N6-甲基腺苷（m6A）在小鼠多能性與全能性重編程中的調(diào)控密碼解析VIP

N6-甲基腺苷（m6A）在小鼠多能性與全能性重編程中的調(diào)控密碼解析一、引言1.1研究背景在生命科學的廣袤領域中，RNA修飾作為一個關鍵的研究方向，正逐漸揭示出其在基因表達調(diào)控等過程中的核心地位。N6-甲基腺苷（m6A），作為真核生物mRNA內(nèi)部最為常見且研究最為廣泛的修飾，自1970年在哺乳動物mRNA中被發(fā)現(xiàn)以來，已成為RNA表觀遺傳學領域的研究焦點。m6A修飾并非孤立存在，而是在一個復雜而精妙的動態(tài)調(diào)控體系中發(fā)揮作用。這個調(diào)控體系主要由三類蛋白構(gòu)成：“書寫者”（writers）、“擦除者”（erasers）和“閱讀器”（readers）。“書寫者”主要是由催化亞單位MAC和調(diào)節(jié)亞單位MACOM組成的甲基轉(zhuǎn)移酶復合體，其中核心成員包括METTL3和METTL14，它們形成穩(wěn)定的異源二聚體，負責將甲基團添加到RNA分子的腺苷酸上，從而形成m6A修飾。此外，METTL16、METTL5和ZCCHC4等也能作為m6Awriters獨立地催化m6A在特定底物RNA上的沉積?！安脸摺眲t包括FTO和ALKBH5，它們的作用是移除RNA上的m6A修飾，使得m6A修飾具有動態(tài)可逆性，這一特性為基因表達的精細調(diào)控提供了更多可能?！伴喿x器”是一類能夠識別并結(jié)合m6A修飾的蛋白質(zhì)，如YTH結(jié)構(gòu)域蛋白家族（YTHDC1、YTHDF1-3）、IGF2BPs、hnRNPs、eIF3、NKAP等，它們通過與m6A修飾的RNA相互作用，參與調(diào)節(jié)RNA的穩(wěn)定性、剪接、翻譯、核輸出等多個生物學過程，就像一把把鑰匙，解鎖m6A修飾所蘊含的遺傳信息，進而影響細胞的命運和功能。這種動態(tài)可逆的m6ARNA修飾在轉(zhuǎn)錄后水平對修飾的RNA分子的命運起著決定性作用，廣泛影響了幾乎所有重要的生物學過程。在細胞代謝中，m6A修飾可以調(diào)控代謝相關基因的mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率，從而影響細胞的物質(zhì)合成與能量代謝；在發(fā)育過程中，m6A修飾參與胚胎干細胞的多能性維持與分化調(diào)控，對胚胎的正常發(fā)育至關重要。以小鼠胚胎發(fā)育為例，在胚胎干細胞向神經(jīng)干細胞分化的過程中，m6A修飾水平的變化與細胞命運的改變密切相關，通過調(diào)控m6A修飾相關蛋白的表達，可以影響干細胞向神經(jīng)干細胞的分化進程。在小鼠的生命進程中，多能性與全能性重編程是兩個至關重要的生物學過程。多能性重編程使得已分化的體細胞重新獲得多能性，成為誘導多能干細胞（iPSC），這一過程為再生醫(yī)學提供了廣闊的應用前景，有望用于治療多種難治性疾病，如帕金森病、糖尿病等。而全能性重編程則涉及細胞從多能狀態(tài)進一步轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂邪l(fā)育成完整生物體能力的全能狀態(tài)，這對于理解生命的起源和早期胚胎發(fā)育具有不可替代的意義。例如，在小鼠胚胎發(fā)育早期，受精卵經(jīng)過多次分裂和重編程，逐漸形成具有全能性的細胞，這些細胞能夠分化為胚胎的各種組織和器官。近年來，隨著研究的不斷深入，m6A修飾在小鼠多能性與全能性重編程中的重要作用逐漸浮出水面。m6A修飾的動態(tài)變化與細胞重編程過程緊密相連，通過調(diào)控m6A修飾相關蛋白的功能，可以顯著影響重編程的效率和質(zhì)量。研究表明，在小鼠體細胞重編程為iPSC的過程中，m6A修飾水平的改變會影響關鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達和活性，進而影響重編程的進程。在全能性重編程中，m6A修飾也參與調(diào)控相關基因的表達，對胚胎的早期發(fā)育和全能性的維持起著關鍵作用。