第12章 DNA復(fù)制課件

第十二章DNA復(fù)制第一節(jié)DNA復(fù)制方式及有關(guān)的酶第二節(jié)DNA復(fù)制機(jī)制第三節(jié)RNA生物合成第12章DNA復(fù)制第一節(jié)DNA復(fù)制方式及有關(guān)的酶 目的要求 了解DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)原理理解DNA復(fù)制的起始和方向掌握與DNA復(fù)制有關(guān)的主要酶與蛋白質(zhì)必須掌握半不連續(xù)復(fù)制

重點(diǎn)難點(diǎn) 重點(diǎn)：與DNA復(fù)制有關(guān)的主要酶與蛋白質(zhì)，半不連續(xù)復(fù)制概念難點(diǎn)：DNA復(fù)制的起始和方向，與DNA復(fù)制有關(guān)的主要酶與蛋白質(zhì)，半不連續(xù)復(fù)制概念

第12章DNA復(fù)制幾個(gè)重要概念復(fù)制：以原來(lái)的DNA分子為模板合成出相同的DNA分子的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄：以DNA分子為模板合成出相應(yīng)RNA的過(guò)程。翻譯：以mRNA為模板合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)肽鏈的過(guò)程。第12章DNA復(fù)制一．DNA的半保留復(fù)制1．半保留復(fù)制：復(fù)制DNA時(shí)，堿基間氫鍵破裂，雙鏈解旋、分開(kāi)，分別以兩個(gè)單鍵為模板，合成新鍵，新形成的DNA分子中有一條是新合成的，一條是來(lái)自舊鏈，此過(guò)程由一個(gè)DNA合成為兩個(gè)DNA分子。.通過(guò)半保留復(fù)制說(shuō)明DNA在遺傳上的穩(wěn)定性

