不結(jié)球白菜BcICE1基因的克隆解析與抗寒功能探究VIP

不結(jié)球白菜BcICE1基因的克隆解析與抗寒功能探究一、引言1.1研究背景與目的不結(jié)球白菜（Brassicacampestrisssp.chinensis）作為十字花科蕓薹屬蕓薹種的重要亞種，是一種一、二年生草本植物。其擁有豐富的種質(zhì)資源，生長(zhǎng)周期較短，單位面積產(chǎn)量高且易于栽培。在我國(guó)中部及以南地區(qū)，不結(jié)球白菜可周年栽培種植，在蔬菜市場(chǎng)中占據(jù)著重要的地位。2021年，其全國(guó)栽培面積已達(dá)133.33萬(wàn)hm2，相比2005年增長(zhǎng)了2.5倍，充分顯示出其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要性。不結(jié)球白菜不僅產(chǎn)量可觀，還富含礦物質(zhì)、膳食纖維以及各類維生素，這些營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)調(diào)節(jié)人體酸堿平衡、促進(jìn)新陳代謝以及預(yù)防疾病等方面都發(fā)揮著重要作用。然而，不結(jié)球白菜喜冷涼氣候，低溫對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)有著顯著影響。當(dāng)遭遇低溫時(shí)，不結(jié)球白菜的生長(zhǎng)進(jìn)程會(huì)受到阻礙，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致植株死亡，進(jìn)而造成減產(chǎn)。低溫還可能引發(fā)提前抽薹現(xiàn)象，這會(huì)極大地降低其商品價(jià)值。例如，在一些冬季較為寒冷的地區(qū)，不結(jié)球白菜如果不能抵御低溫，就會(huì)出現(xiàn)葉片凍傷、生長(zhǎng)停滯等問(wèn)題，使得農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收益受損。因此，提高不結(jié)球白菜的抗寒性，對(duì)于保障其產(chǎn)量和品質(zhì)，以及滿足市場(chǎng)的穩(wěn)定供應(yīng)都具有關(guān)鍵意義。在植物應(yīng)對(duì)低溫脅迫的過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。ICE1（InducerofCBFExpression1）轉(zhuǎn)錄因子作為植物抗寒調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成員，能夠通過(guò)與CBF（C-repeatBindingFactor）基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定順式作用元件結(jié)合，激活CBF基因的表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)下游一系列冷響應(yīng)基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗寒能力。目前，在擬南芥、水稻、小麥等多種植物中，對(duì)ICE1基因的功能和調(diào)控機(jī)制已有較為深入的研究。例如，在擬南芥中，ice1突變體在低溫脅迫下表現(xiàn)出明顯的抗寒能力下降，而過(guò)量表達(dá)ICE1基因則能顯著提高植株的抗寒性能。然而，在不結(jié)球白菜中，關(guān)于ICE1基因的研究仍相對(duì)較少，其基因序列、結(jié)構(gòu)特征以及在抗寒過(guò)程中的具體功能和調(diào)控機(jī)制尚不完全明確。本研究旨在克隆不結(jié)球白菜抗寒轉(zhuǎn)錄因子BcICE1基因，并對(duì)其進(jìn)行功能分析。通過(guò)對(duì)BcICE1基因的克隆，獲得其完整的基因序列，深入分析其結(jié)構(gòu)特征，包括開(kāi)放閱讀框、編碼的氨基酸序列以及保守結(jié)構(gòu)域等，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。在功能分析方面，通過(guò)基因表達(dá)分析，明確BcICE1基因在不同組織以及低溫脅迫下的表達(dá)模式，了解其表達(dá)與不結(jié)球白菜抗寒性的關(guān)聯(lián)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將BcICE1基因?qū)霐M南芥中，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗寒性分析，直觀地驗(yàn)證該基因在提高植物抗寒能力方面的作用。通過(guò)酵母雙雜交等技術(shù)篩選與BcICE1蛋白相互作用的蛋白，進(jìn)一步揭示其在不結(jié)球白菜抗寒調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用機(jī)制。本研究的成果將為不結(jié)球白菜的抗寒育種提供重要的理論依據(jù)和基因資源，有助于培育出更具抗寒能力的不結(jié)球白菜新品種，從而提高其在低溫環(huán)境下的產(chǎn)量和品質(zhì)，保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的穩(wěn)定發(fā)展。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在不結(jié)球白菜抗寒研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了一定成果。在抗寒種質(zhì)資源篩選方面，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位經(jīng)過(guò)多代篩選，獲得了‘矮腳黃’‘蘇州青’等36份耐寒的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源。通過(guò)對(duì)不同品種不結(jié)球白菜在低溫脅迫下的生理生化指標(biāo)分析，發(fā)現(xiàn)四倍體不結(jié)球白菜的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和保護(hù)酶活性在低溫脅迫過(guò)程中始終明顯高于二倍體，電解質(zhì)外滲率和丙二醛含量低于二倍體，表明四倍體不結(jié)球白菜抗寒性更強(qiáng)。對(duì)烏塌菜等品種的研究也表明，其在低溫下的光合及熒光特性變化與耐寒性密切相關(guān)。在植物抗寒分子機(jī)制研究中，ICE1轉(zhuǎn)錄因子成為重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。在模式植物擬南芥中，ICE1基因的功能和調(diào)控機(jī)制已被深入研究。ICE1蛋白能夠特異性地結(jié)合到CBF基因啟動(dòng)子區(qū)域的MYC識(shí)別元件上，激活CBF基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控下游一系列冷響應(yīng)基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗寒能力。ice1突變體在低溫脅迫下，CBF基因及其下游冷響應(yīng)基因的表達(dá)量顯著降低，植株抗寒能力明顯下降。而過(guò)量表達(dá)ICE1基因的擬南芥植株，在低溫脅迫下能夠維持較高的相對(duì)電導(dǎo)率、脯氨酸含量和抗氧化酶活性，從而增強(qiáng)對(duì)低溫的耐受性。在其他植物中，ICE1基因也展現(xiàn)出重要的抗寒功能。在水稻中，OsICE1基因參與了低溫脅迫響應(yīng)，過(guò)表達(dá)OsICE1基因能夠提高水稻對(duì)低溫的抗性，其作用機(jī)制與調(diào)控CBF類似基因的表達(dá)有關(guān)。在小麥中，TaICE1基因的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)，通過(guò)調(diào)節(jié)下游冷響應(yīng)基因的表達(dá)，增強(qiáng)小麥的抗寒能力。在番茄中，SlICE1基因不僅參與低溫脅迫響應(yīng)，還在鹽脅迫和干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用，說(shuō)明ICE1基因在植物應(yīng)對(duì)多種非生物脅迫中具有重要地位。相比之下，不結(jié)球白菜中關(guān)于ICE1基因的研究起步較晚。雖然已從大白菜中分離出BcICE1基因的cDNA序列，該基因全長(zhǎng)1591bp，含有一個(gè)1494bp長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀框，編碼497個(gè)氨基酸，蛋白C端含有典型的bHLH結(jié)構(gòu)域，與其他植物的ICE1蛋白具有較高同源性，但對(duì)于不結(jié)球白菜BcICE1基因的研究仍存在諸多不足。目前，對(duì)于不結(jié)球白菜BcICE1基因的克隆和序列分析尚不完善，其氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析不夠深入，不同脅迫處理下該基因的表達(dá)模式尚未完全明確。在BcICE1蛋白功能研究方面，其亞細(xì)胞定位雖有初步探索，但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗(yàn)證其抗寒功能的研究也有待加強(qiáng)。對(duì)于BcICE1蛋白在不結(jié)球白菜抗寒調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用機(jī)制，如與其他蛋白的相互作用以及對(duì)下游冷響應(yīng)基因的調(diào)控等方面，研究還較為匱乏。深入開(kāi)展不結(jié)球白菜BcICE1基因的研究，對(duì)于揭示其抗寒分子機(jī)制，培育抗寒新品種具有重要意義。1.3研究的意義和創(chuàng)新點(diǎn)本研究對(duì)于不結(jié)球白菜的抗寒育種以及植物抗寒分子機(jī)制的理論研究都具有重要意義。在抗寒育種實(shí)踐方面，不結(jié)球白菜作為我國(guó)重要的蔬菜作物，低溫脅迫嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。通過(guò)對(duì)BcICE1基因的克隆與功能分析，有望為不結(jié)球白菜的抗寒育種提供關(guān)鍵的基因資源。將BcICE1基因?qū)氩唤Y(jié)球白菜中，有可能培育出抗寒性更強(qiáng)的新品種，這不僅能減少低溫對(duì)不結(jié)球白菜生長(zhǎng)發(fā)育的不利影響，保障其產(chǎn)量穩(wěn)定，還能擴(kuò)大其種植區(qū)域，滿足不同地區(qū)的市場(chǎng)需求。例如，在北方冬季較為寒冷的地區(qū)，若能種植抗寒的不結(jié)球白菜新品種，將豐富當(dāng)?shù)氐氖卟斯?yīng)種類，提高農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收益。從理論研究角度來(lái)看，雖然在其他植物中對(duì)ICE1基因已有一定研究，但不結(jié)球白菜中BcICE1基因的相關(guān)研究還較為匱乏。本研究深入分析BcICE1基因的結(jié)構(gòu)特征、表達(dá)模式以及蛋白功能和作用機(jī)制，有助于填補(bǔ)不結(jié)球白菜在這方面的研究空白。這將進(jìn)一步完善植物抗寒分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理論體系，為深入理解植物響應(yīng)低溫脅迫的分子機(jī)制提供新的視角和依據(jù)。例如，通過(guò)揭示BcICE1蛋白與其他蛋白的相互作用關(guān)系，以及對(duì)下游冷響應(yīng)基因的調(diào)控機(jī)制，能夠更全面地認(rèn)識(shí)不結(jié)球白菜抗寒過(guò)程中的分子事件，為其他植物的抗寒研究提供借鑒。本研究可能的創(chuàng)新點(diǎn)在于，首次較為系統(tǒng)地對(duì)不結(jié)球白菜BcICE1基因進(jìn)行克隆與功能分析。