然而，盡管目前已經(jīng)取得了一些研究成果，但m6A修飾在小鼠多能性與全能性重編程中的具體調(diào)控功能及機制仍存在許多未知之處，亟待深入探索。1.2研究目的與意義本研究旨在深入揭示m6A在小鼠多能性與全能性重編程中的調(diào)控功能及機制。通過系統(tǒng)研究m6A修飾相關蛋白在重編程過程中的動態(tài)變化，解析m6A修飾對關鍵基因表達和信號通路的調(diào)控方式，從而全面闡明m6A在這兩個重要生物學過程中的作用機制。從理論層面來看，該研究將填補我們對m6A修飾在小鼠多能性與全能性重編程領域認知的空白，為理解細胞命運轉(zhuǎn)變的分子機制提供新的視角。這不僅有助于完善RNA表觀遺傳學的理論體系，還能為深入研究其他物種的類似生物學過程提供重要的參考依據(jù)，推動生命科學基礎研究的發(fā)展。在應用方面，本研究成果具有重要的潛在價值。多能性與全能性重編程在再生醫(yī)學中占據(jù)著核心地位，如誘導多能干細胞（iPSC）技術為疾病治療提供了新的細胞來源，有望用于修復受損組織和器官。而對m6A調(diào)控機制的深入理解，能夠為優(yōu)化iPSC的誘導效率和質(zhì)量提供理論指導，提高細胞治療的安全性和有效性，推動再生醫(yī)學從實驗室研究向臨床應用的轉(zhuǎn)化進程，為攻克難治性疾病帶來新的希望。此外，研究m6A在全能性重編程中的作用，有助于我們更好地理解胚胎發(fā)育的早期過程，為生殖醫(yī)學和發(fā)育生物學領域提供重要的理論支持，可能為解決人類生殖相關疾病和輔助生殖技術的改進提供新的思路和方法。1.3研究思路與方法本研究擬通過多維度的實驗設計和技術手段，深入剖析m6A在小鼠多能性與全能性重編程中的調(diào)控功能及機制。研究思路上，以小鼠為研究對象，首先構(gòu)建m6A修飾相關蛋白（writers、erasers和readers）的基因敲除或過表達小鼠模型，利用這些模型獲取不同狀態(tài)下的細胞，包括體細胞、誘導多能干細胞（iPSC）以及處于全能性重編程關鍵階段的細胞等。通過對這些細胞進行系統(tǒng)的生物學表征，如細胞形態(tài)觀察、多能性和全能性相關標志物的檢測等，初步明確m6A修飾相關蛋白對細胞重編程能力的影響。在機制探究方面，運用轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）、m6A甲基化測序（MeRIP-seq）等技術，全面分析不同細胞狀態(tài)下基因表達譜和m6A修飾圖譜的變化，篩選出在多能性與全能性重編程中受m6A修飾調(diào)控的關鍵基因和信號通路。進一步通過基因功能驗證實驗，如RNA干擾（RNAi）、基因編輯技術（CRISPR/Cas9）等，對篩選出的關鍵基因進行功能驗證，明確其在m6A調(diào)控重編程過程中的作用機制。同時，利用蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）、RNA免疫沉淀（RIP）等技術，研究m6A修飾相關蛋白與關鍵基因mRNA之間的相互作用，以及m6A修飾如何影響mRNA的穩(wěn)定性、剪接、翻譯等過程，從而揭示m6A在轉(zhuǎn)錄后水平對重編程相關基因表達的調(diào)控機制。在實驗方法上，基因編輯技術將用于構(gòu)建基因敲除或過表達小鼠模型。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，針對m6A修飾相關蛋白編碼基因進行精確編輯，實現(xiàn)基因的敲除或過表達，從而研究其對小鼠多能性與全能性重編程的影響。測序技術方面，RNA-seq用于全面分析細胞的轉(zhuǎn)錄組，獲取基因表達水平的變化信息，為篩選差異表達基因提供數(shù)據(jù)支持；MeRIP-seq則專門用于檢測m6A修飾位點及其修飾水平，繪制m6A修飾圖譜，明確m6A修飾在基因上的分布特征與重編程過程的關聯(lián)。細胞培養(yǎng)與檢測技術也是本研究的重要手段。培養(yǎng)小鼠體細胞、胚胎干細胞、誘導多能干細胞等不同類型的細胞，在體外模擬多能性與全能性重編程過程。