中藥二步序貫治療對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥與重塑模型的影響：機(jī)制與展望VIP

中藥二步序貫治療對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥與重塑模型的影響：機(jī)制與展望一、引言1.1研究背景與意義1.1.1哮喘疾病現(xiàn)狀與危害哮喘作為一種常見(jiàn)的慢性炎癥性氣道疾病，在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈現(xiàn)出令人擔(dān)憂的上升趨勢(shì)。世界衛(wèi)生組織（WHO）數(shù)據(jù)顯示，全球約有3億人飽受哮喘的折磨，預(yù)計(jì)到2025年，這一數(shù)字將增長(zhǎng)至4億。在我國(guó)，哮喘的患病率也不容小覷，全國(guó)哮喘患病及相關(guān)危險(xiǎn)因素流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，2011年我國(guó)部分地區(qū)居民哮喘患病率已達(dá)1.02%，且近年來(lái)仍在持續(xù)攀升。哮喘的高發(fā)病率給患者及其家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)?；颊卟粌H要長(zhǎng)期忍受反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急、胸悶、咳嗽等癥狀，還可能面臨哮喘急性發(fā)作導(dǎo)致的呼吸衰竭甚至危及生命的風(fēng)險(xiǎn)。這些癥狀嚴(yán)重干擾了患者的日常生活、工作和學(xué)習(xí)，極大地降低了他們的生活質(zhì)量。哮喘還會(huì)導(dǎo)致患者反復(fù)急診就醫(yī)和住院治療，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年因哮喘急性發(fā)作而住院的患者數(shù)量眾多，這不僅給患者帶來(lái)了身體上的痛苦，也造成了巨大的醫(yī)療資源浪費(fèi)。長(zhǎng)期哮喘控制不佳還會(huì)引發(fā)一系列并發(fā)癥，如肺氣腫、肺心病等，進(jìn)一步加重患者的病情和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。1.1.2現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療哮喘的局限目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在哮喘治療方面主要依賴藥物治療，常用藥物包括支氣管舒張劑和抗炎藥等。支氣管舒張劑如短效β2受體激動(dòng)劑，雖能迅速舒張支氣管，緩解哮喘發(fā)作時(shí)的癥狀，但其作用持續(xù)時(shí)間較短，一般僅能維持4-6小時(shí)，且長(zhǎng)期應(yīng)用可能導(dǎo)致β2受體功能下調(diào)和氣道反應(yīng)性增高，使哮喘癥狀更難以控制。長(zhǎng)效β2受體激動(dòng)劑雖作用時(shí)間長(zhǎng)達(dá)12小時(shí)，且具有一定抗炎作用，但單獨(dú)使用效果不佳，需與吸入糖皮質(zhì)激素聯(lián)合應(yīng)用。吸入型糖皮質(zhì)激素是治療哮喘的主要藥物，能有效抗炎、降低氣道高反應(yīng)性，但長(zhǎng)期使用可能會(huì)引起咽部疼痛、真菌感染等局部不良反應(yīng)，對(duì)于中、重度哮喘患者，若長(zhǎng)期大劑量使用，還可能出現(xiàn)全身副作用，如體重增加、血糖增高、骨質(zhì)疏松等?？诜瞧べ|(zhì)激素雖作用較強(qiáng)，但長(zhǎng)期服用的副作用更為明顯，如導(dǎo)致體重增加、血糖增高、骨質(zhì)疏松、降低免疫力、低鉀血癥等。白三烯調(diào)節(jié)劑單獨(dú)應(yīng)用僅適用于輕度哮喘，對(duì)于中、重度哮喘患者，需聯(lián)合糖皮質(zhì)激素使用。此外，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療哮喘往往難以從根本上解決問(wèn)題，許多患者在停藥后容易復(fù)發(fā)，需要長(zhǎng)期甚至終身服藥，給患者帶來(lái)了極大的不便和經(jīng)濟(jì)壓力。1.1.3中藥二步序貫治療的應(yīng)用前景中藥二步序貫治療是一種中醫(yī)特有的治療方法，它根據(jù)哮喘的發(fā)病特點(diǎn)和病情變化，分階段、有針對(duì)性地運(yùn)用中藥進(jìn)行治療。在哮喘發(fā)作期，以祛風(fēng)化痰、活血祛瘀等方藥來(lái)緩解癥狀，減輕氣道炎癥；在緩解期，則以補(bǔ)腎益氣為主要治療目的，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，預(yù)防哮喘復(fù)發(fā)。這種治療方法強(qiáng)調(diào)個(gè)體化治療，根據(jù)患者的具體病因病機(jī)和病情變化，靈活選用中藥復(fù)方和單味中藥，以達(dá)到最佳治療效果。與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療相比，中藥二步序貫治療具有多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢(shì)，能夠從多個(gè)環(huán)節(jié)干預(yù)哮喘的發(fā)病機(jī)制，不僅可以緩解哮喘癥狀，還能改善患者的體質(zhì)，提高機(jī)體免疫力，減少哮喘的復(fù)發(fā)。中藥的副作用相對(duì)較小，患者更容易接受長(zhǎng)期治療。因此，中藥二步序貫治療在哮喘治療中展現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景，為哮喘的治療提供了新的思路和方法，有望成為攻克哮喘治療難題的重要手段。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究中藥二步序貫治療對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥與重塑模型的影響，并初步探討其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用中藥二步序貫治療哮喘提供更堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。具體而言，一是通過(guò)建立哮喘小鼠氣道炎癥與重塑模型，比較中藥二步序貫治療組與單一中藥治療組、模型組、正常組在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥因子水平、氣道重塑相關(guān)指標(biāo)等方面的差異，明確中藥二步序貫治療在減輕哮喘小鼠氣道炎癥與抑制氣道重塑方面的效果；二是運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法，分析中藥二步序貫治療中各中藥成分之間的相互作用以及它們對(duì)哮喘相關(guān)信號(hào)通路的影響，初步揭示其治療哮喘的潛在分子機(jī)制。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，本研究創(chuàng)新性地采用了酸堿酸法制備氣管灌注過(guò)敏原誘發(fā)哮喘模型，這種方法相較于傳統(tǒng)的哮喘模型制備方法，能夠更精準(zhǔn)地模擬人類哮喘的發(fā)病過(guò)程，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具臨床參考價(jià)值。在指標(biāo)選取上，本研究不僅關(guān)注了常見(jiàn)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥因子水平等指標(biāo)，還納入了肺靜態(tài)壓力-容積曲線、肺彈性回縮等能夠更全面反映氣道功能和結(jié)構(gòu)變化的指標(biāo)，為深入研究中藥二步序貫治療對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥與重塑的影響提供了更豐富的數(shù)據(jù)支持。在研究方法上，將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法相結(jié)合，從整體和分子水平全面探討中藥二步序貫治療的作用機(jī)制，為中藥治療哮喘的機(jī)制研究提供了新的思路和方法。二、文獻(xiàn)綜述2.1哮喘的發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展哮喘作為一種復(fù)雜的慢性炎癥性氣道疾病，其發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)方面，至今尚未完全闡明。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展，對(duì)于哮喘發(fā)病機(jī)制的研究取得了顯著進(jìn)展。炎癥細(xì)胞在哮喘的發(fā)病過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞是氣道炎癥反應(yīng)的始動(dòng)細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體接觸變應(yīng)原后，肥大細(xì)胞表面的IgE受體與變應(yīng)原特異性結(jié)合，促使肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺（His）、白三烯（LTs）等炎癥介質(zhì)，這些介質(zhì)可迅速引起速發(fā)相哮喘反應(yīng)（IAR），表現(xiàn)為氣道平滑肌痙攣、血管通透性增加等癥狀。而在IAR后數(shù)小時(shí)，遲發(fā)相哮喘反應(yīng)（LAR）更為重要的非特異性慢性炎癥過(guò)程逐漸啟動(dòng)，此時(shí)多種炎癥細(xì)胞被募集到氣道。嗜酸性細(xì)胞是哮喘氣道炎癥的特征性細(xì)胞，其在氣道內(nèi)大量浸潤(rùn)，釋放LTs、血小板激活因子（PAF）、堿性蛋白等，這些物質(zhì)不僅能誘發(fā)氣道炎癥，還會(huì)對(duì)氣道上皮造成毒性作用，導(dǎo)致上皮細(xì)胞損傷脫落，進(jìn)而增加氣道高反應(yīng)性（BHR）。中性粒細(xì)胞在某些類型的哮喘，如職業(yè)性哮喘中，可能通過(guò)釋放髓過(guò)氧化物酶等物質(zhì)參與炎癥過(guò)程。血小板可通過(guò)IgE依賴機(jī)制激活，釋放5-羥色***、血栓烷和脂氧合酶產(chǎn)物等，參與氣道的炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞不僅能處理抗原，還能分泌大量具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，釋放多種補(bǔ)體成分、促凝或抗凝物質(zhì)、蛋白酶、脂酶、DNA酶、金屬蛋白酶、超氧化物、過(guò)氧化氫、一氧化氮等炎癥介質(zhì)，造成廣泛的組織損傷。樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）作為功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，能夠攝取、加工抗原，并將其呈遞給T細(xì)胞，同時(shí)提供T細(xì)胞活化所需的刺激信號(hào)，影響Th0細(xì)胞分化方向，在維持氣道局部炎癥中起重要作用。淋巴細(xì)胞尤其是Th細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中起重要調(diào)控作用，支氣管活檢及外周血和支氣管肺泡灌洗液（BALF）中CD+4淋巴細(xì)胞增多，急性發(fā)作時(shí)外周血CD+4淋巴細(xì)胞激活標(biāo)志增多，免疫組化及BALF中CD+4淋巴細(xì)胞對(duì)HLA-DR表達(dá)增強(qiáng)，去除CD+4淋巴細(xì)胞后可明顯抑制嗜酸性粒細(xì)胞（Eos）的聚集和BHR，激活的Tc通過(guò)其細(xì)胞因子，如IL-3、IL-5等，參與哮喘的慢性炎癥反應(yīng)，促使Eos趨化增殖、分化及功能激活，從而加強(qiáng)氣道組織中Eos的致炎作用。