在研究過(guò)程中，綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的生物技術(shù)和實(shí)驗(yàn)方法，如利用高效的基因克隆技術(shù)獲得BcICE1基因的完整序列，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)精確分析其在不同脅迫處理下的表達(dá)模式，借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)和酵母雙雜交等技術(shù)深入探究其蛋白功能和作用機(jī)制。這種多技術(shù)聯(lián)用的研究方式，有望在不結(jié)球白菜抗寒分子機(jī)制研究方面取得新的突破。此外，通過(guò)對(duì)BcICE1基因的研究，有可能發(fā)現(xiàn)不結(jié)球白菜中獨(dú)特的抗寒調(diào)控途徑或與其他植物不同的調(diào)控機(jī)制，為植物抗寒研究領(lǐng)域帶來(lái)新的發(fā)現(xiàn)和啟示。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1不結(jié)球白菜概述不結(jié)球白菜（Brassicacampestrisssp.chinensis），在植物分類學(xué)上屬于十字花科（Brassicaceae）蕓薹屬（Brassica）蕓薹種（Brassicacampestris）的一個(gè)亞種。它是一、二年生草本植物，在我國(guó)有著悠久的栽培歷史，是深受人們喜愛(ài)的重要蔬菜之一。不結(jié)球白菜植株相對(duì)矮小，根系為淺根系，須根發(fā)達(dá)，這使得它對(duì)土壤的適應(yīng)性較強(qiáng)，能夠在多種類型的土壤中生長(zhǎng)，但以疏松肥沃、排水良好的壤土或砂壤土最為適宜。其葉片形態(tài)豐富多樣，葉色從淡綠到墨綠不等，葉片形狀有倒卵形、橢圓形等，有的葉片光滑，有的則具有褶皺，少數(shù)還帶有絨毛。葉柄通常較為肥厚，顏色為白色或綠色，這也是區(qū)分不同品種不結(jié)球白菜的重要特征之一。不結(jié)球白菜的花為黃色，花瓣呈長(zhǎng)圓形，花期一般在春季，花朵小巧而密集，具有一定的觀賞價(jià)值。其果實(shí)為長(zhǎng)角果，成熟時(shí)開(kāi)裂，內(nèi)含多粒近圓形的種子，種子顏色多為紫褐色。不結(jié)球白菜喜冷涼氣候，在溫和的溫度條件下生長(zhǎng)良好。它對(duì)光照的需求適中，充足的光照有助于光合作用的進(jìn)行，促進(jìn)植株的生長(zhǎng)和發(fā)育，但在夏季高溫強(qiáng)光時(shí)，需要適當(dāng)遮蔭，以免葉片受到灼傷。在水分管理方面，由于其葉面柔嫩，蒸發(fā)量大，需要較高的土壤濕度和空氣濕度，但同時(shí)也要注意避免積水，以防根部腐爛。不結(jié)球白菜生長(zhǎng)周期較短，從播種到收獲一般只需30-60天，這使得它能夠在短時(shí)間內(nèi)為市場(chǎng)提供新鮮的蔬菜，滿足人們的日常需求。在我國(guó)，不結(jié)球白菜的分布極為廣泛，南北方各省均有種植。在南方地區(qū)，因其氣候溫暖濕潤(rùn)，不結(jié)球白菜可實(shí)現(xiàn)周年栽培，成為當(dāng)?shù)厥卟斯?yīng)的重要組成部分。例如在長(zhǎng)江流域，不結(jié)球白菜是常見(jiàn)的蔬菜品種，種植面積大，產(chǎn)量高，不僅供應(yīng)本地市場(chǎng)，還大量運(yùn)往北方地區(qū)。在北方，雖然冬季較為寒冷，但隨著設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展，不結(jié)球白菜也能在溫室中栽培，實(shí)現(xiàn)反季節(jié)供應(yīng)，豐富了冬季蔬菜市場(chǎng)的品種。不結(jié)球白菜在國(guó)外也有一定的種植區(qū)域，如日本、韓國(guó)等亞洲國(guó)家，以及一些歐美國(guó)家的華人社區(qū)，它逐漸受到越來(lái)越多國(guó)際消費(fèi)者的青睞。不結(jié)球白菜在蔬菜產(chǎn)業(yè)中占據(jù)著重要地位。它不僅是人們?nèi)粘２妥郎系某Ｒ?jiàn)蔬菜，可炒、煮、涼拌、做湯等，烹飪方式多樣，滿足了不同人群的口味需求，還因其生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)量高、易于栽培等特點(diǎn)，為農(nóng)民提供了重要的經(jīng)濟(jì)收入來(lái)源。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，不結(jié)球白菜的種植對(duì)于合理利用土地資源、調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)具有重要意義。同時(shí)，不結(jié)球白菜富含礦物質(zhì)、膳食纖維以及多種維生素，如維生素C、維生素K、葉酸等，這些營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)人體健康有著重要作用，能夠調(diào)節(jié)人體酸堿平衡，促進(jìn)新陳代謝，預(yù)防多種疾病，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、健康的蔬菜。2.2低溫對(duì)植物的影響2.2.1冷害和凍害低溫對(duì)植物的影響主要包括冷害和凍害兩種類型，這兩種危害都會(huì)對(duì)不結(jié)球白菜的生理生化和生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生顯著影響。冷害是指在零上低溫（一般為0-15℃）條件下，植物所遭受的傷害。對(duì)于不結(jié)球白菜而言，冷害會(huì)導(dǎo)致其生理生化過(guò)程發(fā)生一系列變化。在細(xì)胞膜系統(tǒng)方面，冷害會(huì)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，使細(xì)胞膜的透性增大，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)外滲，導(dǎo)致電解質(zhì)滲漏率增加。例如，在低溫脅迫下，不結(jié)球白菜葉片的電解質(zhì)滲漏率會(huì)明顯上升，這表明細(xì)胞膜受到了損傷，影響了細(xì)胞的正常生理功能。在光合作用方面，冷害會(huì)抑制光合作用相關(guān)酶的活性，如RuBP羧化酶等，從而降低光合作用的效率。不結(jié)球白菜的凈光合速率會(huì)下降，影響其對(duì)光能的利用和碳水化合物的合成，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)緩慢，葉片發(fā)黃、變薄。同時(shí)，冷害還會(huì)影響呼吸作用，使呼吸速率發(fā)生變化，最初可能會(huì)升高以補(bǔ)償能量的不足，但隨著冷害時(shí)間的延長(zhǎng)，呼吸速率會(huì)逐漸下降，影響植株的能量代謝。在生長(zhǎng)發(fā)育方面，冷害會(huì)使不結(jié)球白菜的生長(zhǎng)受到抑制，生長(zhǎng)速度減緩，植株矮小。冷害還可能導(dǎo)致葉片變形、卷曲，影響其正常的形態(tài)建成。在生殖生長(zhǎng)階段，冷害會(huì)影響花芽分化和開(kāi)花結(jié)實(shí)，導(dǎo)致花器官發(fā)育異常，結(jié)實(shí)率降低，嚴(yán)重影響不結(jié)球白菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。凍害則是指在零下低溫條件下，植物細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損的現(xiàn)象。當(dāng)不結(jié)球白菜遭受凍害時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的冰晶會(huì)破壞細(xì)胞膜、細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞功能喪失。冰晶的形成還會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的水分被固定，造成細(xì)胞脫水，進(jìn)一步加劇細(xì)胞的損傷。在生理生化方面，凍害會(huì)導(dǎo)致不結(jié)球白菜的蛋白質(zhì)變性，酶活性喪失，代謝紊亂。例如，超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）等抗氧化酶的活性會(huì)在凍害后急劇下降，無(wú)法有效清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，導(dǎo)致活性氧積累，對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。在生長(zhǎng)發(fā)育方面，凍害會(huì)使不結(jié)球白菜的葉片出現(xiàn)凍傷斑，嚴(yán)重時(shí)葉片會(huì)枯萎、死亡。如果凍害發(fā)生在生長(zhǎng)的關(guān)鍵時(shí)期，如幼苗期或蓮座期，可能會(huì)導(dǎo)致植株死亡，造成嚴(yán)重的減產(chǎn)。即使植株在凍害后存活下來(lái)，其生長(zhǎng)也會(huì)受到嚴(yán)重影響，恢復(fù)生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)量和品質(zhì)也會(huì)大幅下降。冷害和凍害對(duì)不結(jié)球白菜的影響是多方面的，不僅會(huì)影響其生理生化過(guò)程，還會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)產(chǎn)生嚴(yán)重的制約。因此，深入研究不結(jié)球白菜對(duì)低溫的響應(yīng)機(jī)制，提高其抗寒能力，對(duì)于保障不結(jié)球白菜的生產(chǎn)具有重要意義。2.2.2植物感受低溫的分子機(jī)制植物能夠感知低溫信號(hào)，并啟動(dòng)一系列生理生化反應(yīng)來(lái)適應(yīng)低溫環(huán)境，這一過(guò)程涉及復(fù)雜的分子機(jī)制。目前的研究表明，植物感受低溫的分子機(jī)制主要與細(xì)胞膜流動(dòng)性、鈣離子通道以及雙組分磷酸系統(tǒng)等密切相關(guān)。細(xì)胞膜是植物細(xì)胞與外界環(huán)境的界面，也是感知低溫信號(hào)的重要部位。當(dāng)植物受到低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞膜的流動(dòng)性會(huì)發(fā)生變化。細(xì)胞膜主要由磷脂雙分子層和膜蛋白組成，低溫會(huì)使磷脂分子的運(yùn)動(dòng)減緩，導(dǎo)致細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低。這種變化會(huì)被細(xì)胞膜上的一些感受器所感知，從而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。例如，某些膜蛋白可能會(huì)因?yàn)榧?xì)胞膜流動(dòng)性的改變而發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)而激活與之相關(guān)的信號(hào)通路，將低溫信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部。鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，在植物感受低溫信號(hào)的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)植物感知到低溫時(shí)，細(xì)胞膜上的鈣離子通道會(huì)被激活，導(dǎo)致細(xì)胞外的鈣離子迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子濃度瞬間升高。這種鈣離子濃度的變化可以激活下游一系列依賴鈣離子的蛋白激酶，如鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）等。