通過免疫熒光染色、流式細胞術等方法檢測細胞表面標志物和內(nèi)部蛋白表達，以鑒定細胞的多能性和全能性狀態(tài)；運用實時定量PCR（qPCR）技術對關鍵基因的mRNA表達水平進行定量分析，驗證測序結(jié)果的準確性；利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術檢測蛋白質(zhì)表達水平，研究基因表達在蛋白質(zhì)層面的變化。二、m6A修飾及其調(diào)控機制2.1m6A修飾的發(fā)現(xiàn)與特征m6A修飾的發(fā)現(xiàn)可追溯到20世紀70年代，1974年，科學家首次在哺乳動物mRNA中檢測到m6A修飾。在當時，由于技術手段的限制，對m6A修飾的研究進展相對緩慢。隨著科學技術的不斷進步，尤其是高通量測序技術的發(fā)展，m6A修飾的研究迎來了新的契機，逐漸成為RNA表觀遺傳學領域的研究熱點。m6A修飾在mRNA上并非隨機分布，而是具有顯著的位點偏好性。研究表明，m6A修飾主要發(fā)生在特定的序列模體（motif）中，最常見的模體為DRACH（D代表A、G或U；R代表A或G；H代表A、C或U）。在這個模體中，腺苷酸（A）的N6位置發(fā)生甲基化，形成m6A修飾。不過，需要指出的是，并非所有符合DRACH模體的位點都會發(fā)生m6A修飾，實際上，僅有一小部分此類位點會被甲基化，這暗示著m6A修飾的發(fā)生還受到其他因素的精細調(diào)控。例如，通過對小鼠胚胎干細胞的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，雖然存在大量的DRACH模體，但真正發(fā)生m6A修飾的位點僅占其中的一部分，且這些修飾位點在不同基因上的分布也存在差異。從區(qū)域偏好性來看，m6A修飾在mRNA的多個區(qū)域均有分布，但在終止密碼子附近和3'非翻譯區(qū)（3'UTR）相對富集。在終止密碼子附近，m6A修飾可能參與調(diào)控mRNA的翻譯終止過程，影響蛋白質(zhì)的合成效率和準確性。研究發(fā)現(xiàn)，當終止密碼子附近的m6A修飾被破壞時，翻譯終止過程可能出現(xiàn)異常，導致蛋白質(zhì)合成的紊亂。在3'UTR區(qū)域，m6A修飾可以通過與相關蛋白的相互作用，影響mRNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)運以及翻譯效率。有研究表明，3'UTR區(qū)域的m6A修飾能夠招募特定的蛋白復合物，促進mRNA的降解，從而調(diào)節(jié)基因的表達水平。此外，m6A修飾在mRNA的編碼區(qū)（CDS）和5'非翻譯區(qū)（5'UTR）也有一定程度的分布，其在這些區(qū)域的功能也逐漸受到關注。在CDS區(qū)域，m6A修飾可能影響mRNA的翻譯延伸速率，對蛋白質(zhì)的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生潛在影響；在5'UTR區(qū)域，m6A修飾則可能參與調(diào)控mRNA的翻譯起始過程，影響蛋白質(zhì)的合成起始效率。2.2m6A修飾的調(diào)控因子2.2.1甲基轉(zhuǎn)移酶復合物（“寫入器”）甲基轉(zhuǎn)移酶復合物，作為m6A修飾的“寫入器”，在m6A修飾過程中扮演著至關重要的角色，其核心成員包括METTL3、METTL14和WTAP等。METTL3是甲基轉(zhuǎn)移酶復合物的催化亞基，其結(jié)構(gòu)中包含一個保守的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合S-腺苷甲硫氨酸（SAM），為m6A修飾提供甲基供體。研究表明，METTL3在多種細胞和組織中廣泛表達，對維持正常的生理功能至關重要。例如，在小鼠胚胎干細胞中，METTL3的缺失會導致m6A修飾水平顯著下降，進而影響細胞的多能性維持和分化能力。這是因為METTL3的缺失使得與多能性相關的關鍵基因mRNA上的m6A修飾減少，這些mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率發(fā)生改變，最終導致細胞多能性相關蛋白的表達異常，細胞無法維持正常的多能性狀態(tài)。