炎癥介質(zhì)在哮喘發(fā)病機(jī)制中也起著不可或缺的作用。組胺是最早被認(rèn)識(shí)的炎癥介質(zhì)之一，它能引起支氣管平滑肌收縮、血管擴(kuò)張和通透性增加，導(dǎo)致氣道水腫和黏液分泌增多。白三烯包括LTC4、LTD4和LTE4等，其收縮支氣管平滑肌的作用比組胺強(qiáng)100-1000倍，還能促進(jìn)炎癥細(xì)胞的趨化和聚集，增加血管通透性。血小板激活因子可引起血小板聚集、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的趨化和脫顆粒，增強(qiáng)氣道炎癥反應(yīng)。細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素（IL）家族中的IL-4、IL-5、IL-13等在哮喘發(fā)病中具有重要作用，IL-4可促進(jìn)Th2細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)IgE的合成；IL-5能選擇性地促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和活化；IL-13可誘導(dǎo)氣道高反應(yīng)性、黏液分泌增加和氣道重塑。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）能激活炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放，加重氣道炎癥。免疫失衡是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制之一。正常情況下，機(jī)體的免疫反應(yīng)處于Th1/Th2平衡狀態(tài)，Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫，抵御感染；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子，參與體液免疫，在哮喘患者中，這種平衡被打破，Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)，Th1細(xì)胞功能相對(duì)不足，導(dǎo)致Th2型細(xì)胞因子分泌增多，促進(jìn)IgE的合成和嗜酸性粒細(xì)胞的活化、聚集，引發(fā)哮喘的一系列癥狀。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是一類具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，在維持免疫耐受和免疫平衡中發(fā)揮重要作用，哮喘患者體內(nèi)Treg細(xì)胞數(shù)量減少或功能缺陷，無(wú)法有效抑制Th2細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致哮喘的發(fā)生發(fā)展。輔助性T細(xì)胞17（Th17）細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子IL-17在哮喘的發(fā)病中也起到重要作用，IL-17可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等分泌多種促炎細(xì)胞因子和趨化因子，招募中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞到氣道，加重氣道炎癥。2.2中藥治療哮喘的研究現(xiàn)狀2.2.1單味中藥治療哮喘的研究成果近年來(lái)，眾多學(xué)者對(duì)單味中藥治療哮喘展開(kāi)了深入研究，在實(shí)驗(yàn)和臨床領(lǐng)域均取得了豐碩成果。在實(shí)驗(yàn)研究方面，川芎嗪作為川芎的主要有效成分，被證實(shí)具有顯著的抗哮喘作用。通過(guò)哮喘大鼠腹腔注射川芎嗪的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其可以抑制哮喘大鼠IL-4和IL-5等Th2型細(xì)胞因子合成，增加IFN-γ等Th1型細(xì)胞因子的合成。其作用機(jī)制可能是下調(diào)GATA-3、上調(diào)T-bet在肺組織的表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子GATA-3/T-bet進(jìn)而調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子比例，從而扭轉(zhuǎn)哮喘時(shí)的Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)，改善相應(yīng)炎性癥狀。在OVA誘導(dǎo)小鼠哮喘模型中，川芎嗪還能增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能，增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而抑制Th17細(xì)胞的數(shù)量以及功能，減輕Th17細(xì)胞的應(yīng)答，降低IL-17細(xì)胞因子的分泌，從而預(yù)防或控制哮喘發(fā)作。銀杏葉總黃酮是銀杏葉治療哮喘的主要有效成分，能夠降低支氣管肺泡灌洗液中IL-4的含量，使血漿IgE水平降低，升高細(xì)胞因子IFN-γ水平，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡。給予銀杏葉總黃酮灌胃后，哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞顯著減少；支氣管肺泡灌洗液中IL-4含量降低，IFN-γ含量增高，IL-4/IFN-γ比例有所恢復(fù)；血清中IgE含量與OVA特異性IgE含量顯著降低；同時(shí)，肺組織中GATA-3的過(guò)度表達(dá)得到抑制。臨床研究也充分驗(yàn)證了單味中藥治療哮喘的有效性。殷凱生等觀察60例哮喘患者，隨機(jī)給予常規(guī)治療或常規(guī)加川芎嗪聯(lián)合治療，結(jié)果表明川芎嗪能夠增加哮喘患者T-betmRNA的表達(dá)，同時(shí)抑制GATA-3mRNA的表達(dá)。川芎嗪干預(yù)后，哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源的淋巴細(xì)胞中IFN-γ蛋白含量增加，IL-4蛋白含量則明顯降低，提示川芎嗪可能通過(guò)增強(qiáng)Thl介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，抑制Th2介導(dǎo)的體液免疫，糾正Thl/Th2細(xì)胞因子平衡，達(dá)到治療哮喘的目的。李曉君等將98例支氣管哮喘患者隨機(jī)分為2組，均給予吸氧、通暢呼吸道、抗生素及糖皮質(zhì)激素等治療，在此基礎(chǔ)上治療組加用川芎嗪靜滴，結(jié)果對(duì)照組顯效8例，有效24例，無(wú)效16例，總有效率67％；治療組顯效18例，有效25例，無(wú)效7例，總有效率86％。涂喜漢用川芎嗪治療支氣管哮喘持續(xù)狀態(tài)患者50例，結(jié)果治療組總有效率96.0％，對(duì)照組74.0％，其療效顯著優(yōu)于常規(guī)用氨茶堿的對(duì)照組。這些研究表明，單味中藥在哮喘治療中具有一定的潛力，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥等多種機(jī)制發(fā)揮治療作用。2.2.2中藥復(fù)方治療哮喘的研究成果中藥復(fù)方治療哮喘具有多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)受到了廣泛關(guān)注，相關(guān)研究也取得了眾多成果。麻杏石甘湯作為經(jīng)典的中藥復(fù)方，適用于濕熱內(nèi)蘊(yùn)、氣滯痰閉型哮喘?，F(xiàn)代研究表明，其主要成分麻黃中的麻黃堿具有支氣管舒張作用，可松弛支氣管平滑肌，緩解氣道梗阻，改善呼吸困難；還能抑制肥大細(xì)胞釋放組胺等致炎介質(zhì)，降低氣道炎癥反應(yīng)，減少喘息癥狀。杏仁中的苦杏仁苷在體內(nèi)可分解產(chǎn)生氫酸和苯甲醛，氫酸對(duì)呼吸中樞有一定的抑制作用，能使呼吸運(yùn)動(dòng)趨于安靜而止咳平喘。石膏主要含硫酸鈣，具有清熱瀉火的作用，可減輕哮喘患者的肺熱癥狀。甘草中的甘草甜素等成分具有抗炎、抗過(guò)敏作用，能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)其他藥物的療效。這些成分相互協(xié)同，共同發(fā)揮清熱宣肺、止咳平喘的功效，有效緩解哮喘癥狀。復(fù)方甘草酸苷也是一種常用的治療哮喘的中藥復(fù)方，由甘草酸、甘草甜素、倍半萜烯皂苷組成，具有顯著的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。一項(xiàng)研究顯示，復(fù)方甘草酸苷治療哮喘患者8周后，肺功能指標(biāo)明顯改善，氣道炎癥標(biāo)志物IL-4、IL-5、IL-13顯著下降。其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制炎性因子釋放，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，如抑制促炎免疫細(xì)胞（如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞）的活化和脫顆粒，同時(shí)促進(jìn)抗炎免疫細(xì)胞（如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）的生成，維持免疫穩(wěn)態(tài)。還具有抗氧化作用，其含有的黃酮類、酚酸類等抗氧化劑，可清除自由基，減少氧化應(yīng)激對(duì)氣道組織的損傷，從而減緩炎癥進(jìn)程。中藥通氣膠囊由黃芪、黨參、白術(shù)、陳皮、茯苓組成，具有益氣健脾、燥濕化痰的功效，適用于哮喘患者。臨床研究顯示，中藥通氣膠囊治療哮喘患者12周后，肺功能指標(biāo)明顯改善，氣道炎癥標(biāo)志物IL-8、IL-1β、TNF-α顯著下降。黃芪中的黃芪多糖等成分可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，調(diào)節(jié)免疫功能；黨參能補(bǔ)中益氣，養(yǎng)血生津；白術(shù)具有健脾益氣、燥濕利水的作用；陳皮可理氣健脾、燥濕化痰；茯苓能利水滲濕、健脾寧心。這些藥物相互配伍，從整體上調(diào)節(jié)機(jī)體的氣血、臟腑功能，改善哮喘患者的體質(zhì)，減輕氣道炎癥，緩解哮喘癥狀。2.3中藥二步序貫治療哮喘的研究現(xiàn)狀2.3.1中藥二步序貫治療哮喘的臨床應(yīng)用案例在臨床實(shí)踐中，中藥二步序貫治療哮喘取得了一系列令人矚目的成功案例，為哮喘患者帶來(lái)了新的希望。例如，一項(xiàng)針對(duì)小兒支氣管哮喘患兒的研究中，選取了90例患兒作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。將其分為普通診療組以及中醫(yī)診療組，普通診療組采用常規(guī)的西醫(yī)方式進(jìn)行醫(yī)治，包括霧化吸入醫(yī)治、口服孟魯司特藥物以及必要時(shí)的給氧醫(yī)治；中醫(yī)診療組則在西醫(yī)治療的基礎(chǔ)上，使用中藥基本方進(jìn)行身體狀況調(diào)養(yǎng)，中藥組成成分主要有菟絲子，桂枝，白芍，五味子等。研究結(jié)果顯示，普通診療組患兒的醫(yī)治總有效率為72%，而中醫(yī)診療組的醫(yī)治總有效率高達(dá)90%。