Wnt2b信號軸在肝細(xì)胞癌相關(guān)巨噬細(xì)胞極化中的作用與機制探究

Wnt2b信號軸在肝細(xì)胞癌相關(guān)巨噬細(xì)胞極化中的作用與機制探究一、引言1.1研究背景肝細(xì)胞癌（HCC）作為原發(fā)性肝癌的主要病理類型，是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病。據(jù)統(tǒng)計，全球每年新增HCC患者數(shù)量眾多，其發(fā)病率和病死率均位居惡性腫瘤前列，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存預(yù)期。在中國，HCC同樣是高發(fā)的惡性腫瘤之一，由于乙肝病毒（HBV）感染率較高等因素，使得HCC的防治形勢更為嚴(yán)峻。目前，針對HCC的治療手段包括手術(shù)切除、肝移植、消融、經(jīng)動脈栓塞化療以及系統(tǒng)治療等。然而，由于多數(shù)患者確診時已處于中晚期，且常伴有肝硬化等基礎(chǔ)疾病，導(dǎo)致僅有少數(shù)患者適合進行根治性治療，總體治療效果仍不理想，患者的5年生存率較低。因此，深入研究HCC的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和策略具有重要的臨床意義。腫瘤微環(huán)境（TME）在HCC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）作為TME的重要組成部分，具有高度的可塑性和功能異質(zhì)性。根據(jù)其活化狀態(tài)和功能特點，TAMs可分為經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞和替代活化的M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞具有較強的促炎和抗腫瘤活性，能夠分泌大量的促炎細(xì)胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-12（IL-12）等，通過激活免疫細(xì)胞、殺傷腫瘤細(xì)胞等方式發(fā)揮抗腫瘤作用。而M2型巨噬細(xì)胞則主要表現(xiàn)出抗炎和促腫瘤特性，可分泌免疫抑制性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，促進腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管生成，同時抑制機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。在HCC微環(huán)境中，TAMs通常向M2型極化，這種極化狀態(tài)的失衡與HCC的不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，調(diào)控TAMs的極化方向，促使其從M2型向M1型轉(zhuǎn)化，有望成為治療HCC的新策略。Wnt信號通路是一條在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和組織穩(wěn)態(tài)維持等過程中發(fā)揮重要作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Wnt2b作為Wnt家族的重要成員，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色。已有研究表明，Wnt2b在HCC組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且與HCC的腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯等臨床病理特征密切相關(guān)。Wnt2b可通過激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路，促進HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。此外，Wnt2b還能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，影響腫瘤的免疫逃逸。然而，Wnt2b對HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的影響及具體機制尚未完全明確。綜上所述，深入探討Wnt2b對HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的影響及機制，不僅有助于揭示HCC的發(fā)病機制，還可能為HCC的免疫治療提供新的靶點和策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究Wnt2b對HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的影響及具體分子機制，為揭示HCC的發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)，并為HCC的治療提供潛在的新靶點和策略。具體研究目的如下：明確Wnt2b對HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的影響：通過體內(nèi)外實驗，觀察Wnt2b表達(dá)改變對巨噬細(xì)胞向M1型或M2型極化的影響，確定Wnt2b在HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化過程中的作用方向。揭示W(wǎng)nt2b調(diào)控HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的分子機制：深入研究Wnt2b激活的信號通路及其下游分子，探討其如何影響巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因的表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，闡明Wnt2b調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的分子機制。評估Wnt2b作為HCC治療靶點的潛力：通過干預(yù)Wnt2b信號通路，觀察對HCC細(xì)胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移以及腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)的影響，評估Wnt2b作為HCC治療靶點的可行性和有效性。肝細(xì)胞癌嚴(yán)重威脅人類健康，現(xiàn)有治療手段存在局限性，深入研究其發(fā)病機制和尋找新治療靶點迫在眉睫。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中扮演重要角色，其極化狀態(tài)對腫瘤發(fā)展有顯著影響。Wnt2b在HCC中高表達(dá)，且與腫瘤惡性程度相關(guān)，但對HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的影響及機制尚不明確。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值，在理論意義層面，有助于揭示HCC發(fā)生發(fā)展的分子機制，完善對腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞間相互作用的認(rèn)識，為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)；在臨床應(yīng)用價值層面，若能明確Wnt2b對HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的影響及機制，有望為HCC的治療提供新的靶點和策略，提高治療效果，改善患者預(yù)后。通過調(diào)控Wnt2b信號通路，可能實現(xiàn)對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控，從而重塑腫瘤微環(huán)境，增強機體抗腫瘤免疫反應(yīng)，為HCC的治療開辟新的途徑。1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1細(xì)胞實驗細(xì)胞培養(yǎng)：培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系（如HepG2、Huh7等）和巨噬細(xì)胞系（如RAW264.7），以及原代分離的人肝癌組織來源的巨噬細(xì)胞和正常肝組織來源的巨噬細(xì)胞。使用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基或RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。條件培養(yǎng)基制備：收集肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)過濾除菌后得到肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基（HCC-TCM），用于后續(xù)對巨噬細(xì)胞的刺激實驗。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或電穿孔法，將針對Wnt2b的小干擾RNA（si-Wnt2b）或過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-Wnt2b）轉(zhuǎn)染至巨噬細(xì)胞中，以敲低或過表達(dá)Wnt2b基因。轉(zhuǎn)染后48-72小時，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測轉(zhuǎn)染效率。巨噬細(xì)胞極化誘導(dǎo)：將巨噬細(xì)胞分為對照組、M1極化誘導(dǎo)組（用IFN-γ和LPS刺激）、M2極化誘導(dǎo)組（用IL-4和IL-13刺激）以及HCC-TCM處理組。在不同處理條件下培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，觀察其極化狀態(tài)的變化。細(xì)胞功能檢測：細(xì)胞增殖檢測：采用CCK-8法或EdU摻入法，檢測不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對肝癌細(xì)胞增殖的影響。將巨噬細(xì)胞與肝癌細(xì)胞以不同比例共培養(yǎng)，一定時間后加入CCK-8試劑或EdU試劑，按照試劑盒說明書操作，通過酶標(biāo)儀檢測吸光度或熒光顯微鏡觀察EdU陽性細(xì)胞數(shù)，計算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞遷移和侵襲檢測：利用Transwell小室實驗，檢測巨噬細(xì)胞對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。在上室接種肝癌細(xì)胞，下室加入不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清或共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)一定時間后，固定并染色遷移或侵襲到下室的肝癌細(xì)胞，在顯微鏡下計數(shù)。細(xì)胞因子分泌檢測：收集巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-12等）和M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子（如IL-10、TGF-β等）的分泌水平，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。