METTL14在甲基轉(zhuǎn)移酶復合物中起到重要的調(diào)節(jié)作用。它與METTL3形成穩(wěn)定的異源二聚體，雖然METTL14本身不具有催化活性，但它能夠增強METTL3的催化效率，促進m6A修飾的發(fā)生。從結(jié)構(gòu)上看，METTL14含有一個與RNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，這使得它能夠協(xié)助METTL3識別并結(jié)合到特定的RNA底物上。在小鼠的發(fā)育過程中，METTL14的功能缺失會導致胚胎發(fā)育異常，如胚胎著床后發(fā)育遲緩、胚胎形態(tài)異常等。這是由于METTL14缺失影響了METTL3對發(fā)育相關基因mRNA的m6A修飾，使得這些基因的表達失調(diào)，進而影響胚胎的正常發(fā)育進程。WTAP作為甲基轉(zhuǎn)移酶復合物的另一重要成員，主要參與調(diào)節(jié)復合物的亞細胞定位和底物特異性。它能夠與METTL3-METTL14異源二聚體相互作用，形成更大的復合物，促進m6A修飾在特定RNA區(qū)域的發(fā)生。在細胞周期調(diào)控中，WTAP發(fā)揮著關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，當WTAP的表達被抑制時，細胞周期相關基因mRNA的m6A修飾水平發(fā)生改變，導致細胞周期進程受阻，細胞增殖能力下降。這是因為WTAP的異常影響了甲基轉(zhuǎn)移酶復合物對細胞周期相關基因mRNA的修飾，使得這些基因的表達不能正常響應細胞周期信號，從而干擾了細胞周期的正常運行。除了上述核心成員外，甲基轉(zhuǎn)移酶復合物還包含一些輔助蛋白，如VIRMA、ZC3H13、HAKAI和RBM15等，它們共同協(xié)作，確保m6A修飾的精確性和高效性。VIRMA能夠特異性地識別并結(jié)合到mRNA的3'UTR區(qū)域，引導甲基轉(zhuǎn)移酶復合物對該區(qū)域的RNA進行m6A修飾。在小鼠肝臟細胞中，VIRMA的功能異常會導致肝臟代謝相關基因mRNA3'UTR區(qū)域的m6A修飾紊亂，進而影響肝臟的代謝功能，表現(xiàn)為脂質(zhì)代謝異常、糖原合成障礙等。ZC3H13則參與調(diào)控甲基轉(zhuǎn)移酶復合物在細胞核內(nèi)的定位，保證復合物能夠在正確的時間和空間對RNA進行修飾。當ZC3H13的表達受到干擾時，甲基轉(zhuǎn)移酶復合物在細胞核內(nèi)的分布發(fā)生改變，影響對特定基因mRNA的m6A修飾，從而對細胞的生理功能產(chǎn)生負面影響。在m6A修飾過程中，這些甲基轉(zhuǎn)移酶復合物成員之間存在著緊密的協(xié)同作用機制。METTL3和METTL14首先形成異源二聚體，METTL14通過其RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域協(xié)助METTL3識別RNA底物，同時增強METTL3的催化活性。WTAP與METTL3-METTL14異源二聚體相互作用，調(diào)節(jié)復合物的亞細胞定位和底物特異性，確保m6A修飾能夠在合適的RNA區(qū)域發(fā)生。而VIRMA、ZC3H13等輔助蛋白則進一步細化和拓展了甲基轉(zhuǎn)移酶復合物的功能，它們通過與不同的RNA區(qū)域或其他蛋白質(zhì)相互作用，共同調(diào)節(jié)m6A修飾的位點特異性和修飾水平，從而實現(xiàn)對基因表達的精細調(diào)控。例如，在小鼠胚胎發(fā)育的不同階段，甲基轉(zhuǎn)移酶復合物各成員通過協(xié)同作用，動態(tài)調(diào)節(jié)與胚胎發(fā)育相關基因mRNA的m6A修飾，確保胚胎發(fā)育過程中基因表達的時空特異性，保證胚胎能夠正常發(fā)育成完整的個體。2.2.2去甲基化酶（“擦除器”）m6A修飾的動態(tài)可逆性是其在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用的基礎，而去甲基化酶作為m6A修飾的“擦除器”，在這一動態(tài)過程中扮演著關鍵角色。