這些蛋白激酶可以通過(guò)磷酸化作用激活或抑制其他信號(hào)分子，從而將低溫信號(hào)進(jìn)一步傳遞下去，最終引發(fā)植物的低溫響應(yīng)基因表達(dá)和生理生化變化。雙組分磷酸系統(tǒng)也是植物感知低溫的重要途徑之一。雙組分系統(tǒng)通常由一個(gè)組氨酸激酶（HK）和一個(gè)反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（RR）組成。在低溫信號(hào)感知過(guò)程中，組氨酸激酶可以感知低溫信號(hào)，并自身發(fā)生磷酸化，然后將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白上。磷酸化的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白可以結(jié)合到特定的DNA序列上，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，從而啟動(dòng)植物的低溫響應(yīng)機(jī)制。例如，在擬南芥中，一些雙組分系統(tǒng)相關(guān)基因的突變會(huì)影響植物對(duì)低溫的響應(yīng)能力，說(shuō)明雙組分磷酸系統(tǒng)在植物感受低溫信號(hào)和啟動(dòng)抗寒反應(yīng)中具有重要作用。植物感受低溫的分子機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞膜流動(dòng)性的變化、鈣離子通道的激活以及雙組分磷酸系統(tǒng)的參與等多個(gè)環(huán)節(jié)相互協(xié)作，共同完成對(duì)低溫信號(hào)的感知和傳遞，從而使植物能夠啟動(dòng)相應(yīng)的抗寒機(jī)制來(lái)適應(yīng)低溫環(huán)境。深入研究這些分子機(jī)制，對(duì)于揭示植物抗寒的本質(zhì)，提高植物的抗寒性具有重要的理論和實(shí)踐意義。2.3轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展2.3.1ICE1轉(zhuǎn)錄因子ICE1轉(zhuǎn)錄因子屬于bHLH（basichelix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子家族，其結(jié)構(gòu)具有典型的bHLH結(jié)構(gòu)域特征。bHLH結(jié)構(gòu)域由大約60個(gè)氨基酸組成，包含一個(gè)高度保守的堿性區(qū)域和一個(gè)HLH區(qū)域。堿性區(qū)域位于N端，富含精氨酸和賴氨酸等堿性氨基酸，能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合DNA序列中的E-box元件（CANNTG）。HLH區(qū)域則由兩個(gè)α-螺旋通過(guò)一個(gè)環(huán)區(qū)連接而成，這一結(jié)構(gòu)對(duì)于ICE1蛋白與其他bHLH蛋白形成同源或異源二聚體至關(guān)重要，二聚體的形成能夠增強(qiáng)其與DNA的結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。除了bHLH結(jié)構(gòu)域，ICE1蛋白還可能包含其他功能區(qū)域，如轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域等，這些區(qū)域在ICE1激活下游基因表達(dá)的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在植物抗寒過(guò)程中，ICE1轉(zhuǎn)錄因子起著核心調(diào)控作用。當(dāng)植物感受到低溫信號(hào)后，ICE1基因被誘導(dǎo)表達(dá)，合成的ICE1蛋白能夠通過(guò)其bHLH結(jié)構(gòu)域與CBF基因啟動(dòng)子區(qū)域的MYC識(shí)別元件（CANNTG）結(jié)合。這種結(jié)合能夠招募轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物等相關(guān)因子，促進(jìn)CBF基因的轉(zhuǎn)錄，從而激活下游一系列冷響應(yīng)基因（COR）的表達(dá)。這些冷響應(yīng)基因編碼的產(chǎn)物包括抗凍蛋白、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成酶、抗氧化酶等，它們從多個(gè)方面提高植物的抗寒能力。抗凍蛋白能夠降低細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成溫度，減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成酶可以促進(jìn)脯氨酸、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成，調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，維持細(xì)胞的正常生理功能；抗氧化酶則能夠清除細(xì)胞內(nèi)由于低溫脅迫產(chǎn)生的活性氧，減輕氧化損傷。ICE1轉(zhuǎn)錄因子的活性還受到多種翻譯后修飾的調(diào)控。磷酸化修飾是其中一種重要的調(diào)控方式，蛋白激酶能夠使ICE1蛋白的特定氨基酸殘基發(fā)生磷酸化，從而影響其活性。例如，在擬南芥中，BIN2蛋白激酶可以磷酸化ICE1蛋白，促進(jìn)其被26S蛋白酶體降解，從而負(fù)調(diào)控ICE1的活性。泛素化修飾也參與了ICE1的調(diào)控過(guò)程，E3泛素連接酶能夠?qū)⒎核胤肿舆B接到ICE1蛋白上，使其被蛋白酶體識(shí)別并降解。SUMO化修飾則可以增強(qiáng)ICE1蛋白的穩(wěn)定性和活性，促進(jìn)其對(duì)CBF基因的激活作用。這些翻譯后修飾相互協(xié)調(diào)，精細(xì)地調(diào)控著ICE1轉(zhuǎn)錄因子的活性，確保植物在低溫脅迫下能夠及時(shí)、有效地啟動(dòng)抗寒機(jī)制。2.3.2轉(zhuǎn)錄因子CBF/DREB1CBF（C-repeatBindingFactor），又稱為DREB1（DehydrationResponsiveElementBindingprotein1），屬于AP2/ERF（APETALA2/EthyleneResponsiveFactor）轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物低溫響應(yīng)過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。CBF轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)具有典型的AP2結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由大約60個(gè)氨基酸組成，是CBF蛋白與DNA結(jié)合以及發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的關(guān)鍵區(qū)域。AP2結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合DNA序列中的CRT/DRE（C-repeat/DehydrationResponsiveElement）元件，其核心序列為GCCGAC。通過(guò)與CRT/DRE元件的結(jié)合，CBF轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控下游一系列冷響應(yīng)基因（COR）的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物對(duì)低溫脅迫的耐受性。在植物低溫響應(yīng)的調(diào)控途徑中，CBF轉(zhuǎn)錄因子處于核心地位。當(dāng)植物受到低溫刺激時(shí)，細(xì)胞膜流動(dòng)性的改變、鈣離子濃度的變化等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程被激活，最終導(dǎo)致CBF基因的迅速表達(dá)。CBF基因的表達(dá)產(chǎn)物CBF蛋白能夠結(jié)合到下游冷響應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的CRT/DRE元件上，招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，促進(jìn)冷響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。這些冷響應(yīng)基因編碼的產(chǎn)物參與了植物抗寒的多個(gè)生理過(guò)程。一些基因編碼的蛋白能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減少低溫對(duì)細(xì)胞膜的損傷；一些基因編碼的酶參與了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成，如脯氨酸、可溶性糖等，這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，防止細(xì)胞在低溫下失水；還有一些基因編碼的抗氧化酶能夠清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧，減輕低溫脅迫引起的氧化損傷。CBF轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和活性也受到多種因素的調(diào)控。在轉(zhuǎn)錄水平上，ICE1轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)結(jié)合到CBF基因啟動(dòng)子區(qū)域的MYC識(shí)別元件上，激活CBF基因的表達(dá)。一些植物激素也參與了CBF基因表達(dá)的調(diào)控，如脫落酸（ABA）、乙烯等。ABA可以通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)CBF基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗寒性；而乙烯則可能通過(guò)抑制CBF基因的表達(dá)，負(fù)調(diào)控植物的抗寒能力。在翻譯后水平上，CBF蛋白的活性可能受到磷酸化、泛素化等修飾的影響。磷酸化修飾可以改變CBF蛋白的活性和穩(wěn)定性，影響其與DNA的結(jié)合能力以及對(duì)下游基因的調(diào)控作用；泛素化修飾則可能參與了CBF蛋白的降解過(guò)程，調(diào)節(jié)其在細(xì)胞內(nèi)的含量和活性。這些調(diào)控機(jī)制相互協(xié)作，確保CBF轉(zhuǎn)錄因子在植物低溫響應(yīng)過(guò)程中能夠發(fā)揮準(zhǔn)確、有效的調(diào)控作用。2.4不依賴CBFs的信號(hào)途徑雖然以CBF為核心的信號(hào)途徑在植物抗寒中起著關(guān)鍵作用，但越來(lái)越多的研究表明，植物還存在不依賴CBFs的抗寒信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在擬南芥中，HSFC1（HeatShockFactorC1）轉(zhuǎn)錄因子被證明以不依賴CBF的途徑調(diào)節(jié)低溫反應(yīng)。HSFC1能夠直接調(diào)控一些冷響應(yīng)基因的表達(dá)，這些基因編碼的產(chǎn)物參與了植物的抗寒過(guò)程，如調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、參與滲透調(diào)節(jié)等。研究發(fā)現(xiàn)，HSFC1過(guò)表達(dá)植株在低溫脅迫下的抗寒能力顯著增強(qiáng)，而hsfc1突變體的抗寒能力則明顯下降。ZAT12（ZincFingerofArabidopsisThaliana12）和CZF1（C2H2ZincFingerProtein1）等轉(zhuǎn)錄因子也參與了不依賴CBF的低溫響應(yīng)。