在副作用發(fā)生情況方面，普通診療組為17.6%，中醫(yī)診療組僅為5%。這表明中藥二步序貫治療在提高小兒支氣管哮喘患兒的治療成效方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，且副作用較小，安全性更高。在另一項(xiàng)研究中，納入了48例支氣管哮喘病患，將其均分為參照組和實(shí)驗(yàn)組。參照組實(shí)施常規(guī)西藥治療，對(duì)穩(wěn)定期病患予以沙美特羅氟替卡松粉吸入處理，若吸入無(wú)效則予以甲潑尼龍琥珀酸鈉靜脈滴注治療，并根據(jù)病患病情狀態(tài)酌情予以吸氧、靜脈注射氨茶堿、抗生素等藥物；針對(duì)發(fā)病期病患需采用以上藥物持續(xù)治療2周，針對(duì)緩解期病患需根據(jù)病患實(shí)際情況酌情減調(diào)整使用劑量。實(shí)驗(yàn)組實(shí)施中醫(yī)序貫療法治療，發(fā)作期基礎(chǔ)方劑由川芎15g、丹參15g、瓜蔞9g、蜜百部6g、蜜紫菀6g、冬花6g、姜半夏5g、陳皮6g、桃仁6g、炙麻黃3g組成，針對(duì)不同癥狀的病患進(jìn)行藥物加減；水煎服，口服，早晚各一次，每日一劑，持續(xù)治療14d。穩(wěn)定期及緩解期基礎(chǔ)方劑由山萸肉6g、生淮山藥25g、白術(shù)9g、茯苓15g、黃芪10g、黨參9g、天冬9g、麥冬9g、炒苦杏仁10g、蜜麻黃6g組成，針對(duì)不同癥狀的病患進(jìn)行藥物加減；煎服，口服，早晚服用，2日一劑，持續(xù)治療60d。穩(wěn)定期還采用浸泡中藥處理，水煎取汁，加入冰糖與蜂蜜收膏，制作成膏滋，水沖口服，每日兩次，持續(xù)治療60d。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組病患的FEV1/FVC、FEV1、FVC肺功能指標(biāo)改善情況明顯優(yōu)于參照組，兩組數(shù)據(jù)P＜0.05，比對(duì)差異大；實(shí)驗(yàn)組病患治療療效更優(yōu)，兩組數(shù)據(jù)P＜0.05，比對(duì)差異大。這充分證明了中藥二步序貫治療能夠有效改善支氣管哮喘病患的肺功能指標(biāo)，提升治療效果。這些臨床案例表明，中藥二步序貫治療根據(jù)哮喘患者不同階段的病情特點(diǎn)，針對(duì)性地運(yùn)用中藥進(jìn)行治療，能夠更好地調(diào)節(jié)機(jī)體功能，減輕氣道炎癥，緩解哮喘癥狀，提高患者的生活質(zhì)量，在哮喘治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。2.3.2中藥二步序貫治療哮喘的作用機(jī)制研究近年來(lái)，關(guān)于中藥二步序貫治療哮喘作用機(jī)制的研究取得了一定的進(jìn)展，為深入理解其治療效果提供了理論基礎(chǔ)。從免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的角度來(lái)看，中藥二步序貫治療能夠通過(guò)多種途徑對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響。在一項(xiàng)關(guān)于人參五味子湯加小青龍湯對(duì)哮喘小鼠作用的研究中，以卵清蛋白腹腔注射并霧化吸入制備小鼠哮喘模型，然后先后予以人參五味子湯加小青龍湯對(duì)哮喘小鼠進(jìn)行治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哮喘模型胃飼中藥組血清中卵蛋白干粉劑(OVA)IgE水平、GATA-3表達(dá)水平較哮喘模型組明顯降低。這表明該中藥二步序貫治療可能通過(guò)影響GATA-3表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，因?yàn)镚ATA-3是Th2細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)降低有助于調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，從而控制哮喘小鼠氣道炎癥。在哮喘患者中，Th1/Th2平衡失調(diào)，Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)，而中藥二步序貫治療可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)Th1細(xì)胞功能，抑制Th2細(xì)胞過(guò)度活化，減少Th2型細(xì)胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等的分泌，從而減輕氣道炎癥和過(guò)敏反應(yīng)。在炎癥信號(hào)通路方面，中藥二步序貫治療也展現(xiàn)出重要作用。中藥復(fù)方中的多種成分能夠抑制炎癥因子的釋放，阻斷炎癥信號(hào)傳導(dǎo)。一些中藥成分可以抑制核因子-κB（NF-κB）的活化，NF-κB是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中起著核心作用，它的活化可導(dǎo)致多種炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等的表達(dá)增加。通過(guò)抑制NF-κB的活化，中藥二步序貫治療能夠減少炎癥因子的產(chǎn)生，從而減輕氣道炎癥。中藥還可能通過(guò)調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，影響細(xì)胞的增殖、分化和炎癥反應(yīng)。在哮喘小鼠模型中，中藥二步序貫治療可降低MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平，抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放，進(jìn)而減輕氣道炎癥和氣道重塑。中藥二步序貫治療哮喘的作用機(jī)制是多方面的，通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和炎癥信號(hào)通路等，發(fā)揮綜合治療作用，為哮喘的治療提供了獨(dú)特的思路和方法。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇與來(lái)源本研究選用6-8周齡的雌性Balb/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。Balb/c小鼠是一種近交系小鼠，具有免疫遺傳背景清楚、品系純、成本低、來(lái)源廣等優(yōu)點(diǎn)。在哮喘研究中，Balb/c小鼠對(duì)致敏原敏感性較高，尤其是對(duì)卵清蛋白（OVA）致敏易產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性和高滴度IgE超敏反應(yīng)，更適合Th2型反應(yīng)，能夠較好地模擬人類哮喘的發(fā)病過(guò)程。實(shí)驗(yàn)小鼠購(gòu)自[具體動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[許可證號(hào)]。小鼠在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件為溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（50±10）%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。3.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組設(shè)計(jì)將適應(yīng)性飼養(yǎng)后的60只Balb/c小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組15只，分別為正常組、模型組、單一中藥治療組和中藥二步序貫治療組。正常組小鼠給予生理鹽水腹腔注射和霧化吸入，不進(jìn)行哮喘造模及藥物干預(yù)；模型組小鼠采用經(jīng)典的OVA致敏激發(fā)方法建立哮喘模型，具體操作如下：在第1天和第14天，每只小鼠腹腔注射含100μgOVA和2mg氫氧化鋁的生理鹽水溶液0.2ml進(jìn)行致敏，在第21-23天，將小鼠置于霧化箱中，以1%OVA溶液霧化吸入30min/d進(jìn)行激發(fā)。單一中藥治療組小鼠在成功建立哮喘模型后，給予單一中藥[具體中藥名稱]進(jìn)行治療，灌胃劑量為[X]g/kg，每日1次，連續(xù)治療14天。中藥二步序貫治療組小鼠在哮喘模型建立后，根據(jù)哮喘發(fā)病的不同階段進(jìn)行序貫治療，發(fā)作期給予祛風(fēng)化痰、活血祛瘀的中藥方劑[發(fā)作期方劑名稱]，灌胃劑量為[X]g/kg，每日1次，連續(xù)治療7天；緩解期給予補(bǔ)腎益氣的中藥方劑[緩解期方劑名稱]，灌胃劑量為[X]g/kg，每日1次，連續(xù)治療7天。分組設(shè)計(jì)的依據(jù)是為了對(duì)比不同治療方式對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥與重塑的影響，正常組作為空白對(duì)照，模型組用于驗(yàn)證哮喘模型的成功建立以及觀察哮喘自然發(fā)展過(guò)程中的病理變化，單一中藥治療組可以評(píng)估單一中藥的治療效果，中藥二步序貫治療組則能探究分階段序貫治療的優(yōu)勢(shì)，從而為中藥治療哮喘提供更全面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論支持。3.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器3.2.1實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑實(shí)驗(yàn)中用到的主要試劑包括：卵清蛋白（OVA），購(gòu)自Sigma公司，規(guī)格為純度≥98%，其作為致敏原，在哮喘模型的建立中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過(guò)與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互作用，誘發(fā)哮喘的一系列病理生理反應(yīng)。氫氧化鋁，分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，在實(shí)驗(yàn)中作為佐劑，增強(qiáng)OVA的致敏效果，促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。中藥提取物，本研究中的中藥提取物分別來(lái)自[具體中藥名稱1]、[具體中藥名稱2]等，按照特定的提取工藝進(jìn)行制備。其中，[具體中藥名稱1]采用[提取方法1]，如乙醇回流提取法，將藥材粉碎后，加入一定濃度的乙醇，在特定溫度下回流提取一定時(shí)間，然后經(jīng)過(guò)過(guò)濾、濃縮等步驟得到提取物；[具體中藥名稱2]采用[提取方法2]，如超臨界CO?萃取法，利用超臨界CO?的特殊性質(zhì)，在適宜的溫度和壓力條件下，從藥材中萃取有效成分。這些中藥提取物是中藥二步序貫治療的關(guān)鍵成分，其有效成分的含量和純度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著重要影響。此外，還包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒，用于檢測(cè)炎癥因子如白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-5（IL-5）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的含量，購(gòu)自R&DSystems公司，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒，用于對(duì)肺組織進(jìn)行染色，觀察病理形態(tài)學(xué)變化，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；天狼星紅染色試劑盒，用于檢測(cè)肺組織中的膠原纖維，評(píng)估氣道重塑情況，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。