目前，已發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶主要包括FTO和ALKBH5，它們均屬于AlkB家族，通過氧化去甲基化反應移除m6A修飾，使RNA恢復為未修飾狀態(tài)，從而動態(tài)調(diào)節(jié)m6A修飾水平。FTO是最早被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶，其作用機制較為復雜。FTO蛋白包含一個雙加氧酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合α-酮戊二酸（α-KG）和亞鐵離子（Fe2?），以氧氣（O?）為底物，通過氧化反應將m6A上的甲基氧化為羥甲基，進而逐步將其去除。研究表明，F(xiàn)TO在體內(nèi)的表達具有組織特異性，在脂肪組織、下丘腦等組織中表達相對較高。在脂肪代謝調(diào)控方面，F(xiàn)TO發(fā)揮著重要作用。例如，在小鼠的脂肪細胞分化過程中，F(xiàn)TO的表達水平會發(fā)生動態(tài)變化。當FTO表達上調(diào)時，脂肪細胞中與脂肪生成相關基因mRNA的m6A修飾水平下降，這些基因的表達增加，促進脂肪細胞的分化和脂質(zhì)積累。相反，抑制FTO的活性會導致m6A修飾水平升高，抑制脂肪生成相關基因的表達，從而減少脂肪細胞的分化和脂質(zhì)積累。這表明FTO通過調(diào)節(jié)m6A修飾水平，影響脂肪代謝相關基因的表達，進而調(diào)控脂肪細胞的分化和脂肪代謝過程。ALKBH5是另一種重要的m6A去甲基化酶，其結(jié)構(gòu)與FTO具有一定的相似性，但在底物特異性和生物學功能上存在差異。ALKBH5同樣依賴α-KG和Fe2?進行催化反應，通過氧化作用去除m6A修飾。在神經(jīng)系統(tǒng)中，ALKBH5的功能尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠的神經(jīng)元發(fā)育過程中，ALKBH5參與調(diào)控神經(jīng)元分化相關基因的表達。當ALKBH5基因被敲除時，神經(jīng)元中與分化相關基因mRNA的m6A修飾水平升高，這些基因的表達受到抑制，導致神經(jīng)元分化受阻，影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。此外，ALKBH5還與精子發(fā)生過程密切相關。在雄性小鼠中，ALKBH5的缺失會導致精子中mRNA的m6A修飾異常，影響精子的生成和成熟，最終導致雄性不育。這說明ALKBH5在維持神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和精子發(fā)生過程中，通過動態(tài)調(diào)節(jié)m6A修飾水平，確保相關基因的正常表達，對維持生物體的正常生理功能至關重要。FTO和ALKBH5雖然都具有m6A去甲基化活性，但它們在細胞內(nèi)的定位和對不同底物的偏好性有所不同。FTO主要定位于細胞核內(nèi)，對mRNA的5'UTR和CDS區(qū)域的m6A修飾具有較高的去甲基化活性。而ALKBH5則主要分布在細胞核和細胞質(zhì)中，對mRNA的3'UTR區(qū)域的m6A修飾作用更為顯著。這種定位和底物偏好性的差異使得它們能夠在不同的細胞區(qū)域和生物學過程中，針對不同的RNA底物發(fā)揮去甲基化作用，共同精細地調(diào)節(jié)m6A修飾水平。例如，在小鼠胚胎干細胞向神經(jīng)干細胞分化的過程中，F(xiàn)TO和ALKBH5通過對不同區(qū)域m6A修飾的動態(tài)調(diào)節(jié)，協(xié)同調(diào)控神經(jīng)分化相關基因的表達。