第12章DNA復(fù)制DNA半保留復(fù)制是指DNA復(fù)制時(shí)，以雙鏈DNA的每一條鏈為模板復(fù)制互補(bǔ)的子鏈，并以模板鏈和新合成的鏈構(gòu)成子代DNA分子。這樣的復(fù)制方式可是最大程度上使子代DNA和親代DNA相同(至少有一條鏈完全相同，另一條鏈如復(fù)制時(shí)不出錯(cuò)也會(huì)完全相同)，從而使DNA在遺傳上保持穩(wěn)定，即子代DNA與親代DNA相同。通過(guò)半保留復(fù)制說(shuō)明DNA在遺傳上的穩(wěn)定性第12章DNA復(fù)制2．實(shí)驗(yàn)證據(jù)：1）Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以推測(cè)DNA合成為半保留復(fù)制。2）大腸桿菌DNA的復(fù)制實(shí)驗(yàn)1958年Meselson和Stahl用15N標(biāo)記大腸桿菌DNA，證明了半保留復(fù)制。大腸桿菌在以15NH4Cl為唯一氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)12代，使所有DNA都標(biāo)記上15N。再在含14N的培養(yǎng)基上培養(yǎng)一代，則DNA的一半含15N，一半含14N；兩代時(shí)14N-DNA與14N--15N—DNA等量；14N--15N—DNA加熱時(shí)，分成14N 鏈和15N鏈。從而證明DNA 是半保留復(fù)制的。3）研究證明半保留復(fù)制是DNA分子普遍的復(fù)制機(jī)制。無(wú)論原核生物還是真核生物；無(wú)論雙鏈DNA，還是單鏈DNA。第12章DNA復(fù)制3．DNA在代謝上的穩(wěn)定性１）經(jīng)過(guò)多代的復(fù)制后，DNA的多核苷酸鏈仍可保持完整，并存在于后代而不被分解掉（以分裂方式繁殖的單細(xì)胞生物）2）DNA比細(xì)胞中其他成分要穩(wěn)定，這與其遺傳功能相符合。3）DNA也會(huì)發(fā)生損傷，需要修復(fù)復(fù)制和轉(zhuǎn)錄時(shí)會(huì)有損耗，需要更新；發(fā)育和分化時(shí)，DNA可能進(jìn)行修飾、刪除、擴(kuò)增和重排。4）從進(jìn)化的角度上，DNA是處于不斷變異和發(fā)展中。第12章DNA復(fù)制二．復(fù)制的起點(diǎn)和單位1．復(fù)制子：基因組能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位。2．起點(diǎn)：每個(gè)復(fù)制子都含有控制復(fù)制起始的起點(diǎn)，可能還有終止復(fù)制的終點(diǎn)。3．復(fù)制方式：1）單向復(fù)制：從起點(diǎn)向一個(gè)方向復(fù)制，只有一個(gè)復(fù)制叉。2）雙向復(fù)制：從起點(diǎn)向兩側(cè)復(fù)制，有兩個(gè)復(fù)制叉。3）對(duì)稱復(fù)制：兩條鏈同時(shí)進(jìn)行復(fù)制。4）不對(duì)稱復(fù)制：順序復(fù)制兩條鏈（先、后）。第12章DNA復(fù)制復(fù)制方式第12章DNA復(fù)制4．例：1）真核生物DNA：為線性分子，含許多復(fù)制起點(diǎn)，即多復(fù)制子。2）病毒DNA的復(fù)制方式：是一個(gè)復(fù)制子，可雙向、單向；對(duì)稱、不對(duì)稱復(fù)制。第12章DNA復(fù)制5．復(fù)制方向的判斷（放射自顯影）復(fù)制開(kāi)始時(shí)，用低放射3H-脫氧胸苷標(biāo)記，將來(lái)感光還原的銀密度低；再轉(zhuǎn)移到含高放射3H-脫氧胸苷培養(yǎng)基，則繼續(xù)合成區(qū)的銀密度高；如單向復(fù)制，則密度為：高—低；雙向復(fù)制，密度為：中低，兩側(cè)高。大多數(shù)生物染色體DNA是雙向、不對(duì)稱復(fù)制的。第12章DNA復(fù)制三．DNA聚合反應(yīng)的有關(guān)酶1．DNA聚合反應(yīng)和聚合酶1956年，Kornberg從大腸桿菌提取液中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶，在有適量DNA和Mg2+存在下，可催化dATP,dCTP,dGTP和dTTP形成DNA。（不能用相應(yīng)的dNDP、NMP代替相應(yīng)的dNTP）反應(yīng)為：dNTP依次加到作為引物的DNA未端，放出ppi1）鏈的延長(zhǎng)方向：從5`向3`方向延長(zhǎng)，即DNA的3`-OH與NTP的5`-P結(jié)合。2）必須有引物（核酸鏈存在）3）加入的核苷酸順序由模板鏈決定4）產(chǎn)物DNA與DNA聚合酶的來(lái)源，dNTP的相對(duì)比例無(wú)關(guān)，只取決于模板DNA。5）生成與模板DNA相同的DNA，證明在DNA合成酶作用下，模板DNA的兩條鏈都可復(fù)制（以上為PCR—DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的基礎(chǔ)）dNTP+DNA[dNMP]n(DNA)+nPPi