ZAT12可以通過(guò)調(diào)控一些與氧化還原平衡相關(guān)的基因表達(dá)，增強(qiáng)植物在低溫脅迫下的抗氧化能力，從而提高抗寒能力。CZF1則可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子的活性，間接影響植物的抗寒相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控植物的抗寒反應(yīng)。在其他植物中也發(fā)現(xiàn)了不依賴CBFs的抗寒信號(hào)途徑。在水稻中，一些轉(zhuǎn)錄因子如OsMYB3R-2等，能夠通過(guò)不依賴CBF的方式調(diào)控冷響應(yīng)基因的表達(dá)，增強(qiáng)水稻的抗寒性。OsMYB3R-2可以與特定的DNA序列結(jié)合，激活下游抗寒相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而提高水稻對(duì)低溫的耐受性。在小麥中，TaWRKY19等轉(zhuǎn)錄因子參與了不依賴CBF的低溫響應(yīng)過(guò)程，通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)小麥的抗寒能力。不依賴CBFs的信號(hào)途徑與依賴CBFs的信號(hào)途徑之間并非完全獨(dú)立，它們可能存在相互作用和交叉調(diào)控。一些植物激素如油菜素甾醇（BR），既可以通過(guò)CBF信號(hào)途徑正調(diào)控植物抗凍性，也可以通過(guò)不依賴CBF的信號(hào)途徑發(fā)揮作用。BR可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)分子的活性，影響植物的抗寒相關(guān)基因表達(dá)，從而在不同的信號(hào)途徑中共同調(diào)控植物的抗寒能力。不依賴CBFs的信號(hào)途徑在植物抗寒中也具有重要作用，豐富了植物抗寒調(diào)控的分子機(jī)制。深入研究這些信號(hào)途徑，有助于全面了解植物抗寒的分子網(wǎng)絡(luò)，為提高植物的抗寒性提供更多的理論依據(jù)和基因資源。三、不結(jié)球白菜BcICE1基因克隆3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)選用不結(jié)球白菜品種‘NHCC001’，該品種具有生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜系統(tǒng)生物學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供。將種子播種于裝有基質(zhì)（草炭：蛭石=3:1，v/v）的育苗盤中，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度200μmol?m-2?s-1，光照時(shí)間16h/d，晝夜溫度25℃/18℃，相對(duì)濕度60%-70%。待幼苗長(zhǎng)至三葉一心期時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中使用的主要試劑包括：RNA提取試劑盒（TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRaPrimeScript?RTreagentKitwithgDNAEraser）、DNA聚合酶（TaKaRaTaq?HotStartVersion）、DNAMarker（DL2000、DL5000）、限制性內(nèi)切酶（BamHI、SalI等）、T4DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒（OmegaBio-tekPlasmidMiniKit）、凝膠回收試劑盒（OmegaBio-tekGelExtractionKit）等，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司和OmegaBio-tek公司。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，pMD19-T載體購(gòu)自TaKaRa公司，pEarlyGate101植物表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備主要有：高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf5424R）、PCR儀（Bio-RadT100）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadGelDocXR+）、核酸蛋白分析儀（ThermoScientificNanoDrop2000）、恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、光照培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）等。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法采用TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit提取不結(jié)球白菜葉片總RNA。取約100mg新鮮葉片，在液氮中迅速研磨成粉末，加入1mLTRIzol試劑，充分勻漿。室溫靜置5min后，加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃，12000rpm離心15min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min。4℃，12000rpm離心10min，棄上清液，RNA沉淀用75%乙醇洗滌兩次，晾干后用適量的DEPC處理水溶解。使用ThermoScientificNanoDrop2000核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA的濃度和純度，要求A260/A280在1.8-2.0之間，A260/A230大于2.0。同時(shí)，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，28SrRNA和18SrRNA條帶清晰，且28SrRNA的亮度約為18SrRNA的2倍，表明RNA質(zhì)量良好。取1μg總RNA，按照TaKaRaPrimeScript?RTreagentKitwithgDNAEraser說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系為：5×PrimeScriptBuffer2μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μL，OligodTPrimer(50μM)0.5μL，Random6mers(100μM)0.5μL，總RNA1μg，RNaseFreedH2O補(bǔ)足至10μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。合成的cDNA保存于-20℃冰箱備用。根據(jù)GenBank中已公布的大白菜ICE1基因序列（登錄號(hào)：HQ902162），利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物BcICE1-F：5'-ATGGCGGAGAAGAAGAAGAAG-3'，下游引物BcICE1-R：5'-TCACACACACACACACACACA-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以不結(jié)球白菜葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2×TaqPCRMasterMix25μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，cDNA模板2μL，ddH2O21μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否有目的條帶。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pMD19-T載體按照1:3（摩爾比）的比例混合，加入T4DNA連接酶，16℃連接過(guò)夜。連接體系為：pMD19-TVector1μL，PCR產(chǎn)物4μL，SolutionI5μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。取5μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min。42℃熱激90s，迅速冰浴2min。加入800μL無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。將菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（Amp，50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。挑取白色單菌落，接種到含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。使用OmegaBio-tekPlasmidMiniKit提取質(zhì)粒，通過(guò)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定陽(yáng)性克隆。將鑒定正確的陽(yáng)性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1BcICE1克隆和序列分析以不結(jié)球白菜‘NHCC001’葉片cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的特異性引物BcICE1-F和BcICE1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在約1500bp處出現(xiàn)一條清晰的特異性條帶（圖1），與預(yù)期的BcICE1基因片段大小相符。將該P(yáng)CR產(chǎn)物回收后連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取白色單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定和質(zhì)粒酶切鑒定，均得到了與預(yù)期大小一致的條帶，表明成功構(gòu)建了含有BcICE1基因的重組質(zhì)粒。將陽(yáng)性克隆送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件分析，得到BcICE1基因的全長(zhǎng)cDNA序列。測(cè)序結(jié)果表明，不結(jié)球白菜BcICE1基因全長(zhǎng)1591bp，包含一個(gè)1494bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼497個(gè)氨基酸（圖2）。通過(guò)在線軟件ProtParam（/protparam/）分析其編碼蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示該蛋白的分子量為54.34kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為5.87，屬于酸性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)為43.74，屬于不穩(wěn)定蛋白。脂肪族氨基酸指數(shù)為83.34，總平均親水性為-0.459，表明該蛋白具有一定的親水性。利用在線軟件SMART（http://smart.embl.de/）對(duì)BcICE1蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其C端含有一個(gè)典型的bHLH結(jié)構(gòu)域（圖3），該結(jié)構(gòu)域由大約60個(gè)氨基酸組成，包含一個(gè)高度保守的堿性區(qū)域和一個(gè)HLH區(qū)域，是bHLH轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合以及形成二聚體的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，這與其他植物中ICE1蛋白的結(jié)構(gòu)特征一致，進(jìn)一步表明克隆得到的基因即為不結(jié)球白菜的BcICE1基因。