FTO在細胞核內(nèi)對神經(jīng)分化關鍵轉(zhuǎn)錄因子mRNA的5'UTR和CDS區(qū)域的m6A修飾進行去甲基化，促進這些轉(zhuǎn)錄因子的表達；而ALKBH5則在細胞核和細胞質(zhì)中對mRNA3'UTR區(qū)域的m6A修飾進行調(diào)節(jié)，進一步影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，從而共同推動胚胎干細胞向神經(jīng)干細胞的分化進程。2.2.3m6A結(jié)合蛋白（“閱讀器”）m6A結(jié)合蛋白，作為m6A修飾的“閱讀器”，能夠特異性地識別并結(jié)合m6A修飾的mRNA，進而調(diào)控mRNA的命運，在m6A修飾介導的基因表達調(diào)控中發(fā)揮著關鍵作用。常見的m6A結(jié)合蛋白包括YTHDF1/2、IGF2BPs、HNRNP等，它們通過不同的結(jié)構(gòu)域和作用機制識別m6A修飾，并對mRNA的穩(wěn)定性、翻譯、剪接等過程產(chǎn)生影響。YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3屬于YTH結(jié)構(gòu)域蛋白家族，它們都含有一個保守的YTH結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠直接識別并結(jié)合m6A修飾的mRNA。YTHDF1主要促進mRNA的翻譯過程。其作用機制是通過與m6A修飾的mRNA結(jié)合后，招募翻譯起始因子eIF3，形成YTHDF1-m6A-mRNA-eIF3復合物，從而增強mRNA的翻譯效率。在小鼠的神經(jīng)發(fā)育過程中，YTHDF1對神經(jīng)遞質(zhì)受體基因mRNA的翻譯調(diào)控起到重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，當YTHDF1基因敲除時，神經(jīng)遞質(zhì)受體基因mRNA上的m6A修飾雖然存在，但由于缺乏YTHDF1的作用，這些mRNA的翻譯效率顯著降低，導致神經(jīng)遞質(zhì)受體表達減少，影響神經(jīng)信號的傳遞和神經(jīng)回路的形成，最終影響小鼠的神經(jīng)功能，表現(xiàn)為學習記憶能力下降、行為異常等。YTHDF2的主要功能是促進mRNA的降解。它與m6A修飾的mRNA結(jié)合后，能夠招募CCR4-NOT復合物或RNaseP/MRP復合物，這些復合物能夠識別并切割mRNA，從而導致mRNA的降解。在小鼠胚胎干細胞分化過程中，YTHDF2對多能性維持因子基因mRNA的降解調(diào)控起著關鍵作用。隨著胚胎干細胞的分化，YTHDF2表達上調(diào)，它識別并結(jié)合多能性維持因子基因mRNA上的m6A修飾，招募降解復合物，促使這些mRNA降解，使得多能性維持因子表達減少，從而推動胚胎干細胞向特定細胞類型分化。如果YTHDF2的功能受到抑制，多能性維持因子基因mRNA的降解受阻，會導致胚胎干細胞難以分化，維持在多能性狀態(tài)，影響胚胎的正常發(fā)育進程。IGF2BPs（IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3）通過其KH結(jié)構(gòu)域識別并結(jié)合m6A修飾的mRNA，主要功能是增強mRNA的穩(wěn)定性。在小鼠的腫瘤發(fā)生過程中，IGF2BPs發(fā)揮著重要作用。例如，在小鼠肝癌模型中，IGF2BP1的表達顯著上調(diào)，它與肝癌相關基因mRNA上的m6A修飾結(jié)合，阻止mRNA被降解，使得這些基因的表達持續(xù)維持在較高水平，促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。通過抑制IGF2BP1的表達或功能，可以降低肝癌相關基因mRNA的穩(wěn)定性，減少其表達，從而抑制肝癌細胞的惡性生物學行為。HNRNP家族中的一些成員，如HNRNPC、HNRNPG等，也被發(fā)現(xiàn)能夠識別m6A修飾的mRNA。HNRNPC通過其RRM結(jié)構(gòu)域與m6A修飾的mRNA結(jié)合，參與調(diào)控mRNA的剪接過程。在小鼠的心臟發(fā)育過程中，HNRNPC對心臟發(fā)育相關基因mRNA的剪接調(diào)控至關重要。