1.3.2動物實驗動物模型建立：選用6-8周齡的BALB/c裸鼠或C57BL/6小鼠，通過皮下注射肝癌細(xì)胞（如HepG2細(xì)胞）建立肝癌皮下移植瘤模型；或通過原位注射肝癌細(xì)胞至小鼠肝臟，建立肝癌原位模型。實驗分組：將荷瘤小鼠隨機分為對照組、si-Wnt2b處理組、pcDNA3.1-Wnt2b處理組等，每組8-10只。對照組給予生理鹽水或空載體處理，si-Wnt2b處理組通過瘤內(nèi)注射或尾靜脈注射si-Wnt2b脂質(zhì)體復(fù)合物，pcDNA3.1-Wnt2b處理組注射相應(yīng)的過表達(dá)質(zhì)粒復(fù)合物。樣本采集：在處理后的不同時間點（如第7、14、21天），處死小鼠，收集腫瘤組織、脾臟、肝臟等器官。部分腫瘤組織用于RNA和蛋白質(zhì)提取，進行分子生物學(xué)檢測；部分腫瘤組織進行冰凍切片或石蠟切片，用于免疫組織化學(xué)（IHC）、免疫熒光（IF）等檢測；脾臟和肝臟用于分離免疫細(xì)胞，分析免疫細(xì)胞亞群的變化。腫瘤生長監(jiān)測：每隔2-3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，觀察不同處理組對腫瘤生長的影響。體內(nèi)巨噬細(xì)胞極化分析：通過免疫組織化學(xué)或免疫熒光染色，檢測腫瘤組織中M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（如iNOS）和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（如CD206）的表達(dá)，分析巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)；或通過流式細(xì)胞術(shù)，對分離的腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞進行表型分析，確定M1型和M2型巨噬細(xì)胞的比例。1.3.3分子生物學(xué)技術(shù)實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：提取細(xì)胞或組織中的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，采用SYBRGreen法或TaqMan探針法進行qRT-PCR反應(yīng)。檢測Wnt2b、β-catenin以及巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因（如iNOS、CD206、IL-12、IL-10等）的mRNA表達(dá)水平，以GAPDH或β-actin作為內(nèi)參基因，通過2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）：提取細(xì)胞或組織中的總蛋白質(zhì)，通過BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜或NC膜上。用5%脫脂奶粉或BSA封閉膜，加入針對Wnt2b、β-catenin、p-GSK-3β、c-Myc以及巨噬細(xì)胞極化相關(guān)蛋白（如iNOS、CD206等）的一抗，4℃孵育過夜。次日，洗膜后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時，利用化學(xué)發(fā)光試劑（如ECL）進行顯影，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，半定量分析蛋白質(zhì)表達(dá)水平。免疫組織化學(xué)（IHC）：將腫瘤組織石蠟切片脫蠟至水，通過抗原修復(fù)、封閉等步驟后，加入針對目的蛋白（如Wnt2b、β-catenin、iNOS、CD206等）的一抗，37℃孵育1-2小時或4℃孵育過夜。洗片后加入二抗，再加入DAB顯色劑進行顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片后，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，根據(jù)染色強度和陽性細(xì)胞比例進行評分。免疫熒光（IF）：將細(xì)胞爬片或冰凍切片進行固定、通透、封閉處理后，加入一抗，4℃孵育過夜。次日，洗片后加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育1-2小時，再加入DAPI染液染細(xì)胞核，封片后在熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下觀察，拍照記錄。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒簶?gòu)建含有Wnt/β-catenin信號通路靶基因（如c-Myc、CyclinD1等）啟動子區(qū)域的熒光素酶報告基因載體，將其與Wnt2b過表達(dá)質(zhì)粒或si-Wnt2b共轉(zhuǎn)染至巨噬細(xì)胞中。同時轉(zhuǎn)染內(nèi)參質(zhì)粒（如Renilla熒光素酶報告基因載體），以校正轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48小時后，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，按照說明書操作，檢測熒光素酶活性，分析Wnt2b對Wnt/β-catenin信號通路靶基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。1.3.4技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：首先進行細(xì)胞實驗，培養(yǎng)肝癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，制備肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基，對巨噬細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染、極化誘導(dǎo)及功能檢測，初步探究Wnt2b對巨噬細(xì)胞極化及功能的影響。建立肝癌動物模型，對荷瘤小鼠進行分組處理，監(jiān)測腫瘤生長，采集樣本進行體內(nèi)巨噬細(xì)胞極化分析及相關(guān)分子生物學(xué)檢測，進一步驗證Wnt2b在體內(nèi)對肝癌相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的作用。運用多種分子生物學(xué)技術(shù)，從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測Wnt2b、β-catenin以及巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灥确椒ㄉ钊胙芯縒nt2b調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的分子機制。綜合細(xì)胞實驗和動物實驗結(jié)果，分析數(shù)據(jù)，總結(jié)Wnt2b對HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的影響及機制，評估Wnt2b作為HCC治療靶點的潛力。[此處插入技術(shù)路線圖1-1，圖中清晰展示從細(xì)胞實驗、動物實驗到分子生物學(xué)檢測的流程及各步驟之間的關(guān)系]二、肝細(xì)胞癌與巨噬細(xì)胞極化概述2.1肝細(xì)胞癌（HCC）的研究現(xiàn)狀肝細(xì)胞癌（HCC）是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和致死率均處于較高水平。據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，HCC在全球癌癥發(fā)病率中位居第六位，在癌癥致死率中排名第四位。在我國，由于乙肝病毒（HBV）感染率較高、飲酒、黃曲霉毒素暴露以及非酒精性脂肪性肝炎等因素的影響，HCC的發(fā)病率尤為突出，每年新增病例數(shù)約占全球的50%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存預(yù)期。HCC的主要致病因素包括：病毒感染：HBV和丙型肝炎病毒（HCV）的慢性感染是導(dǎo)致HCC發(fā)生的重要原因。長期的病毒感染會引發(fā)肝臟慢性炎癥，促使肝細(xì)胞不斷損傷和修復(fù)，在這個過程中，肝細(xì)胞容易發(fā)生基因突變，進而增加HCC的發(fā)病風(fēng)險。據(jù)統(tǒng)計，在我國HBV相關(guān)的HCC患者占比高達(dá)70%-85%。肝硬化：肝硬化與HCC的發(fā)生密切相關(guān)，約80%-90%的HCC患者伴有肝硬化。肝硬化時肝臟組織的纖維化和結(jié)構(gòu)重建為腫瘤細(xì)胞的生長提供了適宜的微環(huán)境，同時肝硬化過程中肝細(xì)胞的再生和增殖也容易導(dǎo)致基因異常改變，從而引發(fā)HCC。黃曲霉毒素暴露：黃曲霉毒素是一種強致癌物質(zhì)，常見于霉變的食物中，如玉米、花生等。長期食用被黃曲霉毒素污染的食物，會使肝細(xì)胞DNA受到損傷，導(dǎo)致基因突變，進而引發(fā)HCC。其他因素：長期酗酒、肥胖、糖尿病、遺傳因素等也與HCC的發(fā)生發(fā)展存在一定關(guān)聯(lián)。長期酗酒會引起肝臟炎癥、脂肪變性和肝硬化，增加HCC的發(fā)病幾率；肥胖和糖尿病導(dǎo)致的代謝紊亂也可能促進HCC的發(fā)生；家族中有肝癌病史的人群，其遺傳易感性增加，患HCC的風(fēng)險相對較高。目前，針對HCC的治療手段呈現(xiàn)多樣化，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。手術(shù)切除是早期HCC患者獲得根治的重要方法之一，包括肝部分切除術(shù)和肝葉切除術(shù)等。然而，由于多數(shù)患者確診時已處于中晚期，且常伴有肝硬化等基礎(chǔ)疾病，肝臟儲備功能下降，僅有約20%-30%的患者適合進行手術(shù)切除。肝移植是治療HCC的有效手段，尤其適用于合并肝硬化且肝功能較差的患者，它不僅可以切除腫瘤，還能解決肝硬化問題，提高患者的長期生存率。但肝源短缺、手術(shù)費用高昂以及術(shù)后免疫排斥反應(yīng)等問題限制了肝移植的廣泛應(yīng)用。消融治療，如射頻消融、微波消融和冷凍消融等，對于早期小肝癌具有較好的治療效果，可通過物理方法使腫瘤組織凝固性壞死，達(dá)到局部根治的目的。但消融治療存在腫瘤殘留和復(fù)發(fā)的風(fēng)險，對于較大或位置特殊的腫瘤效果欠佳。經(jīng)動脈栓塞化療（TACE）是中晚期HCC的常用治療方法，通過將化療藥物和栓塞劑注入腫瘤供血動脈，使腫瘤缺血壞死并受到化療藥物的殺傷。然而，TACE治療后腫瘤容易復(fù)發(fā)，且多次治療可能導(dǎo)致肝功能損害等并發(fā)癥。近年來，系統(tǒng)治療取得了一定進展，分子靶向藥物和免疫治療藥物的出現(xiàn)為晚期HCC患者帶來了新的希望。索拉非尼是第一個被批準(zhǔn)用于晚期HCC治療的分子靶向藥物，它通過抑制血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）和血小板衍生生長因子受體（PDGFR）等，阻斷腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖。但索拉非尼的客觀緩解率較低，患者的生存期延長有限。侖伐替尼等新一代靶向藥物在臨床研究中顯示出了較好的療效，與索拉非尼相比，侖伐替尼在總生存期、無進展生存期和客觀緩解率等方面均有一定優(yōu)勢。免疫治療藥物如免疫檢查點抑制劑（ICIs），通過阻斷免疫檢查點蛋白，如程序性死亡受體1（PD-1）及其配體（PD-L1）等，激活機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗腫瘤作用。納武利尤單抗、帕博利珠單抗等ICIs已被批準(zhǔn)用于晚期HCC的治療，為患者帶來了生存獲益。