聚合酶Mg2+第12章DNA復(fù)制DNA聚合酶的特點(diǎn)：以dNTP為底物；需DNA模板；需引物3`-OH；鏈處長(zhǎng)方向?yàn)?`---3`第12章DNA復(fù)制2．大腸桿菌DNA聚合酶有三種，分別為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ1）共性：需要模板；需要dNTP底物；需要3`-OH的引物鏈。2）不同Ⅱ和Ⅲ可作用于小段缺口（小于100個(gè)核苷酸）的雙鏈DNAⅠ作用于有大段單鏈區(qū)的雙鏈DNA，或單鏈DNA。3）Ⅲ是大腸桿菌DNA合成的主要酶；Ⅱ是DNA損傷修復(fù)酶；Ⅰ可能也起修復(fù)作用。第12章DNA復(fù)制3．真核生物DNA聚合酶有五種：αβεδγαβδε存在于細(xì)胞核中α可合成RNA引物，同時(shí)可在引物上聚合4-5個(gè)脫氧核糖核苷酸β可能在DNA損傷修復(fù)中起作用；ε的生理功能是修補(bǔ)合成，補(bǔ)上清除引物RNA后留下豁口（Gap）；δ是DNA復(fù)制酶；γ為線粒體DNA復(fù)制酶。第12章DNA復(fù)制4．DNA連接酶1）作用：催化鏈的未端形成共價(jià)連接可將雙鏈DNA切口處的5`-P和3`-OH生成3`--5`磷酸鍵，如環(huán)狀DNA未端的連接。第12章DNA復(fù)制5.DNA的半不連續(xù)復(fù)制一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)的，從5`---3`方向進(jìn)行，另一條鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)的，3`--5`從方向進(jìn)行。稱這種DNA復(fù)制方式為半不連續(xù)復(fù)制。復(fù)制方向3355滯后鏈前導(dǎo)鏈第12章DNA復(fù)制第12章DNA復(fù)制6.3`--5`方向鏈的合成以5`---3`方向模板鏈為籃本，合成1000個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的DNA片段，從5`---3`方向進(jìn)行稱這種片段為岡崎片段。這些片段由DNA連接酶連接起來(lái)，這條鏈稱為滯后鏈。3．按5`---3`方向合成（以3`---5`方向鏈為模板）的鏈稱為前導(dǎo)鏈，其合成總是連續(xù)的。4．岡崎片段的合成DNA聚合酶需要引物，此引物為RNA片段RNA引物由引物合成酶催化，形成幾------10個(gè)核苷酸的RNA片段。并由DNA聚合酶Ⅰ切去，由DNA連接酶將岡崎片段連成長(zhǎng)鏈（滯后鏈）第12章DNA復(fù)制SSB第12章DNA復(fù)制第12章DNA復(fù)制第12章DNA復(fù)制第二節(jié)DNA復(fù)制機(jī)制

目的要求 了解RNA指導(dǎo)下DNA的合成，真核細(xì)胞DNA的復(fù)制掌握DNA復(fù)制的基本規(guī)律必須掌握原核細(xì)胞DNA的復(fù)制