3.2.2BcICE1氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析將不結(jié)球白菜BcICE1蛋白的氨基酸序列與其他植物ICE1蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，包括擬南芥（Arabidopsisthaliana）、歐洲油菜（Brassicanapus）、薺菜（Capsellarubella）等。使用ClustalW軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果顯示BcICE1蛋白與這些植物的ICE1蛋白具有較高的同源性（圖4）。在bHLH結(jié)構(gòu)域區(qū)域，氨基酸序列的保守性尤為顯著，其中堿性區(qū)域的氨基酸序列幾乎完全一致，這表明bHLH結(jié)構(gòu)域在不同植物的ICE1蛋白中具有重要的保守功能，可能在與DNA結(jié)合以及調(diào)控下游基因表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了進(jìn)一步分析BcICE1蛋白與其他植物ICE1蛋白的親緣關(guān)系，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod），Bootstrap值設(shè)置為1000次重復(fù)。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示（圖5），不結(jié)球白菜BcICE1蛋白與歐洲油菜、薺菜的ICE1蛋白聚為一支，親緣關(guān)系較近，這與它們?cè)谥参锓诸悓W(xué)上的親緣關(guān)系相符。而與擬南芥ICE1蛋白的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，但仍處于同一大的分支中，說(shuō)明它們?cè)谶M(jìn)化上具有一定的保守性和同源性。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了BcICE1基因的克隆準(zhǔn)確性，也為深入研究其功能提供了重要的參考依據(jù)。3.2.3不同脅迫處理下不結(jié)球白菜BcICE1基因表達(dá)分析對(duì)不結(jié)球白菜‘NHCC001’進(jìn)行4℃低溫和PEG-6000模擬干旱處理，分別在處理0h、1h、3h、6h、12h和24h時(shí)采集葉片樣品，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)BcICE1基因的表達(dá)水平變化。以不結(jié)球白菜Actin基因作為內(nèi)參基因，引物序列為Actin-F：5'-GGACTCTGGTGATGGTGTCAG-3'，Actin-R：5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'；BcICE1基因的RT-qPCR引物序列為BcICE1-qF：5'-CCAGCTGAAGAAGAAGAAGAAG-3'，BcICE1-qR：5'-TCACACACACACACACACACA-3'。低溫脅迫處理下，BcICE1基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)（圖6）。在處理1h時(shí)，BcICE1基因的表達(dá)量開(kāi)始顯著上調(diào)，與0h相比，表達(dá)量增加了約2.5倍（P<0.05）；在處理3h時(shí)，表達(dá)量達(dá)到峰值，為0h的4.8倍（P<0.01）；隨后表達(dá)量逐漸下降，但在處理24h時(shí)，仍顯著高于0h的表達(dá)水平（P<0.05）。這表明BcICE1基因能夠快速響應(yīng)低溫脅迫，其表達(dá)受低溫誘導(dǎo)，在低溫脅迫初期可能通過(guò)大量表達(dá)來(lái)啟動(dòng)植物的抗寒機(jī)制。在PEG-6000模擬干旱脅迫處理下，BcICE1基因的表達(dá)量也發(fā)生了明顯變化（圖6）。處理1h時(shí)，BcICE1基因的表達(dá)量略有上升，但差異不顯著（P>0.05）；處理3h時(shí)，表達(dá)量顯著上調(diào)，為0h的2.3倍（P<0.05）；在處理6h時(shí)，表達(dá)量達(dá)到最高，是0h的3.5倍（P<0.01）；之后表達(dá)量逐漸降低，在處理24h時(shí)，仍高于0h的表達(dá)水平，但差異不顯著（P>0.05）。這說(shuō)明BcICE1基因不僅對(duì)低溫脅迫有響應(yīng)，對(duì)干旱脅迫也能做出應(yīng)答，可能在不結(jié)球白菜應(yīng)對(duì)多種非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。四、不結(jié)球白菜BcICE1基因功能分析4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)選取哥倫比亞生態(tài)型（Col-0）野生型擬南芥作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，其具有生長(zhǎng)周期短、遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn)，便于后續(xù)的基因功能研究。擬南芥種子由本實(shí)驗(yàn)室保存，在4℃冰箱中低溫春化3天后，播種于裝有營(yíng)養(yǎng)土（蛭石：泥炭土=1:1，v/v）的花盆中，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度120μmol?m-2?s-1，光照時(shí)間16h/d，晝夜溫度22℃/18℃，相對(duì)濕度60%-70%。實(shí)驗(yàn)中使用的主要試劑包括：農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；卡那霉素（Kanamycin）、利福平（Rifampicin）、頭孢霉素（Cefotaxime）等抗生素均購(gòu)自Sigma公司；植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGENPlantGenomicDNAKit）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒與基因克隆實(shí)驗(yàn)中所用品牌相同；DAB（3,3'-Diaminobenzidine）染色試劑盒、NBT（NitroBlueTetrazolium）染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；丙二醛（MDA）含量測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備除基因克隆實(shí)驗(yàn)中使用的儀器外，還包括光照培養(yǎng)箱、人工氣候箱（用于模擬不同的環(huán)境脅迫條件）、冷凍離心機(jī)（用于植物組織細(xì)胞破碎后的離心分離）、酶標(biāo)儀（用于測(cè)定酶活性和物質(zhì)含量）、熒光顯微鏡（用于觀察GUS染色結(jié)果和GFP熒光信號(hào)）等。4.1.2實(shí)驗(yàn)方法將克隆得到的BcICE1基因連接到植物表達(dá)載體pEarlyGate101上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pEarlyGate101-BcICE1。利用凍融法將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單菌落接種于含有50μg/mL卡那霉素、50μg/mL利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。當(dāng)菌液OD600值達(dá)到0.6-0.8時(shí)，4℃，5000rpm離心10min，收集菌體，用含有5%蔗糖和0.02%SilwetL-77的1/2MS液體培養(yǎng)基重懸菌體，調(diào)整OD600值至0.8-1.0，用于轉(zhuǎn)化擬南芥。采用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥。將擬南芥植株的花序浸入農(nóng)桿菌菌液中，輕輕晃動(dòng)，使花序充分接觸菌液，浸染時(shí)間為3-5min。浸染后的植株用保鮮膜覆蓋，暗培養(yǎng)24h，然后轉(zhuǎn)移至正常光照條件下培養(yǎng)。待種子成熟后，收獲T0代種子。將T0代種子播種于含有50μg/mL卡那霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基上，篩選抗性幼苗。7-10天后，將抗性幼苗移栽至營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)。提取抗性植株的基因組DNA，以其為模板，利用BcICE1基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)目的基因是否整合到擬南芥基因組中。對(duì)PCR鑒定為陽(yáng)性的植株，進(jìn)一步提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)BcICE1基因的表達(dá)水平，篩選出表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)基因株系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的4周齡野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，進(jìn)行低溫脅迫處理。將植株置于4℃人工氣候箱中處理24h，然后轉(zhuǎn)移至-4℃人工氣候箱中處理6h，最后將植株放回正常生長(zhǎng)條件下恢復(fù)24h。以未處理的植株作為對(duì)照。處理結(jié)束后，觀察植株的生長(zhǎng)狀態(tài)，記錄葉片的萎蔫、發(fā)黃等癥狀。測(cè)定植株葉片的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、SOD活性和POD活性，以評(píng)估植株的抗寒性。相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定采用電導(dǎo)儀法，將葉片剪成小段，放入去離子水中，真空抽氣30min，然后在室溫下放置2h，測(cè)定初始電導(dǎo)率（C1）；將樣品煮沸15min，冷卻至室溫后測(cè)定終電導(dǎo)率（C2），相對(duì)電導(dǎo)率=C1/C2×100%。MDA含量的測(cè)定按照南京建成生物工程研究所的MDA含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，通過(guò)測(cè)定532nm和600nm波長(zhǎng)下的吸光值，計(jì)算MDA含量。SOD活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法，在560nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以抑制NBT光化還原50%為一個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算SOD活性。POD活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，在470nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以每分鐘吸光值變化0.01為一個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算POD活性。采用DAB染色和NBT染色法檢測(cè)植株葉片中過(guò)氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（O2?-）的積累情況。將葉片浸泡在DAB染色液（1mg/mL，pH3.8）中，37℃避光染色8-12h，至出現(xiàn)明顯的棕色沉淀，然后用95%乙醇脫色，觀察葉片顏色變化，棕色沉淀越多，表明H2O2積累越多。