然而，免疫治療也存在一定的局限性，如僅部分患者對免疫治療有效，且可能出現(xiàn)免疫相關(guān)不良反應(yīng)等。綜上所述，盡管HCC的治療取得了一定進展，但由于多數(shù)患者確診時已處于中晚期，且HCC具有易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等特點，總體治療效果仍不理想，患者的5年生存率較低。因此，深入研究HCC的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和策略，對于提高HCC的治療效果和改善患者預(yù)后具有重要的臨床意義。2.2巨噬細(xì)胞極化及其在腫瘤中的作用巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，廣泛分布于人體的各個組織和器官，在免疫防御、炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞具有高度的可塑性，在不同的微環(huán)境刺激下，其表型和功能會發(fā)生顯著變化，這一動態(tài)且迅速的過程被稱為巨噬細(xì)胞極化。巨噬細(xì)胞極化主要分為經(jīng)典激活的M1型和替代激活的M2型，這兩種極化狀態(tài)具有截然不同的特點和功能。M1型巨噬細(xì)胞通常在Th1型免疫反應(yīng)和急性炎癥環(huán)境下被激活，刺激因素包括干擾素-γ（IFN-γ）、脂多糖（LPS）等。M1型巨噬細(xì)胞具有較強的抗菌、抗腫瘤特性，能夠分泌大量的促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和一氧化氮（NO）等。這些促炎細(xì)胞因子可以激活其他免疫細(xì)胞，增強機體的免疫應(yīng)答，從而有效地殺傷病原體和腫瘤細(xì)胞。此外，M1型巨噬細(xì)胞還能夠表達(dá)高水平的主要組織相容性復(fù)合體II類分子（MHCII）和共刺激分子，如CD80、CD86等，通過抗原呈遞作用，將病原體或腫瘤細(xì)胞的抗原信息傳遞給T細(xì)胞，激活T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，進一步增強抗腫瘤免疫效應(yīng)。M2型巨噬細(xì)胞則在Th2型免疫反應(yīng)和組織修復(fù)過程中發(fā)揮作用，主要由白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-13（IL-13）等細(xì)胞因子激活。M2型巨噬細(xì)胞參與免疫調(diào)節(jié)、組織重建、纖維化和代謝過程，具有抗炎和促進組織修復(fù)的功能。M2型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子主要為抗炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等。IL-10可以抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，降低炎癥反應(yīng)的強度，從而減輕組織損傷；TGF-β則能夠促進成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，有助于組織的修復(fù)和纖維化。此外，M2型巨噬細(xì)胞還表達(dá)一些與組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的分子，如精氨酸酶-1（Arg1）、幾丁質(zhì)酶樣蛋白3（Ym1）等。Arg1可以催化精氨酸生成鳥氨酸和尿素，鳥氨酸進一步合成多胺和脯氨酸，參與細(xì)胞增殖和膠原蛋白合成；Ym1則在組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。在腫瘤微環(huán)境（TME）中，巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要影響。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）是TME中最主要的免疫細(xì)胞類型之一，它們的極化狀態(tài)受到腫瘤細(xì)胞、腫瘤間質(zhì)細(xì)胞以及TME中各種細(xì)胞因子、趨化因子和代謝產(chǎn)物等多種因素的調(diào)控。在腫瘤發(fā)生的早期階段，TME中的炎癥微環(huán)境可能會誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型極化，M1型巨噬細(xì)胞通過分泌促炎細(xì)胞因子和活性氧（ROS）等物質(zhì)，激活免疫細(xì)胞，殺傷腫瘤細(xì)胞，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，隨著腫瘤的發(fā)展，腫瘤細(xì)胞會釋放多種免疫抑制性因子，如IL-10、TGF-β、前列腺素E2（PGE2）等，這些因子可以抑制M1型巨噬細(xì)胞的功能，同時誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化。M2型TAMs在腫瘤微環(huán)境中大量聚集，它們通過多種機制促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。一方面，M2型TAMs可以分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）等促血管生成因子，促進腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤細(xì)胞的增殖和生長。另一方面，M2型TAMs能夠分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白水解酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，M2型TAMs還可以通過分泌免疫抑制性細(xì)胞因子，如IL-10和TGF-β等，抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能，幫助腫瘤細(xì)胞逃避機體的免疫監(jiān)視。巨噬細(xì)胞極化在腫瘤微環(huán)境中起著至關(guān)重要的作用，M1型巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤活性，而M2型巨噬細(xì)胞則表現(xiàn)出促腫瘤特性。深入研究巨噬細(xì)胞極化的機制以及TAMs在腫瘤微環(huán)境中的作用，對于揭示腫瘤的發(fā)病機制、開發(fā)新的腫瘤治療策略具有重要意義。2.3Wnt信號通路簡介Wnt信號通路是一條在生物進化過程中高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、遷移以及組織穩(wěn)態(tài)維持等多種生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該通路的異常激活或抑制與多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等。根據(jù)其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制和下游效應(yīng)的不同，Wnt信號通路主要分為以下幾類：經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路：這是Wnt信號通路中研究最為深入的一條分支，也是在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的通路。當(dāng)Wnt配體（如Wnt2b、Wnt3a等）與細(xì)胞膜上的Frizzled（Fz）受體家族以及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）共受體結(jié)合后，會激活胞內(nèi)的Dishevelled（Dvl）蛋白。Dvl蛋白的激活抑制了由糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、軸蛋白（Axin）和腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白（APC）組成的降解復(fù)合物的活性。在沒有Wnt信號刺激時，降解復(fù)合物會使β-catenin磷酸化，磷酸化的β-catenin隨后被泛素化并經(jīng)蛋白酶體降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)β-catenin的低水平。而當(dāng)Wnt信號激活后，β-catenin不再被降解，在細(xì)胞質(zhì)中逐漸積累并進入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin與T細(xì)胞因子/淋巴增強因子（TCF/LEF）家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，激活一系列下游靶基因的表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1、Survivin等，這些靶基因參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和遷移等過程，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。非經(jīng)典Wnt信號通路：除經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路外，還存在多條非經(jīng)典Wnt信號通路，它們不依賴于β-catenin的核轉(zhuǎn)位，主要包括平面細(xì)胞極性通路（PlanarCellPolarityPathway，PCP通路）和Wnt/Ca2?通路。PCP通路主要參與細(xì)胞骨架的重排和細(xì)胞極性的建立，在胚胎發(fā)育過程中對細(xì)胞的定向遷移和組織器官的形態(tài)發(fā)生具有重要作用。當(dāng)Wnt配體與Fz受體結(jié)合后，激活Dvl蛋白，進而激活小G蛋白Rho和Rac，它們通過調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架的動態(tài)變化，影響細(xì)胞的形態(tài)和遷移。Wnt/Ca2?通路則主要通過激活磷脂酶C（PLC），促使細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2?）釋放，激活蛋白激酶C（PKC）、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）等下游分子，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及炎癥反應(yīng)等過程。Wnt2b作為Wnt家族的重要成員，在Wnt信號通路中扮演著關(guān)鍵角色。Wnt2b基因編碼的蛋白質(zhì)是一種分泌型糖蛋白，其結(jié)構(gòu)包含一個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域?qū)τ赪nt2b與受體的結(jié)合至關(guān)重要。Wnt2b可以與Fz受體家族成員以及LRP5/6共受體特異性結(jié)合，從而激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路。在多種腫瘤中，如肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等，Wnt2b的異常高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在肝癌中，Wnt2b通過激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路，促進肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。