重點(diǎn)難點(diǎn) 重點(diǎn)：DNA的復(fù)制的過(guò)程難點(diǎn)：DNA的復(fù)制的過(guò)程

第12章DNA復(fù)制一、DNA復(fù)制的基本規(guī)律1．復(fù)制過(guò)程是半保留的2．復(fù)制起始于特定位置，叫起點(diǎn)（origin）,真核生物復(fù)制時(shí)有多個(gè)起點(diǎn)。3．復(fù)制可以是單向的，也可以是雙向的。雙向的常見(jiàn)，但雙向復(fù)制時(shí)，速度不一定相等。4．DNA兩條鏈的延長(zhǎng)方向：從5`向3`方向延長(zhǎng)，即DNA的3`-OH與NTP的5`-P結(jié)合，每次增加一個(gè)核苷酸。5．復(fù)制是半不連續(xù)的：前導(dǎo)鏈連續(xù)；滯后鏈不連續(xù)，真核生物的岡崎片段為100~200個(gè)核苷酸，原核生物岡崎片段為1000~2000個(gè)核苷酸。6．DNA的合需要以RNA為引物，DNA聚合酶不能動(dòng)新鏈的合成，只能催化已有鏈的延長(zhǎng)反應(yīng)。7.復(fù)制過(guò)程包括起始（initiation）、鏈延伸（chainelongation）和終止（termination），開(kāi)始于固定起點(diǎn)，結(jié)束于一定終點(diǎn)，需要RNA引物，以半不連續(xù)方式合成DNA片斷，再連成完整的分子。第12章DNA復(fù)制二、原核生物DNA復(fù)制過(guò)程DNA復(fù)制過(guò)程大致可以分為復(fù)制的起始（或引發(fā)Priming），DNA鏈的延伸和DNA復(fù)制的終止三個(gè)階段。EColi染色體復(fù)制從單一復(fù)制起點(diǎn)開(kāi)始，雙向進(jìn)行到兩個(gè)復(fù)制叉相遇為止。每一個(gè)復(fù)制叉上，前導(dǎo)鏈和滯后鏈合成由復(fù)制體（執(zhí)行DNA復(fù)制功能的多種蛋白質(zhì)復(fù)合體）催化，復(fù)制體由DNA解旋蛋白，引發(fā)體和DNA復(fù)制酶Ⅲ全酶組成。第12章DNA復(fù)制(一)DNA復(fù)制的起始(引發(fā))EColi染色體復(fù)制從單一復(fù)制起點(diǎn)oric開(kāi)始,oric245bp序列中有四個(gè)高度保守的9bp重復(fù)單位，4個(gè)DnaA蛋白（4聚體，52kD，起始因子）結(jié)合在其上后，20~40個(gè)DnaA蛋白附加結(jié)合在4個(gè)DnaA蛋白上，引起解鏈。DnaB蛋白（6聚體，50kD）結(jié)合到開(kāi)鏈oric上。先形成（DnaB：DnaC：ATP）6，它在DnaT的作用下，將DnaB送入oric，脫下DnaC，ATP水解成ADP和磷酸。