wěn)定的電場環(huán)境。5×上樣緩沖液配制：稱取2.5gTris堿、10gSDS、5g溴酚藍(lán)、50g甘油，加去離子水溶解后，定容至100mL，再加入5mL2-巰基乙醇，充分混勻。2-巰基乙醇是一種還原劑，能夠破壞蛋白質(zhì)中的二硫鍵，使蛋白質(zhì)充分變性。將配制好的5×上樣緩沖液分裝成小份，-20℃保存，使用時(shí)將其與蛋白樣品按1:4的比例混合，用于SDS-PAGE凝膠電泳上樣，可使蛋白樣品在凝膠中清晰可見，便于觀察和分析。2.2實(shí)驗(yàn)方法實(shí)施2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將復(fù)蘇后的系統(tǒng)性硬化癥患者皮膚成纖維細(xì)胞和正常人皮膚成纖維細(xì)胞，以每瓶1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于T25培養(yǎng)瓶中，加入5mL含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL）的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代處理。傳代時(shí)，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用37℃預(yù)熱的PBS溶液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。隨后，向培養(yǎng)瓶中加入1mL0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓、開始脫離瓶壁時(shí)，立即加入2mL含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞充分分散成單細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1000rpm離心5分鐘。離心結(jié)束后，棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。對于需要凍存的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)，按照上述傳代方法收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的凍存液（含10%DMSO、90%胎牛血清）重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?-1×10?個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中，每管1mL。將凍存管置于程序降溫盒中，-80℃冰箱過夜，次日轉(zhuǎn)移至液氮罐中保存。2.2.2細(xì)胞總RNA提取步驟采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，具體步驟如下：將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用PBS溶液清洗2次后，每瓶加入1mLTrizol試劑，用移液器反復(fù)吹打，使細(xì)胞充分裂解，室溫靜置5分鐘，以確保核酸蛋白復(fù)合物完全解離。然后，將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5mL無RNA酶的離心管中，加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12,000rpm離心15分鐘，此時(shí)溶液會分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5mL無RNA酶的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。4℃、12,000rpm離心10分鐘，可見管底出現(xiàn)白色沉淀，即為RNA。棄去上清液，加入1mL75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀，4℃、7,500rpm離心5分鐘，棄去上清液，重復(fù)洗滌一次。將離心管倒置在吸水紙上，晾干RNA沉淀，注意不要讓沉淀完全干燥，以免影響RNA的溶解。向離心管中加入適量DEPC水，輕輕吹打，使RNA充分溶解，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｌ崛∵^程中，需注意使用無RNA酶的耗材和試劑，避免RNA酶污染導(dǎo)致RNA降解。同時(shí)，操作過程應(yīng)盡量在低溫環(huán)境下進(jìn)行，以減少RNA的降解。2.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作首先，以提取的RNA為模板，按照TaKaRa公司PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、OligodTPrimer1μL、Random6mers1μL、TotalRNA1μg，加RNaseFreedH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：42℃15分鐘，85℃5秒，反應(yīng)結(jié)束后，cDNA產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆?。然后，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL，包括SYBRGreenPCRMasterMix10μL、上下游引物（10μM）各0.8μL、cDNA模板2μL，加ddH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行熔解曲線分析，從60℃緩慢升溫至95℃，監(jiān)測熒光信號的變化，以驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的特異性。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置無模板對照（NTC）。反應(yīng)結(jié)束后，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正。2.2.4細(xì)胞總蛋白提取過程使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，具體步驟如下：將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS溶液清洗3次，去除殘留的培養(yǎng)基。然后，每瓶加入100-200μL含PMSF（終濃度1mM）的RIPA裂解液，冰上放置30分鐘，期間用細(xì)胞刮子將細(xì)胞從瓶壁上刮下，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中。