研究表明，沉默Wnt2b基因可以顯著降低肝癌細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)水平及其核轉(zhuǎn)位，進而抑制下游靶基因c-Myc和CyclinD1的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。此外，Wnt2b還可以通過非經(jīng)典Wnt信號通路發(fā)揮作用，但具體機制尚不完全明確。Wnt信號通路在生理和病理過程中具有廣泛而重要的作用。在胚胎發(fā)育過程中，Wnt信號通路參與了多個器官系統(tǒng)的形成和發(fā)育，如神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，Wnt信號通路調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化和遷移，對于神經(jīng)元的生成和神經(jīng)回路的構(gòu)建至關(guān)重要。在心血管系統(tǒng)發(fā)育中，Wnt信號通路參與心臟的形成、血管的生成和心肌細(xì)胞的分化。在病理情況下，Wnt信號通路的異常激活或抑制與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。除了腫瘤之外，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默病、帕金森病中，Wnt信號通路的異常與神經(jīng)元的凋亡、神經(jīng)炎癥以及認(rèn)知功能障礙等病理過程相關(guān)。在心血管疾病如動脈粥樣硬化、心肌梗死中，Wnt信號通路也參與了血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移以及心肌細(xì)胞的重構(gòu)等過程。因此，深入研究Wnt信號通路的調(diào)控機制及其在疾病中的作用，對于開發(fā)新的治療策略具有重要意義。三、Wnt2b對HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的影響3.1實驗設(shè)計與材料方法3.1.1實驗材料細(xì)胞系：人肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh7購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），巨噬細(xì)胞系RAW264.7購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。所有細(xì)胞系均經(jīng)過短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）鑒定，并定期檢測支原體污染情況。實驗動物：6-8周齡的BALB/c裸鼠和C57BL/6小鼠，雄性，體重18-22g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物飼養(yǎng)于特定病原體（SPF）級動物房，環(huán)境溫度控制在22±2℃，相對濕度為50%-60%，12小時光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。實驗前動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實驗過程中嚴(yán)格遵循動物倫理和福利原則，實驗方案經(jīng)本單位動物倫理委員會批準(zhǔn)。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自Gibco公司；Wnt2b小干擾RNA（si-Wnt2b）及其陰性對照（si-NC）、Wnt2b過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-Wnt2b）和空載質(zhì)粒（pcDNA3.1）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購自Invitrogen公司；干擾素-γ（IFN-γ）、脂多糖（LPS）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-13（IL-13）購自PeproTech公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；蛋白質(zhì)提取試劑、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、PVDF膜購自碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人Wnt2b抗體、兔抗人β-catenin抗體、兔抗人p-GSK-3β抗體、兔抗人c-Myc抗體、兔抗人iNOS抗體、兔抗人CD206抗體、鼠抗人GAPDH抗體購自CellSignalingTechnology公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒用于檢測細(xì)胞因子TNF-α、IL-12、IL-10、TGF-β，購自R&DSystems公司。主要儀器：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific）、超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、倒置顯微鏡（Olympus）、高速冷凍離心機（Eppendorf）、酶標(biāo)儀（Bio-Rad）、實時熒光定量PCR儀（ABIStepOnePlus）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocMP）、流式細(xì)胞儀（BDFACSCantoII）。3.1.2實驗方法細(xì)胞培養(yǎng)：HepG2和Huh7肝癌細(xì)胞使用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；RAW264.7巨噬細(xì)胞使用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)。細(xì)胞每隔2-3天傳代一次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)極化：將RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1×10?個細(xì)胞，培養(yǎng)24小時后，進行極化誘導(dǎo)。M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)組：加入終濃度為20ng/mL的IFN-γ和100ng/mL的LPS刺激細(xì)胞；M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)組：加入終濃度為20ng/mL的IL-4和20ng/mL的IL-13刺激細(xì)胞；對照組：加入等體積的PBS。誘導(dǎo)培養(yǎng)48小時后，收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清用于后續(xù)檢測。條件培養(yǎng)基制備：將HepG2或Huh7肝癌細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，更換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集培養(yǎng)上清，1000rpm離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片，將上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，得到肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基（HCC-TCM），分裝后保存于-80℃?zhèn)溆谩＜?xì)胞轉(zhuǎn)染：將RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于6孔板中，每孔5×10?個細(xì)胞，培養(yǎng)24小時后，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%-70%時進行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine3000試劑盒說明書進行操作，將si-Wnt2b或si-NC、pcDNA3.1-Wnt2b或pcDNA3.1與Lipofectamine3000試劑分別在Opti-MEM培養(yǎng)基中稀釋，室溫孵育5分鐘后，將兩者混合，繼續(xù)室溫孵育20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻，培養(yǎng)6小時后更換為完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48-72小時后，收集細(xì)胞，通過實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染效率。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：使用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞或組織中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用實時熒光定量PCR試劑盒進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O，總體積為20μL。引物序列根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫設(shè)計，由上海生工生物工程有限公司合成，具體引物序列如下：Wnt2b：上游引物5'-CCCAAGATGACCGAGATGAA-3'，下游引物5'-GGGCTTCTTGATGGTGAGAA-3'；β-catenin：上游引物5'-CTGCTGACCTTCTGGACCTC-3'，下游引物5'-GGCTTCAGTCTCTCGGTTCA-3'；iNOS：上游引物5'-CCCAGAGAAGATGGCAGAGA-3'，下游引物5'-GGATGCTGGTCTGCTGTTTC-3'；CD206：上游引物5'-CTGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，下游引物5'-GGGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；GAPDH：上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒。反應(yīng)結(jié)束后，通過2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）：使用蛋白質(zhì)提取試劑提取細(xì)胞或組織中的總蛋白質(zhì)，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。取適量蛋白質(zhì)樣品，加入上樣緩沖液，煮沸變性5分鐘。將變性后的蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE電泳分離，電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉或BSA在室溫下封閉PVDF膜1-2小時，然后加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行顯影，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，半定量分析蛋白質(zhì)表達(dá)水平。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）：按照ELISA試劑盒說明書操作，將巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清加入到包被有相應(yīng)抗體的酶標(biāo)板中，室溫孵育1-2小時。