此時(shí)的（DnaADnaB）稱為開(kāi)鏈復(fù)合物。在DNA單鏈上加入SSB，形成原引發(fā)復(fù)合物（DnaADnaBSSB）加入一個(gè)引物酶完成引發(fā)體的形成。在加入引物酶時(shí)，解旋酶PriA在PriAB，PriC幫助上結(jié)合到引發(fā)體，形成引發(fā)體（PriADnaB引物酶）每個(gè)復(fù)制叉有一個(gè)引發(fā)體。第12章DNA復(fù)制(二)DNA鏈的延伸引發(fā)體合成RNA引物后，DNA復(fù)制酶Ⅲ全酶結(jié)合到DNA上，形成復(fù)制體，從RNA引物開(kāi)始，進(jìn)行DNA鏈的延伸。（引發(fā)體在DNA上的移動(dòng)會(huì)清除所有DnaA）雙鏈DNA解旋，SSB加入到到單鏈DNA，NA復(fù)制酶Ⅲ全酶清除SSB，進(jìn)行DNA單鏈的聚合反應(yīng)滯后鏈上不斷合成RNA引物，不斷清除RNA引物并補(bǔ)上DNA第12章DNA復(fù)制(三)DNA復(fù)制的終止EColi上的終點(diǎn)為Ter點(diǎn)（terminator）,兩個(gè)復(fù)制叉在此相遇，復(fù)制終止。其中含有5’-GTGTGTTC序列。Tus蛋白為復(fù)制終止因子，形成Tus-Ter復(fù)合物阻止復(fù)制叉前移。第12章DNA復(fù)制三、真核生物DNA復(fù)制過(guò)程1．真核生物DNA復(fù)制只在細(xì)胞分裂周期中S期（DNA合成期）進(jìn)行，復(fù)制受復(fù)制許可因子（replicationlicensingfactor）控制2.復(fù)制移動(dòng)速度為1000~3000bp/min，原核生物50000bp/min3．多個(gè)復(fù)制子。由于有多個(gè)復(fù)制子，150000kbp只要幾小時(shí)即可復(fù)制。4．岡崎片斷長(zhǎng)100~200核苷酸，原核生物為1000~2000核苷酸第12章DNA復(fù)制5．DNA聚合酶：(已講)真核生物DNA有五種：αβεδγαβδε存在于細(xì)胞核中α可合成RNA引物，同時(shí)可在引物上聚合4-5個(gè)脫氧核糖核苷酸β可能在DNA損傷修復(fù)中起作用；ε的生理功能是修補(bǔ)合成，補(bǔ)上清除引物RNA后留下豁口（Gap）；δ是DNA復(fù)制酶；γ為線粒體DNA復(fù)制酶。RP-A為單鏈DNA結(jié)合蛋白，相當(dāng)于EColi的SSB第12章DNA復(fù)制DNA的體外合成---PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR--PolymeraseChainReaction），