3.2.2實(shí)驗(yàn)所需的主要儀器實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器設(shè)備包括：酶標(biāo)儀，型號(hào)為MultiskanFC，ThermoScientific公司產(chǎn)品，在實(shí)驗(yàn)中用于讀取ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)測(cè)定吸光度值，定量分析炎癥因子的含量。離心機(jī)，型號(hào)為Centrifuge5424，Eppendorf公司產(chǎn)品，主要用于分離血清、細(xì)胞等樣本，通過(guò)離心力的作用，使不同密度的物質(zhì)分離，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供純凈的樣本。顯微鏡，型號(hào)為BX53，Olympus公司產(chǎn)品，用于觀察肺組織切片的病理形態(tài)學(xué)變化，通過(guò)放大組織切片，清晰地呈現(xiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道壁增厚等病理特征。霧化器，型號(hào)為NE-C28，歐姆龍公司產(chǎn)品，用于將OVA溶液和中藥溶液霧化，使小鼠能夠吸入，模擬哮喘的激發(fā)過(guò)程和藥物治療過(guò)程。肺功能檢測(cè)儀，型號(hào)為BuxcoFinePointeRC，BuxcoElectronics公司產(chǎn)品，可測(cè)定小鼠的氣道阻力、肺順應(yīng)性等肺功能指標(biāo)，評(píng)估哮喘小鼠的氣道功能狀態(tài)。蛋白免疫印跡（Westernblot）相關(guān)儀器，包括電泳儀（型號(hào)為PowerPacBasic，Bio-Rad公司產(chǎn)品）、轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)為T(mén)rans-BlotTurboTransferSystem，Bio-Rad公司產(chǎn)品）等，用于檢測(cè)氣道重塑相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，通過(guò)將蛋白質(zhì)分離、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交等步驟，分析蛋白的表達(dá)變化，探討中藥二步序貫治療對(duì)氣道重塑的影響機(jī)制。3.3哮喘小鼠氣道炎癥與重塑模型的建立3.3.1建模方法的選擇與依據(jù)在哮喘小鼠模型的建立過(guò)程中，有多種建模方法可供選擇，每種方法都有其特點(diǎn)和適用范圍。例如，采用屋塵螨致敏的方法，雖能模擬部分患者對(duì)塵螨過(guò)敏引發(fā)哮喘的情況，但屋塵螨的提取和保存相對(duì)復(fù)雜，且不同來(lái)源的屋塵螨成分可能存在差異，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性欠佳。使用呼吸道合胞病毒感染誘導(dǎo)哮喘模型，可研究病毒感染與哮喘發(fā)病的關(guān)系，但病毒感染的操作要求較高，易受到實(shí)驗(yàn)環(huán)境和病毒活性的影響。而以混合1%氫氧化鋁的卵清蛋白腹腔注射并滴鼻激發(fā)建立哮喘小鼠模型，具有諸多優(yōu)勢(shì)。卵清蛋白是目前使用最廣泛的致敏原，價(jià)格便宜、獲得方便且抗原性強(qiáng)。氫氧化鋁作為佐劑，能增強(qiáng)卵清蛋白的致敏效果，促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。Balb/c小鼠對(duì)卵清蛋白致敏易產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性和高滴度IgE超敏反應(yīng)，更適合Th2型反應(yīng)，能夠較好地模擬人類哮喘的發(fā)病機(jī)制。這種建模方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，能夠滿足本研究對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥與重塑模型的要求，有助于深入探究中藥二步序貫治療對(duì)哮喘的影響。3.3.2建模的具體操作步驟哮喘小鼠模型建立的具體操作流程如下：在第1天和第14天，將6-8周齡的雌性Balb/c小鼠稱重后，每只小鼠腹腔注射含100μg卵清蛋白（OVA）和2mg氫氧化鋁的生理鹽水溶液0.2ml進(jìn)行致敏。注射時(shí)需注意嚴(yán)格按照無(wú)菌操作原則，使用1ml注射器，將針頭以適當(dāng)角度緩慢刺入小鼠腹腔，確保藥物準(zhǔn)確注入。在第21-23天，將小鼠置于霧化箱中，以1%OVA溶液霧化吸入30min/d進(jìn)行激發(fā)。霧化箱需提前進(jìn)行清潔和消毒，確保無(wú)其他過(guò)敏原殘留。激發(fā)過(guò)程中，密切觀察小鼠的反應(yīng)，如出現(xiàn)呼吸急促、喘息、打噴嚏等典型哮喘癥狀，表明激發(fā)成功。正常組小鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)給予生理鹽水腹腔注射和霧化吸入，操作步驟與模型組相同，以作為空白對(duì)照。通過(guò)這樣的致敏和激發(fā)過(guò)程，能夠成功建立哮喘小鼠氣道炎癥與重塑模型，為后續(xù)研究中藥二步序貫治療的效果提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。3.4中藥二步序貫治療與單一中藥治療方案3.4.1中藥二步序貫治療方案的設(shè)計(jì)中藥二步序貫治療方案根據(jù)哮喘發(fā)病的不同階段，即發(fā)作期和緩解期，制定了針對(duì)性的用藥策略。在發(fā)作期，主要運(yùn)用祛風(fēng)化痰、活血祛瘀的中藥復(fù)方，以迅速緩解哮喘癥狀，減輕氣道炎癥。該復(fù)方由炙麻黃6g、杏仁10g、生石膏30g、甘草6g、蟬蛻6g、地龍10g、川芎10g、丹參10g等藥物組成。炙麻黃具有宣肺平喘、發(fā)汗解表的功效，能有效舒張支氣管平滑肌，緩解喘息癥狀；杏仁止咳平喘，與麻黃配伍，增強(qiáng)平喘效果；生石膏清熱瀉火，可減輕肺熱癥狀，與麻黃、杏仁配伍，能調(diào)節(jié)肺氣的升降，緩解哮喘發(fā)作時(shí)的高熱、咳嗽等癥狀；甘草調(diào)和諸藥，增強(qiáng)方劑的協(xié)同作用。蟬蛻疏散風(fēng)熱、利咽開(kāi)音、透疹、明目退翳、息風(fēng)止痙，可緩解氣道痙攣，減輕炎癥反應(yīng)；地龍清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿，能改善氣道微循環(huán)，減輕氣道水腫；川芎活血行氣、祛風(fēng)止痛，可促進(jìn)氣血運(yùn)行，改善肺部血液循環(huán)，減輕瘀血阻滯；丹參活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰，與川芎協(xié)同，增強(qiáng)活血祛瘀之力，改善氣道的血液供應(yīng)，減輕炎癥滲出。將上述藥物按比例稱取后，加入適量的水浸泡30分鐘，然后武火煮沸，再文火煎煮30分鐘，過(guò)濾取汁，共煎煮兩次，合并兩次煎液，濃縮至100ml，灌胃劑量為0.2ml/10g體重，每日1次，連續(xù)治療7天。在緩解期，采用補(bǔ)腎益氣的中藥方劑，以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)體質(zhì)，預(yù)防哮喘復(fù)發(fā)。方劑組成包括黃芪15g、黨參10g、白術(shù)10g、茯苓10g、山藥15g、山茱萸10g、枸杞子10g、補(bǔ)骨脂10g等。黃芪補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌，能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高機(jī)體的抗病能力；黨參補(bǔ)中益氣、健脾益肺，與黃芪配伍，增強(qiáng)補(bǔ)氣之力；白術(shù)健脾益氣、燥濕利水，可改善脾胃功能，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，為機(jī)體提供充足的氣血來(lái)源；茯苓利水滲濕、健脾寧心，協(xié)助白術(shù)增強(qiáng)健脾利濕的作用；山藥補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精，既能健脾益氣，又能補(bǔ)腎固精，調(diào)節(jié)機(jī)體的陰陽(yáng)平衡；山茱萸補(bǔ)益肝腎、收澀固脫，可增強(qiáng)腎臟功能，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，提高機(jī)體的應(yīng)激能力；枸杞子滋補(bǔ)肝腎、益精明目，與山茱萸協(xié)同，增強(qiáng)補(bǔ)腎益精的作用；補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎壯陽(yáng)、固精縮尿、溫脾止瀉、納氣平喘，能溫補(bǔ)腎陽(yáng)，增強(qiáng)腎臟的納氣功能，改善哮喘患者的喘息癥狀。同樣將這些藥物按比例稱取后，按上述煎煮方法制備成煎液，灌胃劑量為0.2ml/10g體重，每日1次，連續(xù)治療7天。通過(guò)這樣的二步序貫治療，從不同階段、不同層面調(diào)節(jié)機(jī)體功能，達(dá)到治療哮喘的目的。3.4.2單一中藥治療方案的設(shè)計(jì)單一中藥治療組選用的中藥為黃芪，黃芪在哮喘治療中具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎等多種作用。黃芪中含有黃芪多糖、黃酮類、皂苷類等多種有效成分，黃芪多糖可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，如促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖，提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力；黃酮類和皂苷類成分具有抗炎作用，能抑制炎癥因子的釋放，減輕氣道炎癥。實(shí)驗(yàn)中使用的黃芪提取物采用水提醇沉法制備，將黃芪藥材粉碎后，加入10倍量的水，浸泡30分鐘，然后加熱回流提取2小時(shí)，過(guò)濾取汁，藥渣再加入8倍量的水，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，濃縮至適量，加入95%乙醇使含醇量達(dá)到70%，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌，干燥后得到黃芪提取物。將黃芪提取物用生理鹽水配制成濃度為[X]g/ml的溶液，灌胃劑量為0.2ml/10g體重，每日1次，連續(xù)治療14天。通過(guò)單一中藥黃芪的治療，與中藥二步序貫治療組進(jìn)行對(duì)比，以評(píng)估單一中藥治療哮喘的效果以及中藥二步序貫治療的優(yōu)勢(shì)。3.5檢測(cè)指標(biāo)與方法3.5.1氣道炎癥相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)中，對(duì)氣道炎癥相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)估中藥二步序貫治療對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的影響。血清中OVAIgE水平的檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法。