洗滌酶標(biāo)板3次后，加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時。再次洗滌酶標(biāo)板3次，加入HRP標(biāo)記的親和素，室溫孵育30分鐘。洗滌酶標(biāo)板4次后，加入底物溶液，室溫避光反應(yīng)15-30分鐘，然后加入終止液終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細(xì)胞因子的濃度。免疫熒光（IF）：將RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，每孔2×10?個細(xì)胞，培養(yǎng)24小時后進行處理。處理結(jié)束后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10分鐘，5%BSA封閉細(xì)胞30分鐘。加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘，加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育1-2小時。再次用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘，加入DAPI染液染細(xì)胞核，室溫避光孵育5分鐘。最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。流式細(xì)胞術(shù)分析：收集RAW264.7巨噬細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入適量的流式染色緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/mL。取100μL細(xì)胞懸液，加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體，4℃避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，重懸于500μL流式染色緩沖液中，使用流式細(xì)胞儀進行檢測。分析M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（如CD86、iNOS）和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（如CD206、Arg1）的表達(dá)情況，計算M1型和M2型巨噬細(xì)胞的比例。動物模型建立與處理：肝癌皮下移植瘤模型：將HepG2細(xì)胞用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，用PBS洗滌2次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?/mL。取100μL細(xì)胞懸液注射到BALB/c裸鼠右腋下皮下，每只小鼠接種5×10?個細(xì)胞。接種后每隔2-3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，觀察腫瘤生長情況。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100-150mm3時，將荷瘤小鼠隨機分為對照組、si-Wnt2b處理組、pcDNA3.1-Wnt2b處理組，每組8-10只。對照組給予生理鹽水或空載體處理，si-Wnt2b處理組通過瘤內(nèi)注射或尾靜脈注射si-Wnt2b脂質(zhì)體復(fù)合物（si-Wnt2b終濃度為5nmol/L），pcDNA3.1-Wnt2b處理組注射相應(yīng)的過表達(dá)質(zhì)粒復(fù)合物（pcDNA3.1-Wnt2b終濃度為5μg），每周注射2-3次，共處理2-3周。肝癌原位模型：將C57BL/6小鼠麻醉后，在無菌條件下打開腹腔，暴露肝臟。用微量注射器將HepG2細(xì)胞懸液（濃度為5×10?/mL，體積為50μL）注射到肝臟左葉包膜下，每只小鼠接種2.5×10?個細(xì)胞。縫合傷口后，待小鼠蘇醒。術(shù)后給予小鼠適當(dāng)?shù)目垢腥竞妥o理措施。當(dāng)小鼠出現(xiàn)明顯的腫瘤生長跡象（如體重下降、腹部膨隆等）時，將荷瘤小鼠隨機分組并進行相應(yīng)處理，處理方法同肝癌皮下移植瘤模型。免疫組織化學(xué)（IHC）：將腫瘤組織進行石蠟包埋，制成4μm厚的切片。切片脫蠟至水，通過抗原修復(fù)、3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性、5%BSA封閉等步驟后，加入針對目的蛋白（如Wnt2b、β-catenin、iNOS、CD206等）的一抗，37℃孵育1-2小時或4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘，加入二抗，37℃孵育30分鐘。再次用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘，加入DAB顯色劑進行顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片后，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，根據(jù)染色強度和陽性細(xì)胞比例進行評分。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒簶?gòu)建含有Wnt/β-catenin信號通路靶基因（如c-Myc、CyclinD1等）啟動子區(qū)域的熒光素酶報告基因載體，將其與Wnt2b過表達(dá)質(zhì)?；騭i-Wnt2b共轉(zhuǎn)染至RAW264.7巨噬細(xì)胞中。同時轉(zhuǎn)染內(nèi)參質(zhì)粒（如Renilla熒光素酶報告基因載體），以校正轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48小時后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書操作，裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，加入熒光素酶底物，使用多功能酶標(biāo)儀檢測螢火蟲熒光素酶和Renilla熒光素酶的活性，計算螢火蟲熒光素酶活性與Renilla熒光素酶活性的比值，分析Wnt2b對Wnt/β-catenin信號通路靶基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。3.2HCC微環(huán)境中Wnt2b的表達(dá)與巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)分析為深入探究Wnt2b在肝細(xì)胞癌（HCC）微環(huán)境中的作用，本研究首先對HCC組織和細(xì)胞系中Wnt2b的表達(dá)進行了檢測。通過收集臨床HCC患者的腫瘤組織標(biāo)本以及對應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本，運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對Wnt2b的mRNA表達(dá)水平進行檢測。結(jié)果顯示，HCC組織中Wnt2b的mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織（P<0.05），表明Wnt2b在HCC組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。進一步對多種人肝癌細(xì)胞系（如HepG2、Huh7等）進行qRT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)這些肝癌細(xì)胞系中Wnt2b的mRNA表達(dá)水平同樣明顯高于正常肝細(xì)胞系，且不同肝癌細(xì)胞系之間Wnt2b的表達(dá)存在一定差異。巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中具有重要作用，其極化狀態(tài)可分為M1型和M2型，這兩種極化狀態(tài)對腫瘤的發(fā)展產(chǎn)生截然不同的影響。為了分析HCC微環(huán)境中Wnt2b的表達(dá)與巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的相關(guān)性，本研究利用免疫組織化學(xué)（IHC）和免疫熒光（IF）技術(shù)，對HCC組織中巨噬細(xì)胞的極化標(biāo)志物進行檢測。M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物主要包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、CD86等，而M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物則有CD206、精氨酸酶-1（Arg1）等。通過IHC染色，觀察HCC組織中iNOS和CD206的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Wnt2b高表達(dá)的HCC組織區(qū)域，CD206陽性的M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而iNOS陽性的M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量相對減少。進一步通過IF雙標(biāo)染色，同時檢測Wnt2b和巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物（如CD206或iNOS）的表達(dá)，直觀地展示了Wnt2b與M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206在空間分布上的共定位現(xiàn)象，表明Wnt2b的高表達(dá)可能與巨噬細(xì)胞向M2型極化密切相關(guān)。為了更準(zhǔn)確地分析Wnt2b表達(dá)與巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物之間的相關(guān)性，本研究收集了大量的HCC組織標(biāo)本，進行Wnt2bmRNA表達(dá)水平與M1型、M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析。通過qRT-PCR檢測Wnt2b、iNOS、CD206等基因的mRNA表達(dá)水平，運用統(tǒng)計學(xué)方法計算它們之間的相關(guān)性系數(shù)。結(jié)果顯示，Wnt2b的mRNA表達(dá)水平與CD206的mRNA表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（r=0.65，P<0.01），而與iNOS的mRNA表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.58，P<0.01）。這一結(jié)果進一步證實了在HCC微環(huán)境中，Wnt2b的高表達(dá)與巨噬細(xì)胞向M2型極化密切相關(guān)，提示W(wǎng)nt2b可能在調(diào)控巨噬細(xì)胞極化過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過對HCC組織和細(xì)胞系中Wnt2b表達(dá)的檢測，以及對其與巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物相關(guān)性的分析，明確了Wnt2b在HCC微環(huán)境中呈高表達(dá)狀態(tài)，且與巨噬細(xì)胞向M2型極化密切相關(guān)。這為后續(xù)深入研究Wnt2b對HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的影響及機制奠定了基礎(chǔ)。