是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期,循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA得以迅速擴(kuò)增,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究,還可用于疾病病的診斷或任何有DNA,RNA的地方。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，簡(jiǎn)稱PCR）又稱無(wú)細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。由美國(guó)科學(xué)家PE（PerkinElmer珀金-埃爾默）公司遺傳部的Dr.Mullis發(fā)明，由于PCRPCR技術(shù)在理論和應(yīng)用上的跨時(shí)代意義，因此Mullis獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。第12章DNA復(fù)制PCR過(guò)程和循環(huán)第12章DNA復(fù)制PCR參數(shù)StepTemperatureTimeduringStep194℃5minStep294℃20secStep350℃30secStep472℃40secStep525moretimestostep2Step672℃10minStep74℃24hrStep8End第12章DNA復(fù)制在試管中合成DNA時(shí)要加入什么物質(zhì)，起什么作用？DNA聚合酶：催化合成反應(yīng)DNA：作為合成的模板，決定DNA的堿基順序短鏈DNA：引物dATPdCTPdGTPdTTP:合成的底物，不能以相應(yīng)的二磷酸或一磷酸化合物取代第12章DNA復(fù)制幾個(gè)重要概念1．DNA指導(dǎo)下RNA的合成稱為：轉(zhuǎn)錄。2．轉(zhuǎn)錄單位：RNA鏈的轉(zhuǎn)錄起始于DNA模板的一個(gè)特定位點(diǎn)，并在另一位點(diǎn)終止，此區(qū)域稱為轉(zhuǎn)錄單位。3．一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位可以是一個(gè)基因，也可以是多個(gè)基因。4．轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始是由DNA的啟動(dòng)子（promoter）控制。5．終止子：控制終止的部位（terminator）6．催化轉(zhuǎn)錄的酶：RNA聚合酶第12章DNA復(fù)制四、RNA指導(dǎo)下DNA的合成

（逆向轉(zhuǎn)錄reversetranscription）（一）逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）又稱RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶。是以RNA為模板合成DNA的酶。含兩個(gè)亞基，a亞基是b亞基水解產(chǎn)生的。含鋅。要求有模板和不少于四個(gè)核苷酸的引物，由5’向3’合成DNA。真核生物的信使RNA加入寡聚dT后可作為模板。此酶有多種功能，可先合成DNA－RNA雜合分子，再水解RNA（RNA酶H活力），然后復(fù)制其互補(bǔ)鏈，形成雙鏈DNA。第12章DNA復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）這種酶是1970年美國(guó)科學(xué)家特明（H.M.Temin）和巴爾的摩（D.Baltimore）分別于動(dòng)物致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)的，他們并因此獲得1975年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。當(dāng)RNA致癌病毒，如鳥(niǎo)類勞氏肉瘤病毒（Roussar-comavirus）進(jìn)入宿主細(xì)胞后，其逆轉(zhuǎn)錄酶先催化合成與病毒RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，繼而復(fù)制出雙螺旋DNA，并經(jīng)另一種病毒酶的作用整合到宿主的染色體DNA中，此整合的DNA可能潛伏（不表達(dá)）數(shù)代，待遇適合的條件時(shí)被激活，利用宿主的酶系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的RNA，其中一部分作為病毒的遺傳物質(zhì)，另一部分則作為mRNA翻譯成病毒特有的蛋白質(zhì)。最后，RNA和蛋白質(zhì)被組裝成新的病毒粒子。在一定的條件下，整合的DNA也可使細(xì)胞轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞。第12章DNA復(fù)制（二）逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程：