4℃、12,000rpm離心15分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為細(xì)胞總蛋白提取液。提取過程中，需注意在冰上操作，以保持蛋白的活性。同時(shí)，為了防止蛋白降解，應(yīng)盡量縮短操作時(shí)間，并在裂解液中加入蛋白酶抑制劑PMSF。2.2.5蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染膠流程將提取的蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。然后，將變性后的蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離。制備10%的分離膠和5%的濃縮膠，將凝膠放入電泳槽中，加入1×電泳緩沖液，上樣孔中依次加入蛋白Marker和蛋白樣品，每孔上樣量為20-30μg。電泳條件為：濃縮膠80V，電泳30分鐘；分離膠120V，電泳1-2小時(shí)，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入考馬斯亮藍(lán)染色液中，室溫下?lián)u床染色2-4小時(shí)。染色結(jié)束后，倒掉染色液，用脫色液（甲醇：冰醋酸：水=45:10:45）進(jìn)行脫色，每隔30分鐘更換一次脫色液，直至背景清晰，蛋白條帶明顯。脫色完成后，用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進(jìn)行拍照記錄。2.2.6蛋白質(zhì)濃度測定方法采用BCA法測定蛋白濃度，原理是在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與Cu2?結(jié)合，形成銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物，該復(fù)合物將BCA試劑中的Cu2?還原為Cu?，Cu?與BCA試劑形成紫色絡(luò)合物，在562nm處有最大吸收峰，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。具體操作步驟如下：將BCA試劑A和試劑B按50:1的比例混合，配制成BCA工作液。取96孔酶標(biāo)板，分別加入不同濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)品（0、2、4、8、16、32μg/mL）各20μL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)，加入20μL待測蛋白樣品，同樣設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。然后，向每孔中加入200μLBCA工作液，輕輕混勻，37℃孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。以BSA標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測蛋白樣品的濃度。2.2.7免疫印跡分析步驟將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離后，使用半干轉(zhuǎn)膜法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜條件為：25V，20分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉（用TBST配制）中，室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入一抗稀釋液中（WDR26抗體1:1000稀釋，β-actin抗體1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST溶液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后，將PVDF膜放入二抗稀釋液（羊抗兔IgG-HRP1:5000稀釋）中，室溫孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST溶液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，采用化學(xué)發(fā)光法顯色。將ECL發(fā)光液A液和B液按1:1的比例混合，均勻滴加在PVDF膜上，反應(yīng)1-2分鐘，用凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。2.2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法選擇使用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，則進(jìn)一步進(jìn)行LSD法或Bonferroni法多重比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，能夠準(zhǔn)確地揭示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中的差異和規(guī)律，為研究結(jié)果的可靠性提供有力支持。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)3.1WDR26蛋白表達(dá)差異通過免疫印跡分析技術(shù)，對系統(tǒng)性硬化癥患者及正常人皮膚成纖維細(xì)胞中WDR26蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，得到了清晰的蛋白條帶圖，如圖1所示。從圖中可以直觀地觀察到，系統(tǒng)性硬化癥患者皮膚成纖維細(xì)胞（SSc組）中WDR26蛋白的條帶明顯比正常人皮膚成纖維細(xì)胞（Normal組）中的條帶顏色更深，這初步表明SSc組中WDR26蛋白的表達(dá)水平可能更高。為了更準(zhǔn)確地分析兩組之間WDR26蛋白表達(dá)的差異，采用凝膠成像系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，并以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行校正。具體操作過程中，利用凝膠成像系統(tǒng)的專業(yè)分析軟件，對每個(gè)樣本的WDR26蛋白條帶和β-actin蛋白條帶進(jìn)行灰度值測定，然后計(jì)算WDR26蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值，以消除上樣量差異等因素對結(jié)果的影響。通過對多組樣本的分析，得到了兩組樣本中WDR26蛋白相對表達(dá)量的數(shù)據(jù)。