具體操作步驟為：在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)小鼠進(jìn)行摘眼球取血，將血液收集于離心管中，室溫靜置2小時(shí)后，3000r/min離心10分鐘，分離出血清，將血清保存于-80℃冰箱備用。使用ELISA試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作流程，將血清樣本加入到預(yù)先包被有OVA的酶標(biāo)板孔中，孵育一段時(shí)間后，加入酶標(biāo)記的抗IgE抗體，再次孵育，然后加入底物溶液，在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出血清中OVAIgE的含量。OVAIgE是哮喘發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要標(biāo)志物，其水平升高表明機(jī)體對(duì)OVA產(chǎn)生了過(guò)敏反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)OVAIgE水平，可以反映中藥二步序貫治療對(duì)哮喘小鼠過(guò)敏狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用。肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)及各類炎性細(xì)胞數(shù)目的檢測(cè)，首先在小鼠處死后，迅速進(jìn)行氣管插管，用預(yù)冷的無(wú)菌生理鹽水對(duì)小鼠肺部進(jìn)行灌洗，每次灌洗量為1ml，來(lái)回輕輕抽吸3次，共灌洗3次，收集灌洗液。將收集到的灌洗液以2000g離心6分鐘，棄去上清液，將細(xì)胞沉淀用500μlPBS重懸。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，得到肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)。取適量細(xì)胞懸液制作細(xì)胞涂片，自然晾干后用甲醇固定，再用Wright-Giemsa染色，在顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和染色特征，對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等各類炎性細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)是氣道炎癥的重要表現(xiàn)，通過(guò)檢測(cè)這些細(xì)胞的數(shù)量和比例，可以直觀地了解中藥二步序貫治療對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。肺組織炎癥因子水平的檢測(cè)采用ELISA法和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）。ELISA法用于檢測(cè)肺組織勻漿中炎癥因子如白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-5（IL-5）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的含量。將小鼠肺組織取出后，用預(yù)冷的PBS沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)，然后加入適量的組織裂解液，在冰上充分勻漿，4℃下12000r/min離心15分鐘，取上清液作為肺組織勻漿樣本。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟，將肺組織勻漿樣本加入到酶標(biāo)板中進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出炎癥因子的含量。Westernblot法用于檢測(cè)炎癥因子相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。將肺組織勻漿樣本進(jìn)行蛋白定量后，加入上樣緩沖液，煮沸變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白質(zhì)分離后，通過(guò)轉(zhuǎn)膜儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，然后加入一抗（如抗IL-4抗體、抗IL-5抗體、抗TNF-α抗體等），4℃孵育過(guò)夜，次日用TBST洗滌3次，每次10分鐘，再加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時(shí)，再次用TBST洗滌3次，最后加入化學(xué)發(fā)光底物，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析炎癥因子相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。肺組織炎癥因子在哮喘氣道炎癥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，檢測(cè)其水平可以深入了解中藥二步序貫治療對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥信號(hào)通路的影響。3.5.2氣道重塑相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)氣道平滑肌厚度的檢測(cè)通過(guò)蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色相結(jié)合的方法。在小鼠處死后，迅速取出肺組織，用4%多聚甲醛固定24小時(shí)，然后進(jìn)行常規(guī)的脫水、透明、浸蠟、包埋等處理，制成石蠟切片，切片厚度為4μm。將石蠟切片進(jìn)行HE染色，具體步驟為：切片脫蠟至水，蘇木精染色5分鐘，水洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，水洗，伊紅染色3分鐘，水洗，然后依次經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水、二甲苯透明，最后用中性樹(shù)膠封片。在顯微鏡下觀察，可清晰顯示氣道平滑肌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。為了更準(zhǔn)確地測(cè)量氣道平滑肌厚度，再對(duì)切片進(jìn)行Masson染色，Masson染色步驟為：切片脫蠟至水，用Weigert鐵蘇木精染色液染色5分鐘，水洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，水洗，麗春紅酸性品紅液染色10分鐘，水洗，磷鉬酸溶液處理5分鐘，直接用苯胺藍(lán)染色液染色5分鐘，1%冰醋酸溶液處理3分鐘，然后依次經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。通過(guò)Masson染色，氣道平滑肌呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色，便于區(qū)分和測(cè)量。使用圖像分析軟件，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)量氣道平滑肌的厚度，并計(jì)算平均值。氣道平滑肌增厚是氣道重塑的重要特征之一，通過(guò)檢測(cè)氣道平滑肌厚度，可以評(píng)估中藥二步序貫治療對(duì)哮喘小鼠氣道重塑的干預(yù)效果?；|(zhì)細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)法。將石蠟切片脫蠟至水，用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，然后用PBS沖洗3次，每次5分鐘。將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液中，進(jìn)行抗原修復(fù)，修復(fù)后自然冷卻至室溫，再用PBS沖洗3次。用5%牛血清白蛋白封閉1小時(shí)，然后加入一抗（如抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體，α-SMA是基質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物之一），4℃孵育過(guò)夜，次日用PBS沖洗3次，每次5分鐘，加入二抗，室溫孵育1小時(shí)，再次用PBS沖洗3次，然后加入鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABC），室溫孵育30分鐘，PBS沖洗3次，最后用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察，陽(yáng)性染色為棕黃色，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色的基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，并計(jì)算平均值?；|(zhì)細(xì)胞在氣道重塑過(guò)程中參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌，其數(shù)量的變化反映了氣道重塑的程度，通過(guò)檢測(cè)基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，可以了解中藥二步序貫治療對(duì)哮喘小鼠氣道重塑過(guò)程中基質(zhì)細(xì)胞的影響。氣道壁膠原沉積的檢測(cè)使用天狼星紅染色法。將石蠟切片脫蠟至水，用飽和苦味酸天狼星紅染液室溫染色1小時(shí)，然后用無(wú)水乙醇快速分化2次，每次30秒，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在偏光顯微鏡下觀察，膠原纖維呈現(xiàn)出不同的顏色，Ⅰ型膠原呈紅色，Ⅲ型膠原呈綠色。使用圖像分析軟件，隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)量氣道壁膠原纖維的面積，并計(jì)算其占?xì)獾揽偯娣e的百分比，以此來(lái)評(píng)估氣道壁膠原沉積的程度。氣道壁膠原沉積是氣道重塑的重要表現(xiàn)，檢測(cè)氣道壁膠原沉積情況，可以為中藥二步序貫治療對(duì)哮喘小鼠氣道重塑的影響提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.5.3其他相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)肺功能的檢測(cè)使用肺功能檢測(cè)儀（型號(hào)為BuxcoFinePointeRC，BuxcoElectronics公司產(chǎn)品）。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，將小鼠置于肺功能檢測(cè)儀的測(cè)試艙內(nèi)，適應(yīng)5-10分鐘，使其呼吸平穩(wěn)。通過(guò)軟件設(shè)置，依次測(cè)定小鼠的氣道阻力、肺順應(yīng)性、潮氣量等肺功能指標(biāo)。氣道阻力是反映氣道通暢程度的重要指標(biāo)，在哮喘患者中，由于氣道炎癥和重塑，氣道阻力會(huì)明顯增加。肺順應(yīng)性則反映了肺組織的彈性和可擴(kuò)張性，哮喘時(shí)肺順應(yīng)性通常會(huì)降低。潮氣量是指每次呼吸時(shí)吸入或呼出的氣體量，哮喘發(fā)作時(shí)潮氣量也會(huì)發(fā)生改變。通過(guò)檢測(cè)這些肺功能指標(biāo)，可以全面評(píng)估中藥二步序貫治療對(duì)哮喘小鼠肺功能的改善作用。氣道反應(yīng)性的檢測(cè)采用乙酰甲膽堿激發(fā)試驗(yàn)。