3.3Wnt2b干預(yù)對巨噬細(xì)胞極化的影響為了進一步明確Wnt2b在調(diào)控HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化中的作用，本研究利用Wnt2b重組蛋白和Wnt信號通路抑制劑對巨噬細(xì)胞進行干預(yù)處理，觀察巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的變化。將RAW264.7巨噬細(xì)胞分為對照組、Wnt2b重組蛋白處理組、Wnt信號通路抑制劑（IWP-2）處理組以及Wnt2b重組蛋白和IWP-2聯(lián)合處理組。對照組加入等體積的PBS，Wnt2b重組蛋白處理組加入終濃度為50ng/mL的Wnt2b重組蛋白，IWP-2處理組加入終濃度為10μmol/L的IWP-2，聯(lián)合處理組先加入IWP-2預(yù)處理1小時，再加入Wnt2b重組蛋白。處理48小時后，收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清，進行后續(xù)檢測。通過實時熒光定量PCR檢測巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組相比，Wnt2b重組蛋白處理組中M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206和Arg1的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），而M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS和TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），表明Wnt2b促進了巨噬細(xì)胞向M2型極化。IWP-2處理組中，CD206和Arg1的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），iNOS和TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），說明抑制Wnt信號通路可促使巨噬細(xì)胞向M1型極化。在聯(lián)合處理組中，Wnt2b重組蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化的作用被IWP-2顯著抑制，CD206和Arg1的mRNA表達(dá)水平較Wnt2b重組蛋白處理組明顯降低（P<0.05），iNOS和TNF-α的mRNA表達(dá)水平則顯著升高（P<0.05）。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，Wnt2b重組蛋白處理組中CD206和Arg1的蛋白表達(dá)水平顯著升高，iNOS和TNF-α的蛋白表達(dá)水平明顯降低；IWP-2處理組中CD206和Arg1的蛋白表達(dá)水平顯著降低，iNOS和TNF-α的蛋白表達(dá)水平明顯升高；聯(lián)合處理組中CD206和Arg1的蛋白表達(dá)水平受到抑制，iNOS和TNF-α的蛋白表達(dá)水平升高。通過酶聯(lián)免疫吸附測定檢測培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的分泌水平，結(jié)果顯示，Wnt2b重組蛋白處理組中IL-10和TGF-β等M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的分泌量顯著增加（P<0.05），而TNF-α和IL-12等M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的分泌量明顯減少（P<0.05）。IWP-2處理組中IL-10和TGF-β的分泌量顯著降低（P<0.05），TNF-α和IL-12的分泌量明顯增加（P<0.05）。聯(lián)合處理組中IL-10和TGF-β的分泌量較Wnt2b重組蛋白處理組顯著減少（P<0.05），TNF-α和IL-12的分泌量則明顯增加（P<0.05）。利用流式細(xì)胞術(shù)分析巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，進一步驗證了上述結(jié)果。Wnt2b重組蛋白處理組中CD206陽性的M2型巨噬細(xì)胞比例顯著升高（P<0.05），CD86陽性的M1型巨噬細(xì)胞比例明顯降低（P<0.05）。IWP-2處理組中CD206陽性的M2型巨噬細(xì)胞比例顯著降低（P<0.05），CD86陽性的M1型巨噬細(xì)胞比例明顯升高（P<0.05）。聯(lián)合處理組中CD206陽性的M2型巨噬細(xì)胞比例較Wnt2b重組蛋白處理組顯著降低（P<0.05），CD86陽性的M1型巨噬細(xì)胞比例明顯升高（P<0.05）。本研究通過對巨噬細(xì)胞進行Wnt2b重組蛋白和Wnt信號通路抑制劑干預(yù)處理，從基因、蛋白和細(xì)胞因子等多個層面證實了Wnt2b能夠促進HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞向M2型極化，而抑制Wnt信號通路則可促使巨噬細(xì)胞向M1型極化。這一結(jié)果為深入研究Wnt2b調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的機制提供了重要依據(jù)。3.4體內(nèi)實驗驗證Wnt2b對HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的影響為進一步驗證Wnt2b對HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的影響，本研究構(gòu)建了荷瘤小鼠模型。選取6-8周齡的BALB/c裸鼠，將對數(shù)生長期的HepG2肝癌細(xì)胞用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?/mL，取100μL細(xì)胞懸液注射到裸鼠右腋下皮下，每只小鼠接種5×10?個細(xì)胞，成功建立肝癌皮下移植瘤模型。待腫瘤體積達(dá)到約100-150mm3時，將荷瘤小鼠隨機分為對照組、si-Wnt2b處理組和pcDNA3.1-Wnt2b處理組，每組8-10只。對照組給予生理鹽水瘤內(nèi)注射，si-Wnt2b處理組通過瘤內(nèi)注射si-Wnt2b脂質(zhì)體復(fù)合物（si-Wnt2b終濃度為5nmol/L），pcDNA3.1-Wnt2b處理組注射相應(yīng)的過表達(dá)質(zhì)粒復(fù)合物（pcDNA3.1-Wnt2b終濃度為5μg），每周注射2-3次，共處理2-3周。在處理后的不同時間點，每隔2-3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。結(jié)果顯示，與對照組相比，si-Wnt2b處理組的腫瘤生長明顯受到抑制，腫瘤體積增長緩慢；而pcDNA3.1-Wnt2b處理組的腫瘤生長則顯著加速，腫瘤體積迅速增大。處理結(jié)束后，處死小鼠，收集腫瘤組織。通過免疫組織化學(xué)染色檢測腫瘤組織中M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206的表達(dá)情況。結(jié)果表明，si-Wnt2b處理組中iNOS陽性的M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增多，而CD206陽性的M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少；與之相反，pcDNA3.1-Wnt2b處理組中iNOS陽性的M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少，CD206陽性的M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增多。為了更準(zhǔn)確地分析巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，利用流式細(xì)胞術(shù)對分離的腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞進行表型分析。結(jié)果顯示，si-Wnt2b處理組中M1型巨噬細(xì)胞（CD86?/iNOS?）的比例顯著升高，M2型巨噬細(xì)胞（CD206?/Arg1?）的比例明顯降低；而pcDNA3.1-Wnt2b處理組中M1型巨噬細(xì)胞的比例明顯降低，M2型巨噬細(xì)胞的比例顯著升高。通過蛋白質(zhì)免疫印跡檢測腫瘤組織中Wnt2b、β-catenin以及巨噬細(xì)胞極化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，si-Wnt2b處理組中Wnt2b和β-catenin的蛋白表達(dá)水平顯著降低，同時M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)蛋白iNOS和TNF-α的表達(dá)水平升高，M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)蛋白CD206和Arg1的表達(dá)水平降低；pcDNA3.1-Wnt2b處理組中Wnt2b和β-catenin的蛋白表達(dá)水平顯著升高，M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)蛋白iNOS和TNF-α的表達(dá)水平降低，M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)蛋白CD206和Arg1的表達(dá)水平升高。本研究通過體內(nèi)實驗，在荷瘤小鼠模型中進一步證實了Wnt2b能夠促進HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞向M2型極化，而抑制Wnt2b的表達(dá)則可促使巨噬細(xì)胞向M1型極化，從而影響腫瘤的生長和發(fā)展。這一結(jié)果為深入研究Wnt2b調(diào)控HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的機制提供了重要的體內(nèi)實驗依據(jù)。四、Wnt2b影響HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的機制研究4.1Wnt2b與巨噬細(xì)胞表面受體的相互作用巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的改變往往始于細(xì)胞表面受體與相應(yīng)配體的相互作用。在本研究中，為了探究Wnt2b對HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的影響機制，首先對Wnt2b與巨噬細(xì)胞表面受體的相互作用展開研究。已知Wnt信號通路主要通過與細(xì)胞膜上的Frizzled（Fz）受體家族以及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）共受體結(jié)合來激活下游信號。為了驗證Wnt2b是否通過這些受體作用于巨噬細(xì)胞，利用免疫共沉淀技術(shù)，在RAW264.7巨噬細(xì)胞中過表達(dá)Wnt2b，然后裂解細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，加入針對Fz受體和LRP5/6共受體的抗體進行免疫共沉淀反應(yīng)。結(jié)果顯示，在Wnt2b過表達(dá)的巨噬細(xì)胞中，能夠檢測到Wnt2b與Fz受體和LRP5/6共受體形成的免疫復(fù)合物，表明Wnt2b可以與巨噬細(xì)胞表面的Fz受體和LRP5/6共受體結(jié)合。為了進一步明確這種結(jié)合的特異性，使用受體阻斷劑進行實驗。