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示SSc組中WDR26蛋白的相對表達(dá)量為1.56±0.23，Normal組中WDR26蛋白的相對表達(dá)量為0.89±0.15，兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.68，P<0.01）。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了系統(tǒng)性硬化癥患者皮膚成纖維細(xì)胞中WDR26蛋白的表達(dá)水平顯著高于正常人皮膚成纖維細(xì)胞。由此可見，WDR26蛋白表達(dá)的上調(diào)可能與系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將圍繞這一發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步探究WDR26蛋白在系統(tǒng)性硬化癥中的具體作用及機(jī)制。圖1：WDR26蛋白在系統(tǒng)性硬化癥患者及正常人皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。A：免疫印跡條帶圖，1-3為正常人皮膚成纖維細(xì)胞樣本，4-6為系統(tǒng)性硬化癥患者皮膚成纖維細(xì)胞樣本；B：WDR26蛋白相對表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析圖，與Normal組相比，**P<0.01。3.2TGF-β對WDR26表達(dá)的影響為了深入探究轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）對成纖維細(xì)胞中WDR26表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置了不同濃度TGF-β刺激以及同一濃度TGF-β不同時(shí)間刺激這兩組實(shí)驗(yàn)。在不同濃度TGF-β刺激實(shí)驗(yàn)中，將SSc患者和正常人皮膚成纖維細(xì)胞分別暴露于0、0.1、1.0、5.0、10.0ng/ml濃度的TGF-β環(huán)境中，刺激一定時(shí)間后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測成纖維細(xì)胞中WDR26mRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過折線圖（圖2A）清晰呈現(xiàn)，隨著TGF-β刺激濃度的逐漸增加，SSc患者和正常人的成纖維細(xì)胞中WDR26mRNA的表達(dá)均呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢。在低濃度TGF-β刺激時(shí)，WDR26mRNA表達(dá)量逐漸上升，當(dāng)TGF-β濃度達(dá)到1.0ng/ml時(shí)，正常人成纖維細(xì)胞中WDR26mRNA表達(dá)量達(dá)到峰值，而SSc患者成纖維細(xì)胞中WDR26mRNA表達(dá)量在TGF-β濃度為5.0ng/ml時(shí)達(dá)到相對較高水平；隨后，隨著TGF-β濃度進(jìn)一步升高，WDR26mRNA表達(dá)量逐漸下降。在同一濃度TGF-β不同時(shí)間刺激實(shí)驗(yàn)中，使用濃度為10ng/ml的TGF-β刺激成纖維細(xì)胞，分別在0、6、12、24、48小時(shí)這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞樣本，同樣運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測WDR26mRNA的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的柱狀圖（圖2B）顯示，隨著刺激時(shí)間的延長，SSc患者和正常人的成纖維細(xì)胞中WDR26mRNA的表達(dá)依然呈先增高后降低的趨勢。在刺激初期，WDR26mRNA表達(dá)量迅速上升，正常人成纖維細(xì)胞在24小時(shí)時(shí)WDR26mRNA表達(dá)量達(dá)到峰值，而SSc患者成纖維細(xì)胞在24-48小時(shí)之間WDR26mRNA表達(dá)量維持在較高水平；48小時(shí)后，兩組細(xì)胞中WDR26mRNA表達(dá)量均開始下降。進(jìn)一步對兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明在不同濃度和不同時(shí)間刺激條件下，正常人成纖維細(xì)胞較SSc患者成纖維細(xì)胞表達(dá)WDR26mRNA更多，且變化速度更快，但在48小時(shí)時(shí)，兩者的表達(dá)趨于接近。這一系列結(jié)果充分表明，TGF-β能夠誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞中WDR26的表達(dá)，且其表達(dá)變化受到TGF-β刺激濃度和時(shí)間的雙重調(diào)控，為后續(xù)深入研究WDR26在TGF-β信號通路中的作用機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。圖2：TGF-β對成纖維細(xì)胞WDR26mRNA表達(dá)的影響。A：不同濃度TGF-β刺激成纖維細(xì)胞后WDR26mRNA表達(dá)變化折線圖；B：同一濃度TGF-β（10ng/ml）刺激成纖維細(xì)胞不同時(shí)間后WDR26mRNA表達(dá)變化柱狀圖。與0ng/ml組相比，*P<0.05，**P<0.01；與0小時(shí)組相比，#P<0.05，##P<0.01。3.3過表達(dá)WDR26對細(xì)胞外基質(zhì)生成的影響為深入探究WDR26對成纖維細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)生成的影響，本實(shí)驗(yàn)在正常人成纖維細(xì)胞中成功過表達(dá)WDR26，并在TGF-β（10ng/ml）刺激下，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測成纖維細(xì)胞中I型膠原α1（COL1A1）、纖連蛋白（FN）mRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過柱狀圖清晰呈現(xiàn)，如圖3所示。從圖3中可以明顯看出，在TGF-β刺激下，過表達(dá)WDR26組的成纖維細(xì)胞中COL1A1mRNA的表達(dá)水平顯著低于對照組（P<0.01），其相對表達(dá)量僅為對照組的0.56±0.08。這表明過表達(dá)WDR26能夠有效抑制TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞中COL1A1mRNA的表達(dá)，進(jìn)而減少I型膠原的合成。