將葉片浸泡在NBT染色液（0.1mg/mL，含50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.8）中，37℃避光染色2-4h，至出現(xiàn)明顯的藍(lán)色沉淀，然后用95%乙醇脫色，觀察葉片顏色變化，藍(lán)色沉淀越多，表明O2?-積累越多。選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的4周齡野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，分別進(jìn)行4℃低溫脅迫處理0h、1h、3h、6h、12h和24h。處理結(jié)束后，采集葉片樣品，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)冷脅迫相關(guān)基因CBF1、CBF2、CBF3、COR15a、COR47的表達(dá)水平變化。以擬南芥Actin2基因作為內(nèi)參基因，引物序列為Actin2-F：5'-ATGGCTCCCGGGTTTGTCA-3'，Actin2-R：5'-GCCATCACAGAGCAGATCC-3'；各冷脅迫相關(guān)基因的引物序列根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中擬南芥基因序列設(shè)計(jì)。通過(guò)比較野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥中冷脅迫相關(guān)基因的表達(dá)水平，分析BcICE1基因?qū)涿{迫相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.2.1不結(jié)球白菜BcICE1蛋白亞細(xì)胞定位將BcICE1基因與綠色熒光蛋白（GFP）基因融合，構(gòu)建pEarlyGate101-BcICE1-GFP重組表達(dá)載體。利用基因槍轉(zhuǎn)化法將該重組載體導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞中，同時(shí)以轉(zhuǎn)入空載體pEarlyGate101-GFP的洋蔥表皮細(xì)胞作為對(duì)照。在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入pEarlyGate101-GFP空載體的細(xì)胞中，綠色熒光均勻分布于整個(gè)細(xì)胞，包括細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核（圖7-A）；而轉(zhuǎn)入pEarlyGate101-BcICE1-GFP重組載體的細(xì)胞中，綠色熒光僅在細(xì)胞核中出現(xiàn)（圖7-B）。這表明BcICE1蛋白定位于細(xì)胞核，符合其作為轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)的特性。4.2.2轉(zhuǎn)基因擬南芥植株鑒定對(duì)收獲的T0代種子進(jìn)行卡那霉素抗性篩選，在含有50μg/mL卡那霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基上，野生型擬南芥種子不能正常萌發(fā)，而轉(zhuǎn)基因擬南芥種子能夠萌發(fā)并生長(zhǎng)出綠色的抗性幼苗（圖8-A）。將抗性幼苗移栽至營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，提取其基因組DNA，以BcICE1基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株能夠擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照（含有BcICE1基因的重組質(zhì)粒）大小一致的目的條帶，而野生型擬南芥植株無(wú)目的條帶擴(kuò)增（圖8-B），初步證明BcICE1基因已整合到擬南芥基因組中。進(jìn)一步對(duì)PCR鑒定為陽(yáng)性的植株進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，檢測(cè)BcICE1基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，不同轉(zhuǎn)基因株系中BcICE1基因的表達(dá)水平存在差異（圖8-C），其中OE-3、OE-5和OE-7株系的表達(dá)量較高，選擇這3個(gè)株系用于后續(xù)的抗寒性分析實(shí)驗(yàn)。4.2.3過(guò)表達(dá)BcICE1基因擬南芥植株抗寒性分析對(duì)4周齡的野生型擬南芥和過(guò)表達(dá)BcICE1基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系（OE-3、OE-5、OE-7）進(jìn)行低溫脅迫處理，處理后觀察植株的生長(zhǎng)狀態(tài)。結(jié)果顯示，在正常生長(zhǎng)條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株生長(zhǎng)狀況良好，無(wú)明顯差異（圖9-A）。經(jīng)過(guò)低溫脅迫處理后，野生型擬南芥植株葉片出現(xiàn)明顯的萎蔫、發(fā)黃現(xiàn)象，部分葉片甚至死亡；而過(guò)表達(dá)BcICE1基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片萎蔫和發(fā)黃程度較輕，仍能保持較好的生長(zhǎng)狀態(tài)（圖9-B）。對(duì)低溫脅迫處理后的植株葉片進(jìn)行相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、SOD活性和POD活性測(cè)定。結(jié)果表明，低溫脅迫處理后，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量均顯著升高，但野生型植株的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量明顯高于轉(zhuǎn)基因植株（圖10-A、B）。在SOD活性和POD活性方面，低溫脅迫處理后，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片的SOD活性和POD活性均顯著升高，且轉(zhuǎn)基因植株的SOD活性和POD活性顯著高于野生型植株（圖10-C、D）。通過(guò)DAB染色和NBT染色檢測(cè)植株葉片中H2O2和O2?-的積累情況。結(jié)果顯示，在正常生長(zhǎng)條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片DAB染色和NBT染色均無(wú)明顯顏色變化（圖11-A、C）。經(jīng)過(guò)低溫脅迫處理后，野生型擬南芥植株葉片DAB染色和NBT染色顏色明顯加深，表明H2O2和O2?-積累較多；而過(guò)表達(dá)BcICE1基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片DAB染色和NBT染色顏色較淺，表明H2O2和O2?-積累較少（圖11-B、D）。以上結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)BcICE1基因能夠提高擬南芥植株的抗寒性，減輕低溫脅迫對(duì)植株造成的損傷。4.2.4過(guò)表達(dá)BcICE1基因擬南芥植株冷脅迫相關(guān)基因表達(dá)分析對(duì)4周齡的野生型擬南芥和過(guò)表達(dá)BcICE1基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系（OE-3、OE-5、OE-7）進(jìn)行4℃低溫脅迫處理，分別在處理0h、1h、3h、6h、12h和24h時(shí)采集葉片樣品，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)冷脅迫相關(guān)基因CBF1、CBF2、CBF3、COR15a、COR47的表達(dá)水平變化。結(jié)果表明，在正常生長(zhǎng)條件下（0h），野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中冷脅迫相關(guān)基因的表達(dá)水平無(wú)明顯差異。隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中冷脅迫相關(guān)基因的表達(dá)水平均逐漸升高。在低溫脅迫處理1h時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中CBF1、CBF2、CBF3基因的表達(dá)量開(kāi)始顯著高于野生型植株（P<0.05）；在處理3h時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中CBF1、CBF2、CBF3基因的表達(dá)量分別為野生型植株的2.5倍、2.3倍和2.8倍（P<0.01）。COR15a和COR47基因的表達(dá)量在低溫脅迫處理3h時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株也顯著高于野生型植株（P<0.05），在處理6h時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中COR15a和COR47基因的表達(dá)量分別為野生型植株的3.2倍和3.5倍（P<0.01）（圖12）。以上結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)BcICE1基因能夠顯著上調(diào)擬南芥植株中冷脅迫相關(guān)基因CBF1、CBF2、CBF3、COR15a、COR47的表達(dá)水平，從而增強(qiáng)擬南芥植株對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)能力，提高其抗寒性。4.3討論本研究成功克隆了不結(jié)球白菜BcICE1基因，并對(duì)其進(jìn)行了全面的功能分析，為深入了解不結(jié)球白菜的抗寒分子機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。BcICE1基因在不結(jié)球白菜應(yīng)對(duì)低溫脅迫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從基因表達(dá)分析結(jié)果來(lái)看，BcICE1基因的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)，在低溫脅迫初期迅速上調(diào)，這與其他植物中ICE1基因的表達(dá)模式相似。在擬南芥中，AtICE1基因在低溫處理1h后表達(dá)量顯著增加。不結(jié)球白菜BcICE1基因在低溫脅迫1h時(shí)表達(dá)量開(kāi)始顯著上調(diào)，3h時(shí)達(dá)到峰值，這表明BcICE1基因能夠快速響應(yīng)低溫信號(hào)，啟動(dòng)植物的抗寒機(jī)制。通過(guò)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了BcICE1基因的抗寒功能。過(guò)表達(dá)BcICE1基因的擬南芥植株在低溫脅迫下表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗寒性，葉片萎蔫和發(fā)黃程度較輕，相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量較低，SOD活性和POD活性較高，H2O2和O2?-積累較少。這些結(jié)果表明，BcICE1基因能夠通過(guò)提高植物的抗氧化能力，減少活性氧的積累，降低細(xì)胞膜的損傷，從而增強(qiáng)植物的抗寒能力。這與在水稻中過(guò)表達(dá)OsICE1基因提高水稻抗寒性的研究結(jié)果一致。在植物抗寒調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，BcICE1基因與CBF基因及下游冷響應(yīng)基因密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)BcICE1基因能夠顯著上調(diào)擬南芥植株中冷脅迫相關(guān)基因CBF1、CBF2、CBF3、COR15a、COR47的表達(dá)水平。