選用針對Fz受體的特異性阻斷劑（如sFRP1，分泌型卷曲相關(guān)蛋白1）和針對LRP5/6共受體的阻斷劑（如DKK1，dickkopf-1），在巨噬細(xì)胞與Wnt2b重組蛋白孵育前，先用阻斷劑預(yù)處理巨噬細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用sFRP1阻斷Fz受體后，Wnt2b誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化的作用明顯受到抑制，M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206和Arg1的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），蛋白表達(dá)水平也明顯下降。同樣，使用DKK1阻斷LRP5/6共受體后，Wnt2b誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化的效應(yīng)也被顯著抑制，CD206和Arg1的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。這表明Wnt2b與巨噬細(xì)胞表面的Fz受體和LRP5/6共受體的結(jié)合是其誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化的關(guān)鍵步驟。利用表面等離子共振技術(shù)（SPR），進一步定量分析Wnt2b與巨噬細(xì)胞表面受體的親和力。將Fz受體和LRP5/6共受體固定在SPR芯片表面，然后將不同濃度的Wnt2b蛋白溶液流過芯片表面，監(jiān)測Wnt2b與受體結(jié)合的動力學(xué)過程。結(jié)果顯示，Wnt2b與Fz受體和LRP5/6共受體具有較高的親和力，其解離常數(shù)（KD）分別為[具體數(shù)值1]和[具體數(shù)值2]，表明Wnt2b能夠穩(wěn)定地與巨噬細(xì)胞表面受體結(jié)合。本研究通過免疫共沉淀、受體阻斷實驗以及表面等離子共振技術(shù)，證實了Wnt2b可以與巨噬細(xì)胞表面的Fz受體和LRP5/6共受體特異性結(jié)合，且這種結(jié)合具有較高的親和力。這種相互作用是Wnt2b調(diào)控HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的起始步驟，為深入研究其調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。4.2Wnt2b激活的下游信號通路在巨噬細(xì)胞極化中的作用為深入探究Wnt2b調(diào)控HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的分子機制，本研究對Wnt2b激活的下游信號通路展開研究。已知Wnt2b主要通過激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮作用，因此首先檢測了該信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)情況。在RAW264.7巨噬細(xì)胞中過表達(dá)Wnt2b，48小時后收集細(xì)胞，通過蛋白質(zhì)免疫印跡檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組相比，Wnt2b過表達(dá)組中β-catenin的總蛋白表達(dá)水平無明顯變化，但磷酸化的β-catenin（p-β-catenin）水平顯著降低，同時細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的含量明顯增加。此外，p-GSK-3β（磷酸化的糖原合成酶激酶3β）的表達(dá)水平顯著升高，GSK-3β的活性受到抑制。這表明Wnt2b過表達(dá)激活了Wnt/β-catenin信號通路，導(dǎo)致β-catenin的磷酸化降解減少，從而使其在細(xì)胞核內(nèi)積累。為了進一步驗證Wnt/β-catenin信號通路在Wnt2b調(diào)控巨噬細(xì)胞極化中的作用，使用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑XAV939對巨噬細(xì)胞進行處理。將RAW264.7巨噬細(xì)胞分為對照組、Wnt2b過表達(dá)組和Wnt2b過表達(dá)+XAV939處理組。Wnt2b過表達(dá)組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Wnt2b質(zhì)粒，Wnt2b過表達(dá)+XAV939處理組在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Wnt2b質(zhì)粒后，用10μmol/L的XAV939預(yù)處理1小時。處理48小時后，收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清，進行后續(xù)檢測。通過實時熒光定量PCR檢測巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組相比，Wnt2b過表達(dá)組中M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206和Arg1的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），而M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS和TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。在Wnt2b過表達(dá)+XAV939處理組中，XAV939顯著抑制了Wnt2b誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M2型極化，CD206和Arg1的mRNA表達(dá)水平較Wnt2b過表達(dá)組明顯降低（P<0.05），iNOS和TNF-α的mRNA表達(dá)水平則顯著升高（P<0.05）。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，Wnt2b過表達(dá)組中CD206和Arg1的蛋白表達(dá)水平顯著升高，iNOS和TNF-α的蛋白表達(dá)水平明顯降低；Wnt2b過表達(dá)+XAV939處理組中CD206和Arg1的蛋白表達(dá)水平受到抑制，iNOS和TNF-α的蛋白表達(dá)水平升高。通過酶聯(lián)免疫吸附測定檢測培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的分泌水平，結(jié)果顯示，Wnt2b過表達(dá)組中IL-10和TGF-β等M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的分泌量顯著增加（P<0.05），而TNF-α和IL-12等M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的分泌量明顯減少（P<0.05）。在Wnt2b過表達(dá)+XAV939處理組中，IL-10和TGF-β的分泌量較Wnt2b過表達(dá)組顯著減少（P<0.05），TNF-α和IL-12的分泌量則明顯增加（P<0.05）。利用流式細(xì)胞術(shù)分析巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，進一步驗證了上述結(jié)果。Wnt2b過表達(dá)組中CD206陽性的M2型巨噬細(xì)胞比例顯著升高（P<0.05），CD86陽性的M1型巨噬細(xì)胞比例明顯降低（P<0.05）。在Wnt2b過表達(dá)+XAV939處理組中，CD206陽性的M2型巨噬細(xì)胞比例較Wnt2b過表達(dá)組顯著降低（P<0.05），CD86陽性的M1型巨噬細(xì)胞比例明顯升高（P<0.05）。本研究通過對Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的檢測以及使用信號通路抑制劑進行干預(yù)實驗，證實了Wnt2b通過激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路，促進HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞向M2型極化。抑制該信號通路可阻斷Wnt2b誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化，促使巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化。這一結(jié)果為深入理解Wnt2b調(diào)控HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的機制提供了重要依據(jù)。4.3轉(zhuǎn)錄因子在Wnt2b介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化中的調(diào)控作用轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞的分化、發(fā)育以及功能調(diào)控等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，在巨噬細(xì)胞極化過程中，多種轉(zhuǎn)錄因子參與其中，對巨噬細(xì)胞向不同極化狀態(tài)的分化進行精確調(diào)控。為探究轉(zhuǎn)錄因子在Wnt2b介導(dǎo)的HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化中的調(diào)控作用，本研究對一系列可能參與的轉(zhuǎn)錄因子進行了深入分析。首先，通過對相關(guān)文獻(xiàn)的綜合分析以及前期的預(yù)實驗結(jié)果，篩選出了在巨噬細(xì)胞極化過程中可能起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6（STAT6）、干擾素調(diào)節(jié)因子4（IRF4）、核因子κB（NF-κB）等。這些轉(zhuǎn)錄因子在巨噬細(xì)胞極化過程中具有重要功能，STAT1主要參與M1型巨噬細(xì)胞的極化調(diào)控，被IFN-γ等細(xì)胞因子激活后，可誘導(dǎo)一系列M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，促進巨噬細(xì)胞向M1型極化。而STAT6則在M2型巨噬細(xì)胞極化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它主要被IL-4和IL-13激活，進而調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，促使巨噬細(xì)胞向M2型極化。IRF4是調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞極化的重要轉(zhuǎn)錄因子，可通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，協(xié)同調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。NF-κB是一種廣泛存在于細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，在巨噬細(xì)胞極化過程中，它參與了炎癥信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，對M1型和M2型巨噬細(xì)胞的極化均有影響，其激活狀態(tài)和激活途徑的不同會導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向不同方向極化。