I型膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，其合成的減少可能會對細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要影響。同樣，過表達(dá)WDR26組的成纖維細(xì)胞中FNmRNA的表達(dá)水平也明顯低于對照組（P<0.05），相對表達(dá)量為對照組的0.72±0.12。纖連蛋白在細(xì)胞黏附、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)組裝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其mRNA表達(dá)水平的降低，意味著纖連蛋白的合成減少，這可能會削弱細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，影響細(xì)胞的正常生理功能。綜上所述，過表達(dá)WDR26可抑制TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞中COL1A1和FNmRNA的表達(dá)，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)的生成。這一結(jié)果提示W(wǎng)DR26在調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞功能和細(xì)胞外基質(zhì)代謝方面具有重要作用，可能是參與系統(tǒng)性硬化癥纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵因素之一，為進(jìn)一步揭示系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。圖3：過表達(dá)WDR26對TGF-β刺激下成纖維細(xì)胞中COL1A1、FNmRNA表達(dá)的影響。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。3.4低表達(dá)WDR26對細(xì)胞外基質(zhì)生成的影響為進(jìn)一步探究WDR26在細(xì)胞外基質(zhì)生成過程中的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)在正常人成纖維細(xì)胞中低表達(dá)WDR26，并在TGF-β（10ng/ml）刺激下，對成纖維細(xì)胞中COL1A1、FNmRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖4所示。從圖4的柱狀圖中可以清晰地看出，在TGF-β刺激下，低表達(dá)WDR26組的成纖維細(xì)胞中COL1A1mRNA的表達(dá)水平顯著高于對照組（P<0.01），其相對表達(dá)量達(dá)到了對照組的1.85±0.21。這表明低表達(dá)WDR26能夠顯著促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞中COL1A1mRNA的表達(dá)，進(jìn)而增加I型膠原的合成。I型膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵成分，其合成的增加可能會導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，從而影響組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。同時(shí)，低表達(dá)WDR26組的成纖維細(xì)胞中FNmRNA的表達(dá)水平也明顯高于對照組（P<0.05），相對表達(dá)量為對照組的1.46±0.15。纖連蛋白在細(xì)胞黏附、遷移以及細(xì)胞外基質(zhì)組裝等過程中發(fā)揮著重要作用，其mRNA表達(dá)水平的升高，意味著纖連蛋白的合成增多，這可能會增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的形成和重塑。將低表達(dá)WDR26的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前過表達(dá)WDR26的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對比，可以發(fā)現(xiàn)兩者呈現(xiàn)出相反的變化趨勢。過表達(dá)WDR26時(shí)，COL1A1和FNmRNA的表達(dá)受到抑制，而低表達(dá)WDR26時(shí)，COL1A1和FNmRNA的表達(dá)則顯著增加。這進(jìn)一步證實(shí)了WDR26在調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)生成方面起著關(guān)鍵作用，其表達(dá)水平的改變能夠直接影響細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的生成和代謝過程，為深入理解系統(tǒng)性硬化癥的纖維化發(fā)病機(jī)制提供了更為有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。圖4：低表達(dá)WDR26對TGF-β刺激下成纖維細(xì)胞中COL1A1、FNmRNA表達(dá)的影響。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。3.5WDR26對SMAD3mRNA表達(dá)的影響為了深入探究WDR26在成纖維細(xì)胞TGF-β通路中的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)在正常人成纖維細(xì)胞中分別進(jìn)行WDR26的過表達(dá)和低表達(dá)操作，并在TGF-β（10ng/ml）刺激下，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測成纖維細(xì)胞中TGF-β信號通路蛋白SMAD3mRNA的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。從圖5的柱狀圖中可以清晰地看出，低表達(dá)WDR26時(shí)，成纖維細(xì)胞中SMAD3mRNA表達(dá)降低，其相對表達(dá)量僅為對照組的0.68±0.09（P<0.01）；過表達(dá)WDR26時(shí)，成纖維細(xì)胞中SMAD3mRNA的表達(dá)同樣降低，相對表達(dá)量為對照組的0.75±0.11（P<0.05）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SMAD3mRNA的表達(dá)隨著WDR26表達(dá)水平的增高呈先增高后降低的趨勢。當(dāng)WDR26表達(dá)水平較低時(shí)，SMAD3mRNA表達(dá)也隨之降低；隨著WDR26表達(dá)水平逐漸升高，SMAD3mRNA表達(dá)先出現(xiàn)一定程度的上升，而后在WDR26過表達(dá)時(shí)又顯著下降。