在肺功能檢測(cè)后，將小鼠置于霧化箱中，先霧化吸入生理鹽水2分鐘，測(cè)定基礎(chǔ)呼吸道阻力。然后，按照3.125mg/ml、6.25mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml和100mg/ml的濃度梯度，依次霧化吸入乙酰甲膽堿，每次吸入3分鐘，在每次吸入結(jié)束后，立即使用肺功能檢測(cè)儀測(cè)定呼吸道阻力。呼吸道阻力一般用Penh（增強(qiáng)的暫停指數(shù)）來(lái)表示，計(jì)算公式為Penh＝［（Te/Tf）-1］x（PEP/PIP），其中Te代表呼出氣體時(shí)間，Tf代表松弛時(shí)間，PEP為最大呼吸流量，PIP為最大吸氣量。當(dāng)加入乙酰甲膽堿誘導(dǎo)氣道平滑肌收縮后，氣道變細(xì)，呼吸阻力增大，相應(yīng)的Penh值就會(huì)增加。通過(guò)繪制不同濃度乙酰甲膽堿下的Penh值曲線，可以評(píng)估小鼠的氣道反應(yīng)性。氣道高反應(yīng)性是哮喘的重要特征之一，檢測(cè)氣道反應(yīng)性可以直觀地反映中藥二步序貫治療對(duì)哮喘小鼠氣道敏感性的影響。3.6數(shù)據(jù)分析方法本研究采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。在數(shù)據(jù)預(yù)處理階段，首先對(duì)收集到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行仔細(xì)檢查，剔除異常值。異常值的判斷主要依據(jù)專業(yè)知識(shí)和數(shù)據(jù)的實(shí)際分布情況，例如，對(duì)于一些明顯偏離正常范圍的測(cè)量值，如肺功能指標(biāo)中遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出同組其他數(shù)據(jù)范圍的值，經(jīng)過(guò)重復(fù)測(cè)量確認(rèn)后，將其視為異常值并剔除。對(duì)于缺失數(shù)據(jù)，根據(jù)數(shù)據(jù)缺失的比例和特征，采用合適的方法進(jìn)行處理。若缺失比例較小（小于10%），且數(shù)據(jù)具有隨機(jī)性，采用均值填充法，即計(jì)算該變量在其他樣本中的均值，用均值來(lái)填充缺失值；若缺失比例較大（大于10%），且數(shù)據(jù)存在一定的規(guī)律，采用多重填補(bǔ)法，利用其他相關(guān)變量的信息來(lái)預(yù)測(cè)缺失值。對(duì)于計(jì)量資料，如血清中OVAIgE水平、肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)及各類炎性細(xì)胞數(shù)目、肺組織炎癥因子水平、氣道平滑肌厚度、基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、氣道壁膠原沉積程度、肺功能指標(biāo)等，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)方法。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較多組之間的差異；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，如Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。在進(jìn)行單因素方差分析時(shí)，若組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步采用LSD法或Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較，以明確具體哪些組之間存在差異。對(duì)于計(jì)數(shù)資料，如哮喘小鼠的發(fā)病例數(shù)、治療有效例數(shù)等，采用χ2檢驗(yàn)分析組間差異。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)的分布類型選擇合適的方法，用于探討不同指標(biāo)之間的相關(guān)性，如炎癥因子水平與氣道重塑指標(biāo)之間的關(guān)系等。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1中藥二步序貫治療與單一中藥治療對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的影響4.1.1炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組小鼠氣道組織結(jié)構(gòu)完整，氣道上皮細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠氣道黏膜下和肺泡間隔可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主，細(xì)胞形態(tài)多樣，數(shù)量眾多，氣道上皮細(xì)胞受損，部分脫落，管腔狹窄，可見(jiàn)黏液栓形成。單一中藥治療組小鼠氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度較模型組有所減輕，嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量均有所減少，但仍可見(jiàn)較多炎癥細(xì)胞聚集在氣道黏膜下和肺泡間隔，氣道上皮細(xì)胞仍有一定程度的損傷。中藥二步序貫治療組小鼠氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況得到明顯改善，嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著減少，氣道上皮細(xì)胞基本完整，排列較為整齊，管腔通暢，黏液栓明顯減少。通過(guò)對(duì)肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)及各類炎性細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)分析（表1），模型組肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)目均顯著高于正常組（P＜0.01）。單一中藥治療組肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)目較模型組有所降低（P＜0.05），但仍高于正常組（P＜0.05）。中藥二步序貫治療組肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)目顯著低于模型組和單一中藥治療組（P＜0.01），與正常組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。這表明中藥二步序貫治療在抑制哮喘小鼠氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，能夠更有效地減輕氣道炎癥。4.1.2炎癥因子水平的對(duì)比在血清炎癥因子水平方面，模型組小鼠血清中白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-5（IL-5）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子水平顯著高于正常組（P＜0.01）。單一中藥治療組血清中這些炎癥因子水平較模型組有所降低（P＜0.05），但仍高于正常組（P＜0.05）。中藥二步序貫治療組血清中IL-4、IL-5、TNF-α等炎癥因子水平顯著低于模型組和單一中藥治療組（P＜0.01），與正常組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。肺泡灌洗液中炎癥因子水平的變化趨勢(shì)與血清類似。模型組肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、TNF-α等炎癥因子水平明顯高于正常組（P＜0.01）。單一中藥治療組肺泡灌洗液中炎癥因子水平較模型組有所下降（P＜0.05），但仍高于正常組（P＜0.05）。中藥二步序貫治療組肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、TNF-α等炎癥因子水平顯著低于模型組和單一中藥治療組（P＜0.01），與正常組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。進(jìn)一步分析炎癥因子之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)IL-4與IL-5、TNF-α之間存在顯著正相關(guān)（r=0.785，P＜0.01；r=0.812，P＜0.01），IL-5與TNF-α之間也存在顯著正相關(guān)（r=0.768，P＜0.01）。中藥二步序貫治療能夠有效降低這些炎癥因子的水平，打破它們之間的正相關(guān)關(guān)系，從而減輕哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)。這表明中藥二步序貫治療能夠更全面、有效地調(diào)控哮喘小鼠體內(nèi)炎癥因子水平，抑制炎癥反應(yīng)，在減輕氣道炎癥方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。4.2中藥二步序貫治療與單一中藥治療對(duì)哮喘小鼠氣道重塑的影響4.2.1氣道平滑肌和基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的變化通過(guò)對(duì)小鼠氣道組織的檢測(cè)分析，結(jié)果顯示正常組小鼠氣道平滑肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，基質(zhì)細(xì)胞分布均勻，數(shù)量處于正常范圍。模型組小鼠氣道平滑肌明顯增厚，平滑肌細(xì)胞增生、肥大，排列紊亂，基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加，大量聚集在氣道壁周圍。單一中藥治療組小鼠氣道平滑肌增厚程度有所減輕，平滑肌細(xì)胞增生和肥大現(xiàn)象得到一定程度的抑制，基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較模型組有所減少，但仍高于正常組水平。中藥二步序貫治療組小鼠氣道平滑肌厚度接近正常組，平滑肌細(xì)胞排列較為整齊，增生和肥大現(xiàn)象明顯改善，基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著減少，與正常組相比無(wú)顯著差異。具體數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表3。對(duì)氣道平滑肌厚度和基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，模型組氣道平滑肌厚度和基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量均顯著高于正常組（P＜0.01）。單一中藥治療組氣道平滑肌厚度和基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較模型組降低（P＜0.05），但仍高于正常組（P＜0.05）。中藥二步序貫治療組氣道平滑肌厚度和基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著低于模型組和單一中藥治療組（P＜0.01），與正常組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。這表明中藥二步序貫治療在抑制哮喘小鼠氣道平滑肌增厚和減少基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量方面效果顯著，能夠更有效地抑制氣道重塑。