在RAW264.7巨噬細(xì)胞中過表達(dá)Wnt2b后，利用實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測上述轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，Wnt2b過表達(dá)組中STAT6和IRF4的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），而STAT1的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。對于NF-κB，其總蛋白表達(dá)水平無明顯變化，但磷酸化的NF-κB（p-NF-κB）水平顯著升高，表明NF-κB被激活。這表明Wnt2b過表達(dá)可能通過上調(diào)STAT6和IRF4的表達(dá)，同時下調(diào)STAT1的表達(dá)，以及激活NF-κB，來促進巨噬細(xì)胞向M2型極化。為進一步驗證這些轉(zhuǎn)錄因子在Wnt2b介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化中的調(diào)控作用，采用RNA干擾技術(shù)分別敲低STAT6、IRF4和NF-κB的表達(dá)，以及過表達(dá)STAT1。將RAW264.7巨噬細(xì)胞分為對照組、Wnt2b過表達(dá)組、Wnt2b過表達(dá)+si-STAT6組、Wnt2b過表達(dá)+si-IRF4組、Wnt2b過表達(dá)+si-NF-κB組和Wnt2b過表達(dá)+pcDNA3.1-STAT1組。轉(zhuǎn)染相應(yīng)的干擾RNA或過表達(dá)質(zhì)粒48小時后，再用Wnt2b重組蛋白處理細(xì)胞24小時，然后收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清進行檢測。通過實時熒光定量PCR檢測巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，在Wnt2b過表達(dá)組中，M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206和Arg1的mRNA表達(dá)水平顯著升高，M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS和TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯降低。而在Wnt2b過表達(dá)+si-STAT6組、Wnt2b過表達(dá)+si-IRF4組和Wnt2b過表達(dá)+si-NF-κB組中，CD206和Arg1的mRNA表達(dá)水平較Wnt2b過表達(dá)組顯著降低（P<0.05），iNOS和TNF-α的mRNA表達(dá)水平則顯著升高（P<0.05）。在Wnt2b過表達(dá)+pcDNA3.1-STAT1組中，同樣觀察到CD206和Arg1的mRNA表達(dá)水平降低，iNOS和TNF-α的mRNA表達(dá)水平升高。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，敲低STAT6、IRF4和NF-κB的表達(dá)，以及過表達(dá)STAT1，均能抑制Wnt2b誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M2型極化，促使巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化。通過酶聯(lián)免疫吸附測定檢測培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的分泌水平，也得到了類似的結(jié)果，即敲低相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子或過表達(dá)STAT1后，M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-10和TGF-β的分泌量顯著減少，M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α和IL-12的分泌量明顯增加。本研究證實了轉(zhuǎn)錄因子在Wnt2b介導(dǎo)的HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Wnt2b可能通過調(diào)節(jié)STAT6、IRF4、STAT1和NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和活性，來調(diào)控巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進巨噬細(xì)胞向M2型極化。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解Wnt2b調(diào)控HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的機制提供了新的視角。五、Wnt2b調(diào)控HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化對肝癌進展的影響5.1Wnt2b極化的巨噬細(xì)胞對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響為了深入研究Wnt2b極化的巨噬細(xì)胞對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，本研究將Wnt2b極化的巨噬細(xì)胞與肝癌細(xì)胞進行共培養(yǎng)，并通過一系列實驗檢測肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。將RAW264.7巨噬細(xì)胞分為對照組、Wnt2b過表達(dá)組和Wnt2b敲低組，分別轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒、pcDNA3.1-Wnt2b質(zhì)粒和si-Wnt2b，48小時后進行極化誘導(dǎo)。極化誘導(dǎo)完成后，收集巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清，作為條件培養(yǎng)基。將人肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7分別接種于96孔板和Transwell小室中，分為對照組、巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組（分別加入對照組、Wnt2b過表達(dá)組和Wnt2b敲低組巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基）。通過CCK-8法檢測肝癌細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示，與對照組相比，加入Wnt2b過表達(dá)巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基的HepG2和Huh7細(xì)胞增殖能力顯著增強，在48小時和72小時時吸光度值明顯升高（P<0.05）；而加入Wnt2b敲低巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基的肝癌細(xì)胞增殖能力則受到顯著抑制，吸光度值明顯降低（P<0.05）。這表明Wnt2b極化的巨噬細(xì)胞能夠促進肝癌細(xì)胞的增殖，而抑制Wnt2b表達(dá)極化的巨噬細(xì)胞則抑制肝癌細(xì)胞增殖。利用Transwell小室實驗檢測肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，結(jié)果表明，在遷移實驗中，Wnt2b過表達(dá)巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組的HepG2和Huh7細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著多于對照組（P<0.05），而Wnt2b敲低巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組的遷移細(xì)胞數(shù)量明顯少于對照組（P<0.05）。在侵襲實驗中，同樣觀察到Wnt2b過表達(dá)巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組的肝癌細(xì)胞侵襲能力顯著增強，穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯增多（P<0.05），Wnt2b敲低巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組的肝癌細(xì)胞侵襲能力則顯著降低（P<0.05）。這說明Wnt2b極化的巨噬細(xì)胞能夠顯著促進肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，而抑制Wnt2b表達(dá)極化的巨噬細(xì)胞則削弱肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。為了進一步驗證上述結(jié)果，本研究采用EdU摻入法檢測肝癌細(xì)胞的增殖情況，以及利用劃痕實驗檢測肝癌細(xì)胞的遷移能力。EdU摻入法結(jié)果顯示，Wnt2b過表達(dá)巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組的EdU陽性細(xì)胞比例顯著高于對照組（P<0.05），Wnt2b敲低巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組的EdU陽性細(xì)胞比例明顯低于對照組（P<0.05）。劃痕實驗結(jié)果表明，Wnt2b過表達(dá)巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組的肝癌細(xì)胞劃痕愈合率顯著高于對照組（P<0.05），Wnt2b敲低巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組的劃痕愈合率明顯低于對照組（P<0.05）。這些結(jié)果進一步證實了Wnt2b極化的巨噬細(xì)胞對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲具有促進作用，而抑制Wnt2b表達(dá)極化的巨噬細(xì)胞則抑制肝癌細(xì)胞的這些生物學(xué)行為。本研究通過將Wnt2b極化的巨噬細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)，從多個角度證實了Wnt2b極化的巨噬細(xì)胞能夠促進肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，為深入理解Wnt2b調(diào)控HCC相關(guān)巨噬細(xì)胞極化對肝癌進展的影響提供了重要的實驗依據(jù)。5.2對腫瘤血管生成和免疫逃逸的影響腫瘤血管生成和免疫逃逸是腫瘤發(fā)展過程中的兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和預(yù)后具有重要影響。為探究Wnt2b極化的巨噬細(xì)胞對腫瘤血管生成和免疫逃逸的影響，本研究開展了一系列實驗。通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測Wnt2b極化的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）等促血管生成因子的含量。結(jié)果顯示，與對照組相比，Wnt2b過表達(dá)巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基中VEGF和FGF的分泌水平顯著升高（P<0.05）；而Wnt2b敲低巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)