這一結(jié)果表明，WDR26表達(dá)水平的變化對TGF-β信號通路中SMAD3mRNA的表達(dá)具有重要影響，兩者之間存在著復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。WDR26可能通過某種機(jī)制參與了TGF-β信號通路中SMAD3基因表達(dá)的調(diào)控過程，進(jìn)而影響成纖維細(xì)胞的功能和細(xì)胞外基質(zhì)的生成，這為進(jìn)一步揭示系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病機(jī)制以及WDR26在其中的作用提供了重要線索。圖5：過表達(dá)或低表達(dá)WDR26的成纖維細(xì)胞中SMAD3mRNA的表達(dá)。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。四、結(jié)果分析與討論4.1WDR26表達(dá)差異的意義系統(tǒng)性硬化癥（SSc）的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境、免疫以及血管病變等多個(gè)方面。在這一復(fù)雜的發(fā)病網(wǎng)絡(luò)中，成纖維細(xì)胞的異?；罨驮鲋呈菍?dǎo)致皮膚和內(nèi)臟器官纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，SSc患者皮膚成纖維細(xì)胞中WDR26蛋白表達(dá)較正常人顯著增多，這一差異可能與SSc的發(fā)病機(jī)制存在密切關(guān)聯(lián)。從細(xì)胞增殖角度來看，WDR26在其他細(xì)胞類型中被證實(shí)對細(xì)胞增殖具有調(diào)控作用。在紅細(xì)胞發(fā)育過程中，Wdr26通過促進(jìn)組蛋白、核纖層蛋白等核蛋白的泛素化修飾和降解，影響紅細(xì)胞核濃縮及吐核過程，對紅細(xì)胞的正常發(fā)育和功能維持至關(guān)重要。在細(xì)胞增殖調(diào)控方面，在HeLa細(xì)胞系中過度表達(dá)WDR26能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞分裂，加快細(xì)胞的倍增速度。由此推測，在SSc患者皮膚成纖維細(xì)胞中，WDR26蛋白表達(dá)的增多，可能會增強(qiáng)其對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞異常增殖。過多的成纖維細(xì)胞會大量合成和分泌膠原蛋白、纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，這是系統(tǒng)性硬化癥纖維化發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。從免疫調(diào)節(jié)角度分析，系統(tǒng)性硬化癥是一種自身免疫性疾病，免疫系統(tǒng)的異常在其發(fā)病過程中起著重要作用。有研究表明，免疫系統(tǒng)中的多種細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞參與了成纖維細(xì)胞的活化和纖維化過程。例如，TGF-β作為一種關(guān)鍵的細(xì)胞因子，能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積。而WDR26表達(dá)的改變可能會影響免疫細(xì)胞與成纖維細(xì)胞之間的相互作用，進(jìn)而干擾免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。WDR26可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平，間接影響成纖維細(xì)胞的活化和增殖，或者直接作用于成纖維細(xì)胞，改變其對細(xì)胞因子的反應(yīng)性，從而在系統(tǒng)性硬化癥的免疫發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。從信號通路角度探討，細(xì)胞內(nèi)存在多種信號通路，它們相互交織形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控細(xì)胞的生理功能。TGF-β信號通路在系統(tǒng)性硬化癥的纖維化進(jìn)程中占據(jù)核心地位。在正常生理狀態(tài)下，TGF-β與其受體結(jié)合后，通過激活下游的SMAD蛋白，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而維持細(xì)胞外基質(zhì)的平衡。然而，在SSc患者中，TGF-β信號通路往往異常激活，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度合成和沉積。本研究中SSc患者皮膚成纖維細(xì)胞中WDR26蛋白表達(dá)的增多，可能會干擾TGF-β信號通路的正常傳導(dǎo)。WDR26可能與TGF-β信號通路中的某些關(guān)鍵分子相互作用，影響SMAD蛋白的磷酸化、核轉(zhuǎn)位以及與DNA的結(jié)合能力，進(jìn)而調(diào)節(jié)TGF-β下游基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的異?；罨屠w維化的發(fā)生。SSc患者皮膚成纖維細(xì)胞中WDR26蛋白表達(dá)的增多，可能通過多種途徑參與了系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病過程，對細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)以及信號通路傳導(dǎo)產(chǎn)生影響，最終導(dǎo)致皮膚和內(nèi)臟器官的纖維化。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索，也為進(jìn)一步研究WDR26在系統(tǒng)性硬化癥中的作用奠定了基礎(chǔ)。4.2TGF-β與WDR26的關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）在系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病機(jī)制中占據(jù)核心地位，其信號通路的異常激活與疾病的纖維化進(jìn)程密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β能夠誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞中WDR26的表達(dá)，且其表達(dá)變化受到TGF-β刺激濃度和時(shí)間的雙重調(diào)控。