含有逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒叫做反轉(zhuǎn)錄病毒，逆轉(zhuǎn)錄酶催化的反應(yīng)叫反轉(zhuǎn)錄（reve-rsetranscrip-tion）。在這個(gè)過(guò)程中，遺傳信息流動(dòng)的方向是從RNA到DNA，正好與轉(zhuǎn)錄過(guò)程相反，故稱反轉(zhuǎn)錄。第12章DNA復(fù)制（三）意義1．逆轉(zhuǎn)錄與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，為腫瘤的研究和防治提供了重要線索。艾滋病、乙肝等也有逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。2．逆轉(zhuǎn)錄病毒經(jīng)過(guò)改造，可作為信息載體，用于腫瘤和遺傳疾病的基因治療。真核生物的基因組中多含逆假基因，可能是信使RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而整合到基因組中的。所以真核生物正常細(xì)胞也存在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。第12章DNA復(fù)制第三節(jié)RNA生物合成

目的要求 了解RNA的復(fù)制，真核細(xì)胞RNA聚合酶理解RNA的轉(zhuǎn)錄后加工掌握原核細(xì)胞中RNA在DNA指導(dǎo)下的合成及有關(guān)酶

重點(diǎn)難點(diǎn) 重點(diǎn)：原核細(xì)胞中RNA在DNA指導(dǎo)下的合成及有關(guān)酶，RNA的轉(zhuǎn)錄后加工難點(diǎn)：真核細(xì)胞RNA聚合酶，原核細(xì)胞中RNA在DNA指導(dǎo)下的合成及有關(guān)酶，RNA的轉(zhuǎn)錄后加工

第12章DNA復(fù)制一、DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶（DNAdurectedRNApolymerase）1．反應(yīng)條件：1）以ATP、GTP、CTP和UTP為底物2）適當(dāng)?shù)腄NA為模板3）Mg2+能促進(jìn)聚合反應(yīng)4）合成方向5`---3`（聚合3—5磷酸鍵5`pX3----5`pX3）且反應(yīng)可逆，Ppi分解推動(dòng)反應(yīng)趨向聚合5）不需要引物，直接在模板上合成RNA第12章DNA復(fù)制2．產(chǎn)物RNA的組成取決于模板DNA的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)證明產(chǎn)生RNA的堿基比例與模板DNA堿基比例基本一致（TMP為UMP代替）分子雜交試驗(yàn)的證明：合成的RNA用放射性P標(biāo)記，與模板DNA一起加熱，使DNA解鏈，再緩慢冷卻，可形成RNA/DNA雜交體。而加入非模板DNA，則不能形成雜交體。說(shuō)明RNA分子是以模板DNA的堿基順序?yàn)榛A(chǔ)，在其上合成的。第12章DNA復(fù)制3．RNA兩條鏈的作用1）在體外（試管中），兩條鏈都可轉(zhuǎn)錄（不正常）2）在體內(nèi)：（1）僅有一條鏈可以轉(zhuǎn)錄。（2）或某些區(qū)域可以從一條鏈轉(zhuǎn)錄，另外的區(qū)域由另一條鏈轉(zhuǎn)錄。（3）對(duì)應(yīng)的鏈只有復(fù)制的功能，不能轉(zhuǎn)錄。即在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄時(shí)，RNA聚合物有選擇作用，可挑選正確的鏈及鏈上的區(qū)域進(jìn)行復(fù)制。第12章DNA復(fù)制4．DNA的狀態(tài)1）轉(zhuǎn)錄時(shí)的全保留：以天然雙鏈DNA為模板，用RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄RNA時(shí)，將DNA在轉(zhuǎn)錄部位局部解開(kāi)，以其中的一條為模板進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄，合成出與其互補(bǔ)的RNA鏈。然后脫下合成的RNA鏈，解開(kāi)的兩條DNA鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。-----DN全保留2）天然雙鏈DNA比單鏈DNA（變性的）更有效因?yàn)镽NA合成時(shí)，DNA全保留。第12章DNA復(fù)制5．RNA聚合酶的組成例1：大腸桿菌RNA聚合酶的分子量為46萬(wàn)。由五個(gè)亞基α2ββ`σ組成，還有一個(gè)ω亞基，很小。有2個(gè)Zn原子，它們結(jié)合在亞基上。1）核心酶：沒(méi)有σ亞基的酶（α2ββ`）它只能使已開(kāi)始合成的RNA鏈延長(zhǎng)，但不能起始合成RNA2）σ亞基為起始因子，開(kāi)始合成RNA鏈時(shí)，RNA聚合酶中必須含有σ亞基（以全酶形式存在）。第12章DNA復(fù)制3）各亞基作用（1）α未知（2）ω未知（3）β與DNA模板結(jié)合（4）β`起始和催化部位（5）σ起始作用第12章DNA復(fù)制4）RNA聚合酶的作用在細(xì)菌中，mRNA，rRNA和tRNA都由一種RNA聚合酶合成。5）轉(zhuǎn)錄過(guò)程例1：真核生物中RNA聚合酶A，存在于核仁中，催化rRNA前體；RNA聚合酶B，存在于核仁中，催化mRNA前體；RNA聚合酶C，存在于核仁中，催化小分子RNA前體（tRNA和5SRNA）；（A、B、C的分類可按與α-鵝膏蕈堿的作用來(lái)進(jìn)行：