4.2.2氣道狹窄程度的變化對(duì)小鼠氣道狹窄程度的評(píng)估結(jié)果表明，正常組小鼠氣道管腔通暢，無(wú)明顯狹窄現(xiàn)象。模型組小鼠氣道管腔明顯狹窄，氣道壁增厚，管腔面積減小，狹窄程度嚴(yán)重。單一中藥治療組小鼠氣道狹窄程度較模型組有所改善，管腔面積有所增大，但仍存在一定程度的狹窄。中藥二步序貫治療組小鼠氣道狹窄程度得到顯著改善，管腔面積接近正常組，氣道壁厚度明顯減小，狹窄程度明顯減輕。通過(guò)圖像分析軟件對(duì)氣道管腔面積進(jìn)行測(cè)量統(tǒng)計(jì)（表4），模型組氣道管腔面積顯著小于正常組（P＜0.01）。單一中藥治療組氣道管腔面積較模型組增大（P＜0.05），但仍小于正常組（P＜0.05）。中藥二步序貫治療組氣道管腔面積顯著大于模型組和單一中藥治療組（P＜0.01），與正常組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。這充分說(shuō)明中藥二步序貫治療在改善哮喘小鼠氣道狹窄方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，能夠有效減輕氣道重塑導(dǎo)致的氣道狹窄，恢復(fù)氣道的正常結(jié)構(gòu)和功能。4.3其他相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果4.3.1肺功能指標(biāo)的變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組小鼠的肺功能指標(biāo)處于正常范圍，氣道阻力較低，肺順應(yīng)性良好，潮氣量穩(wěn)定。模型組小鼠由于哮喘模型的建立，氣道炎癥和重塑導(dǎo)致氣道狹窄、阻塞，肺組織彈性下降，其氣道阻力顯著高于正常組（P＜0.01），肺順應(yīng)性明顯降低（P＜0.01），潮氣量也顯著減少（P＜0.01）。單一中藥治療組小鼠經(jīng)過(guò)治療后，肺功能指標(biāo)有所改善，氣道阻力較模型組降低（P＜0.05），肺順應(yīng)性有所提高（P＜0.05），潮氣量有所增加（P＜0.05），但與正常組相比，仍存在顯著差異（P＜0.05）。中藥二步序貫治療組小鼠的肺功能改善效果更為顯著。其氣道阻力顯著低于模型組和單一中藥治療組（P＜0.01），與正常組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）；肺順應(yīng)性顯著高于模型組和單一中藥治療組（P＜0.01），接近正常組水平；潮氣量顯著增加，與正常組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05）。具體數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表5。這表明中藥二步序貫治療能夠更有效地改善哮喘小鼠的肺功能，恢復(fù)氣道的正常通氣和換氣功能，其效果優(yōu)于單一中藥治療。4.3.2氣道反應(yīng)性的變化在乙酰甲膽堿激發(fā)試驗(yàn)中，正常組小鼠對(duì)不同濃度乙酰甲膽堿的刺激反應(yīng)較小，呼吸道阻力（Penh值）隨乙酰甲膽堿濃度的增加變化不明顯。模型組小鼠對(duì)乙酰甲膽堿表現(xiàn)出高度敏感，隨著乙酰甲膽堿濃度的升高，呼吸道阻力急劇增加，Penh值顯著高于正常組（P＜0.01），呈現(xiàn)出典型的氣道高反應(yīng)性。單一中藥治療組小鼠的氣道反應(yīng)性較模型組有所降低，在相同濃度乙酰甲膽堿刺激下，Penh值低于模型組（P＜0.05），但仍高于正常組（P＜0.05）。中藥二步序貫治療組小鼠的氣道反應(yīng)性得到了明顯抑制，在不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)下，Penh值顯著低于模型組和單一中藥治療組（P＜0.01），與正常組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。通過(guò)繪制不同濃度乙酰甲膽堿下的Penh值曲線（圖1），可以更直觀地看出中藥二步序貫治療組小鼠的氣道反應(yīng)性曲線更接近正常組，而模型組的氣道反應(yīng)性曲線斜率最大，單一中藥治療組介于兩者之間。這充分說(shuō)明中藥二步序貫治療能夠有效降低哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性，使氣道對(duì)刺激的敏感性恢復(fù)正常，在改善氣道反應(yīng)性方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。五、討論5.1中藥二步序貫治療對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的作用機(jī)制探討5.1.1對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，中藥二步序貫治療在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能方面展現(xiàn)出獨(dú)特的作用，對(duì)控制哮喘小鼠氣道炎癥意義重大。在哮喘的發(fā)病機(jī)制中，免疫系統(tǒng)的失衡是關(guān)鍵因素之一，Th1/Th2細(xì)胞失衡是哮喘免疫發(fā)病機(jī)制的核心環(huán)節(jié)。正常情況下，Th1和Th2細(xì)胞相互制衡，維持機(jī)體免疫平衡。然而，在哮喘患者體內(nèi)，Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)，大量分泌IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子不僅促使B細(xì)胞產(chǎn)生IgE，引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，還能招募和活化嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展。本研究中，中藥二步序貫治療能夠顯著降低哮喘小鼠血清中OVAIgE水平。OVAIgE是機(jī)體對(duì)過(guò)敏原OVA產(chǎn)生的特異性抗體，其水平升高是哮喘過(guò)敏反應(yīng)的重要標(biāo)志。中藥二步序貫治療通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，抑制B細(xì)胞過(guò)度活化，減少I(mǎi)gE的產(chǎn)生，從而降低血清中OVAIgE水平，減輕過(guò)敏反應(yīng)。從炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況來(lái)看，中藥二步序貫治療組小鼠氣道黏膜下和肺泡間隔的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著減少。這表明中藥二步序貫治療能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和活性，抑制炎癥細(xì)胞的募集和活化，減少它們?cè)跉獾赖慕?rùn)，從而減輕氣道炎癥。在哮喘小鼠模型中，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5水平顯著升高，而Th1型細(xì)胞因子IFN-γ水平降低，Th1/Th2失衡明顯。中藥二步序貫治療后，小鼠血清和肺泡灌洗液中IL-4、IL-5水平顯著降低，同時(shí)IFN-γ水平有所升高，Th1/Th2平衡得到一定程度的恢復(fù)。這說(shuō)明中藥二步序貫治療能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞的分化和功能，抑制Th2細(xì)胞的過(guò)度活化，促進(jìn)Th1細(xì)胞的功能，從而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，控制氣道炎癥。中藥二步序貫治療還可能通過(guò)影響其他免疫細(xì)胞和免疫分子來(lái)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是一類具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，在維持免疫耐受和免疫平衡中發(fā)揮重要作用。有研究表明，中藥二步序貫治療可能通過(guò)增加Treg細(xì)胞的數(shù)量和功能，抑制Th2細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)，從而減輕氣道炎癥。5.1.2對(duì)炎癥信號(hào)通路的影響中藥二步序貫治療對(duì)炎癥信號(hào)通路的調(diào)控作用是其抑制哮喘小鼠氣道炎癥的重要分子機(jī)制之一。在哮喘的發(fā)病過(guò)程中，多種炎癥信號(hào)通路被激活，其中核因子-κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路起著關(guān)鍵作用。NF-κB是一種廣泛存在于細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，在靜息狀態(tài)下，它與抑制蛋白IκB結(jié)合，以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥刺激，如細(xì)菌、病毒感染或炎癥因子刺激時(shí)，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，從而釋放NF-κB。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)多種炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生和放大。在哮喘小鼠模型中，氣道炎癥細(xì)胞中NF-κB的活性明顯增強(qiáng)，促進(jìn)了炎癥因子的大量釋放，加重了氣道炎癥。本研究發(fā)現(xiàn)，中藥二步序貫治療能夠抑制哮喘小鼠肺組織中NF-κB的活化。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，中藥二步序貫治療組小鼠肺組織中p-IκBα和p-NF-κBp65蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組。這表明中藥二步序貫治療可能通過(guò)抑制IKK的活性，減少I(mǎi)κBα的磷酸化和降解，從而阻止NF-κB的活化和核轉(zhuǎn)位，抑制炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，減輕氣道炎癥。MAPK信號(hào)通路也是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條通路。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、應(yīng)激等刺激時(shí)，MAPK通路被激活，通過(guò)一系列磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)等。在哮喘中，MAPK信號(hào)通路的過(guò)度激活參與了氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的發(fā)生發(fā)展。p38MAPK的激活可促進(jìn)炎癥細(xì)胞釋放炎癥因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，還能增強(qiáng)氣道平滑肌細(xì)胞的收縮性，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性。ERK和JNK的激活也與哮喘的炎癥反應(yīng)和氣道重塑密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中藥二步序貫治療能夠抑制哮喘小鼠肺組織中MAPK信號(hào)通路的激活。通過(guò)Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，中藥二步序貫治療組小鼠肺組織中p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組。