這一現(xiàn)象提示W(wǎng)DR26與TGF-β之間存在緊密的聯(lián)系，可能在TGF-β介導(dǎo)的纖維化過程中發(fā)揮重要作用。從TGF-β信號通路的角度來看，在正常生理狀態(tài)下，TGF-β與其受體結(jié)合后，會激活下游的SMAD蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，以維持細(xì)胞外基質(zhì)的平衡。然而，在系統(tǒng)性硬化癥患者中，TGF-β信號通路往往異常激活，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度合成和沉積，最終引發(fā)組織纖維化。在本研究中，當(dāng)用不同濃度的TGF-β刺激成纖維細(xì)胞時(shí)，隨著刺激濃度的增加，SSc患者和正常人的成纖維細(xì)胞中WDR26mRNA的表達(dá)均呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢。這表明TGF-β對WDR26表達(dá)的誘導(dǎo)作用存在一個(gè)濃度閾值，在一定濃度范圍內(nèi)，TGF-β能夠促進(jìn)WDR26的表達(dá)，而當(dāng)濃度超過閾值時(shí)，這種促進(jìn)作用可能會受到抑制。在同一濃度TGF-β不同時(shí)間刺激實(shí)驗(yàn)中，隨著刺激時(shí)間的延長，成纖維細(xì)胞中WDR26mRNA的表達(dá)也呈先增高后降低的趨勢。這說明TGF-β對WDR26表達(dá)的誘導(dǎo)作用還受到時(shí)間的影響，在刺激初期，TGF-β能夠迅速誘導(dǎo)WDR26的表達(dá)，但隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞可能會產(chǎn)生適應(yīng)性變化，導(dǎo)致WDR26表達(dá)逐漸下降。進(jìn)一步分析TGF-β誘導(dǎo)WDR26表達(dá)變化的機(jī)制，可能與TGF-β信號通路中的其他分子相互作用有關(guān)。有研究表明，TGF-β信號通路中的SMAD蛋白在調(diào)節(jié)基因表達(dá)過程中，會與多種轉(zhuǎn)錄因子和輔助因子相互協(xié)作。WDR26作為一種在細(xì)胞內(nèi)具有多種功能的蛋白，可能通過與這些轉(zhuǎn)錄因子或輔助因子相互作用，參與TGF-β信號通路對基因表達(dá)的調(diào)控。WDR26可能與SMAD蛋白競爭結(jié)合某些轉(zhuǎn)錄因子，從而影響TGF-β下游基因的表達(dá)。WDR26也可能通過調(diào)節(jié)TGF-β受體的活性或穩(wěn)定性，間接影響TGF-β信號通路的傳導(dǎo)。從細(xì)胞外基質(zhì)生成的角度來看，TGF-β是誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，而WDR26的表達(dá)變化能夠影響TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)生成。在本研究中，過表達(dá)WDR26可抑制TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞中I型膠原α1（COL1A1）、纖連蛋白（FN）mRNA的表達(dá)，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)的生成；而低表達(dá)WDR26則可促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞中COL1A1、FNmRNA的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)生成增加。這表明WDR26在TGF-β介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)生成過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)水平的改變能夠直接影響細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的生成和代謝過程。TGF-β誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞中WDR26表達(dá)變化的現(xiàn)象，為深入理解系統(tǒng)性硬化癥的纖維化進(jìn)程提供了新的視角。WDR26可能通過參與TGF-β信號通路的調(diào)控，影響細(xì)胞外基質(zhì)的生成，從而在系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。后續(xù)研究將進(jìn)一步探討WDR26與TGF-β信號通路中其他分子的相互作用機(jī)制，以及WDR26在系統(tǒng)性硬化癥治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。4.3WDR26對細(xì)胞外基質(zhì)生成的調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的異常沉積是系統(tǒng)性硬化癥的主要病理特征之一，而I型膠原α1（COL1A1）和纖連蛋白（FN）作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，其合成和分泌的增加在纖維化進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用。本研究通過在正常人成纖維細(xì)胞中過表達(dá)和低表達(dá)WDR26，并在TGF-β刺激下檢測COL1A1、FNmRNA的表達(dá)水平，深入探究了WDR26對細(xì)胞外基質(zhì)生成的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)WDR26可抑制TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞中COL1A1mRNA的表達(dá)，其相對表達(dá)量僅為對照組的0.56±0.08，這表明WDR26能夠有效減少I型膠原的合成。I型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)中含量最豐富的膠原蛋白，其過度合成會導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，進(jìn)而促進(jìn)纖維化的發(fā)展。WDR26通過抑制COL1A1mRNA的表達(dá)，減少I型膠原的合成，可能有助于維持細(xì)胞外基質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)和功能，從而對纖維化起到抑制作用。同樣，過表達(dá)WDR26時(shí)，成纖維細(xì)胞中FNmRNA的表達(dá)水平也明顯低于對照組，相對表達(dá)量為對照組的0.72±0.12。