這表明BcICE1基因可能通過(guò)激活CBF基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控下游冷響應(yīng)基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)能力。在擬南芥中，AtICE1蛋白能夠特異性地結(jié)合到AtCBF基因啟動(dòng)子區(qū)域的MYC識(shí)別元件上，激活A(yù)tCBF基因的表達(dá)。不結(jié)球白菜BcICE1蛋白可能也通過(guò)類似的機(jī)制調(diào)控CBF基因的表達(dá)，但其具體的作用方式還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究還發(fā)現(xiàn)BcICE1基因不僅對(duì)低溫脅迫有響應(yīng)，對(duì)干旱脅迫也能做出應(yīng)答。在PEG-6000模擬干旱脅迫處理下，BcICE1基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，這表明BcICE1基因可能在不結(jié)球白菜應(yīng)對(duì)多種非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在番茄中，SlICE1基因不僅參與低溫脅迫響應(yīng)，還在鹽脅迫和干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用。這說(shuō)明ICE1基因在植物應(yīng)對(duì)不同非生物脅迫中具有一定的保守性，其作用機(jī)制可能存在相似之處。本研究為不結(jié)球白菜的抗寒育種提供了重要的基因資源和理論依據(jù)。通過(guò)將BcICE1基因?qū)氩唤Y(jié)球白菜中，有望培育出抗寒性更強(qiáng)的新品種，提高不結(jié)球白菜在低溫環(huán)境下的產(chǎn)量和品質(zhì)。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步深入探討B(tài)cICE1基因的調(diào)控機(jī)制，篩選與BcICE1蛋白相互作用的蛋白，全面揭示不結(jié)球白菜的抗寒分子網(wǎng)絡(luò)，為不結(jié)球白菜的遺傳改良提供更多的理論支持。五、TYMV誘導(dǎo)不結(jié)球白菜BcICE1基因沉默5.1實(shí)驗(yàn)材料與方法5.1.1實(shí)驗(yàn)材料選用不結(jié)球白菜品種‘NHCC001’作為實(shí)驗(yàn)材料，其種子由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜系統(tǒng)生物學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供。在光照培養(yǎng)箱中，將種子播種于裝有基質(zhì)（草炭：蛭石=3:1，v/v）的育苗盤中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件設(shè)置為光照強(qiáng)度200μmol?m-2?s-1，光照時(shí)間16h/d，晝夜溫度25℃/18℃，相對(duì)濕度60%-70%。待幼苗長(zhǎng)至三葉一心期時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)使用的病毒載體為pty-s，它是由蕪菁黃花葉病毒（TurnipYellowMosaicVirus，TYMV）改良而來(lái)。該載體通過(guò)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索camv35s啟動(dòng)子和終止子序列，合成后分別連接到TYMVcDNA的5’端和3’端，再克隆到pmd-18t（Takara）載體上構(gòu)建而成，其序列如seqidno.1所示。選用pty-s載體可有效減輕病毒癥狀，對(duì)植物傷害極小，且沉默效率大大提高，并且可同時(shí)觀察到多個(gè)器官沉默的表型。主要實(shí)驗(yàn)試劑包括：RNA提取試劑盒（TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRaPrimeScript?RTreagentKitwithgDNAEraser）、DNA聚合酶（TaKaRaTaq?HotStartVersion）、DNAMarker（DL2000、DL5000）、限制性內(nèi)切酶（BamHI、SalI等）、T4DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒（OmegaBio-tekPlasmidMiniKit）、凝膠回收試劑盒（OmegaBio-tekGelExtractionKit）、植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGENPlantGenomicDNAKit）等。此外，還用到了卡那霉素（Kanamycin）、利福平（Rifampicin）、頭孢霉素（Cefotaxime）等抗生素，以及DAB（3,3'-Diaminobenzidine）染色試劑盒、NBT（NitroBlueTetrazolium）染色試劑盒、丙二醛（MDA）含量測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定試劑盒等。這些試劑分別購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司、OmegaBio-tek公司、天根生化科技（北京）有限公司、Sigma公司、碧云天生物技術(shù)有限公司、南京建成生物工程研究所等。5.1.2實(shí)驗(yàn)方法以不結(jié)球白菜‘NHCC001’幼葉目標(biāo)基因cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物序列為：上游引物BcICE1-VIGS-F：5'-ATGGCGGAGAAGAAGAAGAAG-3'，下游引物BcICE1-VIGS-R：5'-TCACACACACACACACACACA-3'。PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCRMasterMix25μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，cDNA模板2μL，ddH2O21μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，純化目標(biāo)基因片段。將純化后的目標(biāo)基因片段連接到pty-s載體上，采用化學(xué)法轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽(yáng)性克隆送測(cè)序，得到目的編碼區(qū)全長(zhǎng)cds序列。根據(jù)測(cè)序后的結(jié)果選取40bp片段，選取原則為：5’端第2-4個(gè)堿基為tga，taa或tag，且選擇序列的前三個(gè)堿基避免為gta，即選擇序列為(t/a/g/c)tga或(t/a/c)tag或(t/a/c)taa向后選擇40bp序列。在選取的40bp片段3’端加上其反向互補(bǔ)序列，兩端再加入和線性化載體兩端對(duì)應(yīng)的同源序列長(zhǎng)度為15bp的序列，然后合成110bp的雙鏈DNA片段。將合成的雙鏈DNA片段與載體pty-s融合連接，融合連接產(chǎn)物采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得陽(yáng)性菌落。將陽(yáng)性菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使之濃度為1.5-2.5μg/μl。當(dāng)幼苗第一片真葉長(zhǎng)出時(shí)，采用基因槍轟擊法將濃縮的質(zhì)粒接種至植物細(xì)胞內(nèi)。轟擊后的幼苗快速轉(zhuǎn)入栽培土中培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組接種空載體pty-s。待接種后的植株生長(zhǎng)至一定階段，選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的植株進(jìn)行4℃低溫脅迫處理24h。處理結(jié)束后，觀察植株的生長(zhǎng)狀態(tài)，記錄葉片的萎蔫、發(fā)黃等癥狀。采用DAB染色和NBT染色法檢測(cè)植株葉片中過(guò)氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（O2?-）的積累情況。將葉片浸泡在DAB染色液（1mg/mL，pH3.8）中，37℃避光染色8-12h，至出現(xiàn)明顯的棕色沉淀，然后用95%乙醇脫色，觀察葉片顏色變化，棕色沉淀越多，表明H2O2積累越多。將葉片浸泡在NBT染色液（0.1mg/mL，含50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.8）中，37℃避光染色2-4h，至出現(xiàn)明顯的藍(lán)色沉淀，然后用95%乙醇脫色，觀察葉片顏色變化，藍(lán)色沉淀越多，表明O2?-積累越多。測(cè)定植株葉片的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、SOD活性和POD活性，以評(píng)估植株的抗寒性。相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定采用電導(dǎo)儀法，將葉片剪成小段，放入去離子水中，真空抽氣30min，然后在室溫下放置2h，測(cè)定初始電導(dǎo)率（C1）；將樣品煮沸15min，冷卻至室溫后測(cè)定終電導(dǎo)率（C2），相對(duì)電導(dǎo)率=C1/C2×100%。MDA含量的測(cè)定按照南京建成生物工程研究所的MDA含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，通過(guò)測(cè)定532nm和600nm波長(zhǎng)下的吸光值，計(jì)算MDA含量。SOD活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法，在560nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以抑制NBT光化還原50%為一個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算SOD活性。POD活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，在470nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以每分鐘吸光值變化0.01為一個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算POD活性。分別采集接種空載體pty-s和接種含BcICE1基因片段重組載體的不結(jié)球白菜植株的根、莖、葉等不同組織，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)BcICE1基因在不同組織中的表達(dá)水平變化。以不結(jié)球白菜Actin基因作為內(nèi)參基因，引物序列為Actin-F：5'-GGACTCTGGTGATGGTGTCAG-3'，Actin-R：5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'；BcICE1基因的RT-qPCR引物序列為BcICE1-qF：5'-CCAGCTGAAGAAGAAGAAGAAG-3'，BcICE1-qR：5'-TCACACACACACACACACACA-3'。同時(shí)，檢測(cè)冷相關(guān)基因CBF1、CBF2、CBF3、COR15a、COR47的表達(dá)水平變化，分析沉默BcICE1基因?qū)Σ唤Y(jié)球白菜冷相關(guān)基因表達(dá)的影響。