A敏感；B對(duì)低濃度的敏感；C高濃度敏感）例2：在線粒體和葉綠體中，也存在RNA聚合酶第12章DNA復(fù)制二、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子1．啟動(dòng)子：RNA聚合酶在模板DNA上識(shí)別、結(jié)合和開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。2．轉(zhuǎn)錄因子：RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄時(shí)需要的一些蛋白質(zhì)稱為轉(zhuǎn)錄因子。第12章DNA復(fù)制3．酶的結(jié)合區(qū)域——起始區(qū)域—保護(hù)區(qū)域RNA5`-P3`--OHDNA5`-P3`--OH正鏈DNA3`-OH5`-P負(fù)鏈-50+20轉(zhuǎn)錄區(qū)+1Startpoint上游下游保護(hù)區(qū)域-1轉(zhuǎn)錄RNA的方向是5`-

3`OH第12章DNA復(fù)制DNA的兩條單鏈與mRNA序列相同的DNA鏈為正鏈（編碼鏈），其方向?yàn)?`-

3`OH另一條鏈為負(fù)鏈（互補(bǔ)鏈、模板），方向?yàn)?`-

5`P規(guī)定轉(zhuǎn)錄單位的起點(diǎn)（startpoint）核苷酸為+1從轉(zhuǎn)錄近端向遠(yuǎn)端（3`

5`）計(jì)數(shù)起點(diǎn)的左側(cè)為上游，起點(diǎn)前第一個(gè)核苷酸為-1起點(diǎn)右側(cè)為下游，為轉(zhuǎn)錄區(qū)用足跡法測(cè)定的RNA聚合酶保護(hù)區(qū)域?yàn)?50~~~~+20第12章DNA復(fù)制4．啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)比較已知啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)，找出其共同的共有序列（保護(hù)序列consensussequence）第12章DNA復(fù)制例：大腸桿菌基因組為4.7*106bp信號(hào)序列最短為412bp(412bp=1.68*107bp>基因組4.7*106bp)信號(hào)序列不一定連續(xù)，分開(kāi)距離本身也提供一定信號(hào)。1）pribnow框(box)，或-10序列在起點(diǎn)上游的-10處的一個(gè)保守序列：TATAAT,長(zhǎng)6bp2)識(shí)別區(qū)或-35序列中心在上游-35處的保守序列：TTGAC，長(zhǎng)6bp3）作用：-35序列提供RNA酶識(shí)別信號(hào)-10序列有助于DNA局部雙鏈解開(kāi)（多為A=T對(duì)，只有一個(gè)G-C對(duì)）-35~~~-10方向?yàn)檗D(zhuǎn)錄方向（由于啟動(dòng)子是不對(duì)稱的，所以轉(zhuǎn)錄是有方向性的）第12章DNA復(fù)制例：真核生物中RNA酶B（轉(zhuǎn)錄mRNA）啟動(dòng)子有三個(gè)保守區(qū)1）TATA框（hogness）中心在-25~-30，長(zhǎng)7bp的序列，其堿基頻率為T82A97A85A63/T37A83A50/T37它決定轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)。2）CAAT框在-75的9bp序列，為GGT/CCAATCT與RNA聚合酶的結(jié)合有關(guān)。3）更上游有GC框長(zhǎng)6bp，可與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，為GGGCGG第12章DNA復(fù)制三．終止子和終止因子1．終止子：提供轉(zhuǎn)錄停止信號(hào)的DNA序列。2．終止因子：協(xié)助RNA聚合酶識(shí)別終止信號(hào)的輔助因子（蛋白質(zhì)，如Rho因子）3．抗終止因子：引起抗終止作用的蛋白質(zhì)。4．通讀：抗終止因子可阻止終止子的作用，使酶越過(guò)終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，這稱為通讀。第12章DNA復(fù)制5．Rho因子：Rho因子：分子量為55000的蛋白質(zhì)，在RNA存在進(jìn)能水解NTP，即它具有依賴于RNA的NTP水解活力。它結(jié)合在新產(chǎn)生的RNA鏈上，利用水解NTP得到的能量推動(dòng)其沿RNA鏈移動(dòng)（在RNA聚合酶之后）當(dāng)RNA聚合酶遇到終止子暫停時(shí)，Rho因子追上酶，并與酶相互作用，釋放RNA，使RNA酶與Rho因子一起從DNA上脫下。（它具有RNA-DNA解螺旋酶作用）第12章DNA復(fù)制6．大腸桿菌E.coli中的終止因子1）簡(jiǎn)單終止子或不依賴于Rho（ρ）因子的終止子在終止點(diǎn)前有一回文結(jié)構(gòu)，形成由莖環(huán)構(gòu)成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)；在發(fā)夾與終點(diǎn)之前有6個(gè)UMP，提供信號(hào)使RNA聚合酶脫離；回文對(duì)稱區(qū)有G-C序列。2）依賴于Rho的終止子其終止點(diǎn)前有一個(gè)較小的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，回文區(qū)不富有G-C；在發(fā)夾與終止點(diǎn)之前也無(wú)U序列；需要有Rho（ρ）因子的協(xié)助進(jìn)行終止作用。第12章DNA復(fù)制四、RNA的成熟（轉(zhuǎn)錄后加工）由RNA聚合酶合成的原初轉(zhuǎn)錄物需一系列的變化，包括鏈的裂解、5`端和3`端的切除、特殊結(jié)構(gòu)的形成、堿基修飾、糖苷鍵的改變和拼接等過(guò)程，變成成熟的（有活性的）RNA分子。斷裂基因：真核生物的基團(tuán)多被居間序列（內(nèi)含子）分隔開(kāi)，成為一個(gè)一個(gè)外顯子。轉(zhuǎn)錄后的長(zhǎng)鏈要剪切拼接，除去內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。第12章DNA復(fù)制（一）．原核生物中RNA的加工1．rRNA前體的加