纖連蛋白在細(xì)胞黏附、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)組裝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其合成的增加會促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，進(jìn)一步加重纖維化。WDR26抑制FNmRNA的表達(dá)，可能會削弱細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附，減少細(xì)胞外基質(zhì)的組裝，從而抑制纖維化的進(jìn)程。相反，低表達(dá)WDR26時(shí)，成纖維細(xì)胞中COL1A1mRNA的表達(dá)水平顯著高于對照組，相對表達(dá)量達(dá)到了對照組的1.85±0.21，這表明低表達(dá)WDR26能夠促進(jìn)I型膠原的合成，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積。低表達(dá)WDR26還會使成纖維細(xì)胞中FNmRNA的表達(dá)水平明顯升高，相對表達(dá)量為對照組的1.46±0.15，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的生成和纖維化的發(fā)展。綜合以上結(jié)果，WDR26在TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)生成過程中起著重要的調(diào)控作用。其表達(dá)水平的改變能夠直接影響COL1A1和FNmRNA的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的生成和代謝。WDR26可能通過某種機(jī)制參與了TGF-β信號通路對細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控，從而影響系統(tǒng)性硬化癥的纖維化進(jìn)程。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索，也為尋找新的治療靶點(diǎn)和干預(yù)措施提供了理論依據(jù)。4.4WDR26在TGF-β信號通路中的作用機(jī)制TGF-β信號通路在系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病機(jī)制中占據(jù)核心地位，其異常激活可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的異?；罨驮鲋常M(jìn)而引發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積和組織纖維化。在正常生理狀態(tài)下，TGF-β與其受體結(jié)合后，會激活下游的SMAD蛋白，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，以維持細(xì)胞外基質(zhì)的平衡。然而，在系統(tǒng)性硬化癥患者中，TGF-β信號通路往往異常激活，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度合成和沉積，最終引發(fā)組織纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常人成纖維細(xì)胞中，低表達(dá)WDR26時(shí)，成纖維細(xì)胞中SMAD3mRNA表達(dá)降低，其相對表達(dá)量僅為對照組的0.68±0.09（P<0.01）；過表達(dá)WDR26時(shí)，成纖維細(xì)胞中SMAD3mRNA的表達(dá)同樣降低，相對表達(dá)量為對照組的0.75±0.11（P<0.05）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SMAD3mRNA的表達(dá)隨著WDR26表達(dá)水平的增高呈先增高后降低的趨勢。這表明WDR26表達(dá)水平的變化對TGF-β信號通路中SMAD3mRNA的表達(dá)具有重要影響，兩者之間存在著復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。從TGF-β信號通路的傳導(dǎo)過程來分析，當(dāng)TGF-β與細(xì)胞表面的TGF-β受體結(jié)合后，會引發(fā)受體復(fù)合物的形成，進(jìn)而激活受體激酶活性，使受體底物SMAD2和SMAD3發(fā)生磷酸化。磷酸化的SMAD2和SMAD3與SMAD4形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。本研究中WDR26對SMAD3mRNA表達(dá)的影響，可能是通過干擾TGF-β信號通路的某個(gè)環(huán)節(jié)來實(shí)現(xiàn)的。一種可能的作用機(jī)制是，WDR26可能與TGF-β信號通路中的某些關(guān)鍵分子相互作用，影響SMAD3的磷酸化過程。有研究表明，在其他細(xì)胞類型中，一些蛋白質(zhì)能夠通過與SMAD蛋白相互作用，調(diào)節(jié)其磷酸化水平。WDR26可能通過與SMAD3或其上游的受體激酶相互作用，改變SMAD3的磷酸化狀態(tài)，從而影響其下游基因的表達(dá)。WDR26可能與SMAD3競爭結(jié)合受體激酶，或者直接抑制受體激酶的活性，使得SMAD3無法被磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致SMAD3mRNA的表達(dá)降低。另一種可能的機(jī)制是，WDR26可能參與了SMAD3mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。在細(xì)胞內(nèi)，mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，包括mRNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯等過程。WDR26可能通過與SMAD3mRNA結(jié)合，或者與參與SMAD3mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的其他分子相互作用，影響SMAD3mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。WDR26可能招募一些核酸酶或其他調(diào)節(jié)因子，加速SMAD3mRNA的降解，從而降低其表達(dá)水平；或者WDR26可能抑制SMAD3mRNA的翻譯起始或延伸過程，使得SMAD3蛋白的合成減少。此外，WDR26還可能通過影響TGF-β信號通路中的其他信號分子，間接調(diào)控SMAD3mRNA的表達(dá)。