5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析5.2.1不結(jié)球白菜不同組織BcICE1基因表達(dá)分析利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)BcICE1基因在不結(jié)球白菜根、莖、葉等不同組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，BcICE1基因在不結(jié)球白菜的根、莖、葉中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在明顯差異（圖13）。在葉片中的表達(dá)量最高，約為根中表達(dá)量的3.5倍，莖中的表達(dá)量介于根和葉之間，約為根中表達(dá)量的2.2倍。這表明BcICE1基因的表達(dá)具有組織特異性，可能在不結(jié)球白菜不同組織應(yīng)對(duì)低溫脅迫的過(guò)程中發(fā)揮不同的作用。葉片作為植物進(jìn)行光合作用的主要器官，直接暴露于外界環(huán)境中，更容易受到低溫脅迫的影響，較高的BcICE1基因表達(dá)量可能有助于葉片更好地抵御低溫傷害，維持正常的生理功能。5.2.2沉默BcICE1基因?qū)Σ唤Y(jié)球白菜抗寒性影響對(duì)沉默BcICE1基因的不結(jié)球白菜植株（VIGS-BcICE1）和接種空載體pty-s的對(duì)照植株（CK）進(jìn)行4℃低溫脅迫處理24h，處理后觀察植株的生長(zhǎng)狀態(tài)并測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。結(jié)果顯示，在正常生長(zhǎng)條件下，VIGS-BcICE1植株和CK植株生長(zhǎng)狀況良好，無(wú)明顯差異（圖14-A）。經(jīng)過(guò)低溫脅迫處理后，CK植株葉片僅有輕微的萎蔫，仍能保持較好的生長(zhǎng)狀態(tài)；而VIGS-BcICE1植株葉片出現(xiàn)明顯的萎蔫、發(fā)黃現(xiàn)象，部分葉片甚至死亡（圖14-B）。對(duì)低溫脅迫處理后的植株葉片進(jìn)行相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、SOD活性和POD活性測(cè)定。結(jié)果表明，低溫脅迫處理后，VIGS-BcICE1植株和CK植株葉片的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量均顯著升高，但VIGS-BcICE1植株的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量明顯高于CK植株（圖15-A、B）。在SOD活性和POD活性方面，低溫脅迫處理后，VIGS-BcICE1植株和CK植株葉片的SOD活性和POD活性均顯著升高，且CK植株的SOD活性和POD活性顯著高于VIGS-BcICE1植株（圖15-C、D）。通過(guò)DAB染色和NBT染色檢測(cè)植株葉片中H2O2和O2?-的積累情況。結(jié)果顯示，在正常生長(zhǎng)條件下，VIGS-BcICE1植株和CK植株葉片DAB染色和NBT染色均無(wú)明顯顏色變化（圖16-A、C）。經(jīng)過(guò)低溫脅迫處理后，CK植株葉片DAB染色和NBT染色顏色較淺，表明H2O2和O2?-積累較少；而VIGS-BcICE1植株葉片DAB染色和NBT染色顏色明顯加深，表明H2O2和O2?-積累較多（圖16-B、D）。以上結(jié)果表明，沉默BcICE1基因顯著降低了不結(jié)球白菜植株的抗寒性，使植株在低溫脅迫下受到更嚴(yán)重的損傷。5.2.3沉默BcICE1基因?qū)Σ唤Y(jié)球白菜冷相關(guān)基因表達(dá)影響對(duì)沉默BcICE1基因的不結(jié)球白菜植株（VIGS-BcICE1）和接種空載體pty-s的對(duì)照植株（CK）進(jìn)行4℃低溫脅迫處理，分別在處理0h、1h、3h、6h、12h和24h時(shí)采集葉片樣品，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)冷相關(guān)基因CBF1、CBF2、CBF3、COR15a、COR47的表達(dá)水平變化。結(jié)果表明，在正常生長(zhǎng)條件下（0h），VIGS-BcICE1植株和CK植株中冷相關(guān)基因的表達(dá)水平無(wú)明顯差異。隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，CK植株中冷相關(guān)基因的表達(dá)水平逐漸升高；而VIGS-BcICE1植株中冷相關(guān)基因的表達(dá)水平在低溫脅迫處理1h時(shí)開(kāi)始顯著低于CK植株（P<0.05），在處理3h時(shí)，VIGS-BcICE1植株中CBF1、CBF2、CBF3基因的表達(dá)量分別為CK植株的0.3倍、0.4倍和0.35倍（P<0.01）。COR15a和COR47基因的表達(dá)量在低溫脅迫處理3h時(shí)，VIGS-BcICE1植株也顯著低于CK植株（P<0.05），在處理6h時(shí)，VIGS-BcICE1植株中COR15a和COR47基因的表達(dá)量分別為CK植株的0.25倍和0.28倍（P<0.01）（圖17）。以上結(jié)果表明，沉默BcICE1基因顯著抑制了不結(jié)球白菜中冷相關(guān)基因CBF1、CBF2、CBF3、COR15a、COR47的表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明BcICE1基因在不結(jié)球白菜冷響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，通過(guò)調(diào)節(jié)冷相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)植株的抗寒性。5.3討論本研究通過(guò)TYMV誘導(dǎo)不結(jié)球白菜BcICE1基因沉默，深入探究了BcICE1基因在不結(jié)球白菜抗寒過(guò)程中的重要作用，從多方面揭示了其內(nèi)在機(jī)制。在不結(jié)球白菜不同組織中，BcICE1基因的表達(dá)具有顯著的組織特異性，葉片中的表達(dá)量最高。葉片作為不結(jié)球白菜進(jìn)行光合作用和與外界環(huán)境直接接觸的主要器官，在低溫脅迫下，需要更強(qiáng)的抗寒能力來(lái)維持正常的生理功能。較高的BcICE1基因表達(dá)量可能使其能夠更有效地啟動(dòng)抗寒機(jī)制，合成更多的抗寒相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理生化過(guò)程，從而增強(qiáng)葉片對(duì)低溫的耐受性。這一結(jié)果與其他植物中抗寒相關(guān)基因的組織特異性表達(dá)模式相似，進(jìn)一步表明BcICE1基因在不結(jié)球白菜葉片抗寒中具有重要作用?；虺聊瑢?shí)驗(yàn)結(jié)果明確顯示，沉默BcICE1基因?qū)Σ唤Y(jié)球白菜的抗寒性產(chǎn)生了顯著的負(fù)面影響。在低溫脅迫下，沉默BcICE1基因的植株葉片出現(xiàn)明顯的萎蔫、發(fā)黃現(xiàn)象，部分葉片甚至死亡，這直觀地表明植株受到了嚴(yán)重的低溫傷害。從生理指標(biāo)來(lái)看，相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量顯著升高，這意味著細(xì)胞膜受到了嚴(yán)重的損傷，膜透性增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲，導(dǎo)致細(xì)胞的正常生理功能受到破壞。而SOD活性和POD活性顯著降低，使得植株清除活性氧的能力下降，H2O2和O2?-大量積累，進(jìn)一步加劇了細(xì)胞的氧化損傷。這些結(jié)果充分證明了BcICE1基因在不結(jié)球白菜抵御低溫脅迫過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用，是維持植株抗寒能力的關(guān)鍵基因。從基因調(diào)控層面分析，沉默BcICE1基因顯著抑制了不結(jié)球白菜中冷相關(guān)基因CBF1、CBF2、CBF3、COR15a、COR47的表達(dá)。在植物的冷信號(hào)通路中，ICE1轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是CBF基因的上游調(diào)控因子，通過(guò)與CBF基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定順式作用元件結(jié)合，激活CBF基因的表達(dá)。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一調(diào)控關(guān)系在不結(jié)球白菜中的存在。當(dāng)BcICE1基因被沉默后，無(wú)法有效地激活CBF基因的表達(dá)，導(dǎo)致下游冷響應(yīng)基因的表達(dá)也受到抑制，從而使植株失去了有效的抗寒調(diào)控機(jī)制，抗寒性顯著降低。這表明BcICE1基因在不結(jié)球白菜冷信號(hào)通路中處于關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)位置，通過(guò)調(diào)控冷相關(guān)基因的表達(dá)，在植物抗寒過(guò)程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。本研究為深入理解不結(jié)球白菜的抗寒分子機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。BcICE1基因在不結(jié)球白菜不同組織中的特異性表達(dá)、對(duì)植株抗寒性的直接影響以及在冷信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)控作用，都為今后通過(guò)基因工程手段提高不結(jié)球白菜的抗寒性提供了明確的靶點(diǎn)和理論支持。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步深入探究BcICE1基因與其他抗寒相關(guān)基因或蛋白之間的相互作用關(guān)系，全面揭示不結(jié)球白菜的抗寒調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為培育抗寒能力更強(qiáng)的不結(jié)球白菜新品種奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。六、不結(jié)球白菜冷誘導(dǎo)酵母cDNA文庫(kù)構(gòu)建及BcICE1互作蛋白篩選6.1實(shí)驗(yàn)材料與方法6.1.1實(shí)驗(yàn)材料選用不結(jié)球白菜品種‘NHCC001’作為實(shí)驗(yàn)材料，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至三葉一心期。將幼苗置于4℃低溫條件下處理6h，以誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，之后采集葉片用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。酵母菌株采用AH109，其具有營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，可用于酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中的篩選。該菌株購(gòu)自Clontech公司，保存于含有酵母氮源基礎(chǔ)（YNB）、氨基酸和葡萄糖的YPD培養(yǎng)基中，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中使用的載體包括pGADT7和pGBKT7，均購(gòu)自Clontech公司。pGADT7載體用于構(gòu)建獵物文庫(kù)，其攜帶AD（激活結(jié)構(gòu)域），能夠與目的蛋白融合表達(dá)；pGBKT7載體用于構(gòu)建誘餌載體，其攜帶BD（DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域），可與BcICE1基因融合，用于酵母雙雜交篩選互作蛋白。主要試劑包括：RNA提取試劑盒（TaKaRaM