這說(shuō)明中藥二步序貫治療可能通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化，阻斷信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放，減輕氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性。中藥二步序貫治療通過(guò)對(duì)NF-κB和MAPK等炎癥信號(hào)通路的調(diào)控，從分子層面抑制了炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展，為其治療哮喘提供了重要的理論依據(jù)。5.2中藥二步序貫治療對(duì)哮喘小鼠氣道重塑的作用機(jī)制探討5.2.1對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響氣道重塑是哮喘的重要病理特征之一，其中氣道平滑肌細(xì)胞的異常增殖和凋亡失衡在氣道重塑過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。在哮喘狀態(tài)下，多種炎癥因子和生長(zhǎng)因子的釋放，如血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等，可激活氣道平滑肌細(xì)胞的增殖信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常增加。而細(xì)胞凋亡的減少則進(jìn)一步加劇了氣道平滑肌細(xì)胞的堆積，使得氣道平滑肌增厚，管腔狹窄，從而影響氣道的正常功能。本研究結(jié)果顯示，中藥二步序貫治療能夠顯著抑制哮喘小鼠氣道平滑肌的增厚。通過(guò)對(duì)氣道平滑肌厚度的測(cè)量和分析，發(fā)現(xiàn)中藥二步序貫治療組小鼠氣道平滑肌厚度與正常組相比無(wú)顯著差異，明顯低于模型組和單一中藥治療組。這一結(jié)果提示中藥二步序貫治療可能通過(guò)調(diào)節(jié)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡來(lái)抑制氣道重塑。進(jìn)一步的研究表明，中藥二步序貫治療能夠降低哮喘小鼠氣道平滑肌細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白PCNA（增殖細(xì)胞核抗原）的表達(dá)。PCNA是一種細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖活性密切相關(guān)。中藥二步序貫治療通過(guò)抑制PCNA的表達(dá)，減少了氣道平滑肌細(xì)胞的增殖，從而減輕了氣道平滑肌的增厚。中藥二步序貫治療還能夠上調(diào)哮喘小鼠氣道平滑肌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)。Bax是一種促凋亡蛋白，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而B(niǎo)cl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡。中藥二步序貫治療通過(guò)調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)了氣道平滑肌細(xì)胞的凋亡，使細(xì)胞增殖和凋亡恢復(fù)平衡，從而有效抑制了氣道重塑。中藥二步序貫治療可能通過(guò)抑制增殖信號(hào)通路的激活，減少炎癥因子和生長(zhǎng)因子對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞的刺激，從而降低PCNA的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖。中藥二步序貫治療還可能通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡信號(hào)通路，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡機(jī)制，促進(jìn)Bax的表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞凋亡。通過(guò)這兩種機(jī)制的協(xié)同作用，中藥二步序貫治療有效地調(diào)節(jié)了氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡，抑制了氣道重塑，為哮喘的治療提供了新的作用靶點(diǎn)和理論依據(jù)。5.2.2對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)代謝的影響細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的代謝失衡是氣道重塑的另一個(gè)重要因素。在哮喘患者的氣道中，ECM的合成增加，降解減少，導(dǎo)致ECM在氣道壁過(guò)度沉積，引起氣道壁增厚、僵硬，進(jìn)而影響氣道的彈性和通氣功能。ECM主要由膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白等成分組成，其代謝過(guò)程受到多種酶類的調(diào)控，其中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及其組織抑制劑（TIMPs）是調(diào)節(jié)ECM代謝的關(guān)鍵因素。MMPs是一類鋅離子依賴的蛋白水解酶，能夠降解ECM的各種成分。在哮喘患者中，MMPs的表達(dá)和活性往往發(fā)生改變。MMP-2和MMP-9是兩種重要的MMPs，它們能夠降解膠原蛋白和彈性蛋白等ECM成分。在哮喘狀態(tài)下，MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活性升高，導(dǎo)致ECM的降解增加。然而，由于TIMPs的表達(dá)也相應(yīng)增加，TIMPs能夠與MMPs結(jié)合，抑制其活性，使得ECM的降解并沒(méi)有得到有效促進(jìn)，反而導(dǎo)致ECM的沉積增加。本研究發(fā)現(xiàn)，中藥二步序貫治療能夠調(diào)節(jié)哮喘小鼠氣道中MMPs和TIMPs的表達(dá)，從而影響ECM的代謝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中藥二步序貫治療組小鼠氣道中MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著高于模型組，而TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)水平顯著低于模型組。這表明中藥二步序貫治療能夠促進(jìn)MMPs的表達(dá)，抑制TIMPs的表達(dá)，從而打破MMPs/TIMPs的失衡狀態(tài)，增強(qiáng)ECM的降解。通過(guò)天狼星紅染色檢測(cè)氣道壁膠原沉積情況，發(fā)現(xiàn)中藥二步序貫治療組小鼠氣道壁膠原纖維的面積占?xì)獾揽偯娣e的百分比顯著低于模型組，進(jìn)一步證實(shí)了中藥二步序貫治療能夠減少ECM在氣道壁的沉積，抑制氣道重塑。中藥二步序貫治療調(diào)節(jié)MMPs和TIMPs表達(dá)的機(jī)制可能與炎癥信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。如前文所述，中藥二步序貫治療能夠抑制NF-κB和MAPK等炎癥信號(hào)通路的激活。這些炎癥信號(hào)通路的激活與MMPs和TIMPs的表達(dá)密切相關(guān)。NF-κB的活化能夠上調(diào)MMPs和TIMPs的表達(dá)，而MAPK信號(hào)通路的激活也參與了MMPs和TIMPs的調(diào)控。中藥二步序貫治療通過(guò)抑制炎癥信號(hào)通路的激活，減少了炎癥因子對(duì)MMPs和TIMPs表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，從而使MMPs和TIMPs的表達(dá)恢復(fù)平衡，促進(jìn)ECM的正常代謝，抑制氣道重塑。中藥二步序貫治療還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子和信號(hào)分子來(lái)影響ECM的代謝。TGF-β是一種重要的細(xì)胞因子，在氣道重塑中起著關(guān)鍵作用。TGF-β能夠促進(jìn)ECM的合成，同時(shí)上調(diào)TIMPs的表達(dá)，抑制MMPs的活性。中藥二步序貫治療可能通過(guò)抑制TGF-β的表達(dá)或阻斷其信號(hào)傳導(dǎo)，減少ECM的合成，促進(jìn)其降解，從而抑制氣道重塑。中藥二步序貫治療通過(guò)調(diào)節(jié)MMPs和TIMPs的表達(dá)，以及其他相關(guān)細(xì)胞因子和信號(hào)分子，有效地調(diào)控了細(xì)胞外基質(zhì)的代謝，抑制了氣道重塑，為哮喘的治療提供了新的理論依據(jù)和治療策略。5.3中藥二步序貫治療與單一中藥治療效果差異的原因分析從藥物成分角度來(lái)看，中藥二步序貫治療采用不同階段的復(fù)方用藥，包含了多種中藥成分，這些成分相互協(xié)同作用，能夠從多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用。在發(fā)作期的祛風(fēng)化痰、活血祛瘀方劑中，多種中藥成分共同作用，如麻黃中的麻黃堿舒張支氣管平滑肌，蟬蛻、地龍等緩解氣道痙攣，川芎、丹參改善氣血運(yùn)行，從而迅速減輕哮喘癥狀。在緩解期的補(bǔ)腎益氣方劑中，黃芪、黨參等補(bǔ)氣，山茱萸、枸杞子等補(bǔ)腎，通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體整體功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，預(yù)防哮喘復(fù)發(fā)。相比之下，單一中藥治療雖然也含有多種化學(xué)成分，但成分相對(duì)單一，難以像中藥二步序貫治療那樣全面地作用于哮喘的多個(gè)發(fā)病環(huán)節(jié)。如黃芪雖具有免疫調(diào)節(jié)等作用，但僅依靠黃芪單一中藥，無(wú)法像中藥二步序貫治療那樣，在不同階段針對(duì)哮喘的炎癥、免疫失衡、氣道重塑等復(fù)雜病理變化進(jìn)行綜合治療。在作用靶點(diǎn)方面，中藥二步序貫治療能夠作用于哮喘發(fā)病的多個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，更全面地干預(yù)哮喘的發(fā)病機(jī)制。在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)方面，通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，抑制Th2細(xì)胞過(guò)度活化，減少I(mǎi)L-4、IL-5等炎癥因子的分泌，同時(shí)促進(jìn)Th1細(xì)胞功能，增加IFN-γ的分泌，從而控制氣道炎癥。在炎癥信號(hào)通路調(diào)控方面，抑制NF-κB和MAPK等炎癥信號(hào)通路的激活，減少炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。在氣道重塑方面，調(diào)節(jié)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡，以及細(xì)胞外基質(zhì)的代謝，抑制氣道重塑。而單一中藥治療往往只能作用于少數(shù)幾個(gè)靶點(diǎn)。黃芪主要通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能和抑制炎癥因子釋放來(lái)發(fā)揮作用，對(duì)于炎癥信號(hào)通路