TGF-β信號通路與其他多種信號通路相互交織，形成復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)。WDR26可能通過調(diào)節(jié)其他信號通路的活性，如MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路等，來影響TGF-β信號通路對SMAD3mRNA表達(dá)的調(diào)控。在某些細(xì)胞中，MAPK信號通路的激活可以增強(qiáng)TGF-β信號通路對SMAD3的磷酸化作用，而WDR26可能通過抑制MAPK信號通路的活性，間接減弱TGF-β信號通路對SMAD3mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用。WDR26在TGF-β信號通路中可能通過多種機(jī)制影響SMAD3mRNA的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控成纖維細(xì)胞的功能和細(xì)胞外基質(zhì)的生成。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索，也為進(jìn)一步研究WDR26在系統(tǒng)性硬化癥治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)研究將進(jìn)一步深入探討WDR26與TGF-β信號通路中其他分子的相互作用機(jī)制，以及這些機(jī)制在系統(tǒng)性硬化癥發(fā)病過程中的具體作用。4.5研究的局限性與展望本研究雖然在探索WDR26在系統(tǒng)性硬化癥皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及作用方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。從樣本數(shù)量上看，本研究納入的系統(tǒng)性硬化癥患者及正常人皮膚成纖維細(xì)胞樣本數(shù)量相對較少，這可能導(dǎo)致研究結(jié)果存在一定的偏差，無法全面準(zhǔn)確地反映WDR26在系統(tǒng)性硬化癥中的表達(dá)及作用情況。在后續(xù)研究中，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，納入更多不同臨床表型、不同病情嚴(yán)重程度的系統(tǒng)性硬化癥患者，以及更多年齡、性別匹配的正常人作為對照，以增強(qiáng)研究結(jié)果的可靠性和普遍性。在研究方法上，本研究主要采用了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，從基因和蛋白水平探究WDR26的表達(dá)及作用機(jī)制。然而，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)具有一定的局限性，無法完全模擬體內(nèi)復(fù)雜的生理病理環(huán)境。未來研究可考慮構(gòu)建系統(tǒng)性硬化癥動(dòng)物模型，在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證WDR26的作用及機(jī)制，深入研究WDR26在系統(tǒng)性硬化癥發(fā)病過程中的動(dòng)態(tài)變化，以及其與其他細(xì)胞類型、信號通路之間的相互作用。本研究雖然發(fā)現(xiàn)了WDR26在系統(tǒng)性硬化癥皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)變化及其對細(xì)胞外基質(zhì)生成和TGF-β信號通路的影響，但對于WDR26的上游調(diào)控因子和下游作用靶點(diǎn)尚未完全明確。進(jìn)一步探索WDR26的上游調(diào)控因子，如哪些轉(zhuǎn)錄因子、miRNA等參與了WDR26基因表達(dá)的調(diào)控，有助于深入了解WDR26表達(dá)異常的原因。研究WDR26的下游作用靶點(diǎn)，明確其與哪些蛋白直接相互作用，以及這些相互作用如何影響細(xì)胞的生物學(xué)功能，將為揭示W(wǎng)DR26在系統(tǒng)性硬化癥中的作用機(jī)制提供更深入的認(rèn)識。未來研究還可以從藥物研發(fā)的角度出發(fā)，基于對WDR26作用機(jī)制的深入理解，篩選和開發(fā)能夠調(diào)節(jié)WDR26表達(dá)或活性的小分子化合物或生物制劑，為系統(tǒng)性硬化癥的治療提供新的藥物靶點(diǎn)和治療策略。結(jié)合臨床研究，將基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，通過臨床試驗(yàn)驗(yàn)證新的治療方法的安全性和有效性，為系統(tǒng)性硬化癥患者帶來更有效的治療手段，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。五、研究結(jié)論總結(jié)5.1主要研究成果概括本研究圍繞WDR26在系統(tǒng)性硬化癥皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及作用展開，通過一系列實(shí)驗(yàn)，取得了以下主要成果：WDR26表達(dá)差異顯著：運(yùn)用免疫印跡分析技術(shù)，對系統(tǒng)性硬化癥患者及正常人皮膚成纖維細(xì)胞中WDR26蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示系統(tǒng)性硬化癥患者皮膚成纖維細(xì)胞中WDR26蛋白表達(dá)較正常人顯著增多。這一發(fā)現(xiàn)暗示W(wǎng)DR26可能在系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病過程中扮演重要角色，為后續(xù)研究指明了方向。TGF-β誘導(dǎo)WDR26表達(dá)：通過設(shè)置不同濃度TGF-β刺激以及同一濃度TGF-β不同時(shí)間刺激兩組實(shí)驗(yàn)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測成纖維細(xì)胞中WDR26mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果表明TGF-β能夠誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞中WDR26的表達(dá)，且其表達(dá)變化受到TGF-β刺激濃度和時(shí)間的雙重調(diào)控。在不同濃度TGF-β刺激下，隨著刺激濃度的增加，SSc患者和正常人的成纖維細(xì)胞中WDR26mRNA的表達(dá)均呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢；在同一濃度TGF-β不同時(shí)間刺激下，隨著刺激時(shí)間的延長，成纖維細(xì)胞中WDR26mRNA的表