當HNRNPC功能異常時，心臟發(fā)育相關基因mRNA的剪接發(fā)生紊亂，產(chǎn)生異常的剪接異構(gòu)體，影響心臟的正常發(fā)育和功能。例如，某些心臟發(fā)育相關基因的異常剪接會導致心肌細胞結(jié)構(gòu)和功能異常，進而引發(fā)心臟疾病，如心肌肥厚、心律失常等。這些m6A結(jié)合蛋白對m6A修飾mRNA的識別與調(diào)控機制具有高度的特異性和復雜性。它們通過不同的結(jié)構(gòu)域與m6A修飾的mRNA結(jié)合，招募不同的蛋白復合物，從而實現(xiàn)對mRNA穩(wěn)定性、翻譯、剪接等過程的精準調(diào)控。在小鼠的生命活動中，這些m6A結(jié)合蛋白在不同的組織和發(fā)育階段，根據(jù)細胞的需求，協(xié)同作用，動態(tài)調(diào)節(jié)m6A修飾mRNA的命運，確?；虮磉_的精確性和細胞功能的正常發(fā)揮。例如，在小鼠胚胎發(fā)育早期，不同的m6A結(jié)合蛋白通過對不同基因mRNA的調(diào)控，共同協(xié)調(diào)胚胎細胞的增殖、分化和組織器官的形成。隨著小鼠的生長發(fā)育，m6A結(jié)合蛋白繼續(xù)在維持組織穩(wěn)態(tài)、應對外界刺激等方面發(fā)揮重要作用，一旦這些調(diào)控機制出現(xiàn)異常，就可能導致各種疾病的發(fā)生發(fā)展。2.3m6A修飾對RNA代謝的影響2.3.1對mRNA穩(wěn)定性的影響m6A修飾對mRNA穩(wěn)定性的影響是其調(diào)控基因表達的重要機制之一。大量研究表明，m6A修飾可以通過招募特定的“閱讀器”蛋白，如YTHDF2，來影響mRNA的半衰期和降解途徑。YTHDF2含有保守的YTH結(jié)構(gòu)域，能夠特異性地識別并結(jié)合m6A修飾的mRNA。當YTHDF2與m6A修飾的mRNA結(jié)合后，會招募CCR4-NOT復合物或RNaseP/MRP復合物，這些復合物具有核酸酶活性，能夠識別并切割mRNA，從而導致mRNA的降解。例如，在小鼠胚胎干細胞中，對多能性維持因子基因Oct4、Sox2和Nanog的mRNA進行分析發(fā)現(xiàn)，它們均存在m6A修飾。當敲低YTHDF2的表達時，這些基因mRNA的半衰期顯著延長，表明YTHDF2通過識別m6A修飾促進了這些mRNA的降解。這一過程對于維持胚胎干細胞的多能性至關重要，因為在胚胎干細胞分化過程中，多能性維持因子基因的mRNA需要被及時降解，以推動細胞向特定細胞類型分化。如果YTHDF2功能異常，多能性維持因子基因mRNA的降解受阻，細胞將難以分化，可能導致胚胎發(fā)育異常。另一方面，IGF2BPs家族蛋白（IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3）則通過識別m6A修飾來增強mRNA的穩(wěn)定性。IGF2BPs含有KH結(jié)構(gòu)域，能夠特異性地結(jié)合m6A修飾的mRNA。在小鼠的腫瘤發(fā)生過程中，IGF2BP1的作用尤為顯著。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠肝癌細胞中，IGF2BP1與肝癌相關基因mRNA上的m6A修飾結(jié)合，阻止mRNA被降解，使得這些基因的表達持續(xù)維持在較高水平，促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。通過抑制IGF2BP1的表達或功能，可以降低肝癌相關基因mRNA的穩(wěn)定性，減少其表達，從而抑制肝癌細胞的惡性生物學行為。這表明IGF2BPs通過識別m6A修飾，穩(wěn)定mRNA，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。m6A修飾對mRNA穩(wěn)定性的影響還受到其他因素的調(diào)節(jié)。例如，mRNA的二級結(jié)構(gòu)會影響m6A修飾位點的可及性，進而影響“閱讀器”蛋白與m6A修飾mRNA的結(jié)合。當mRNA形成特定的二級結(jié)構(gòu)時，可能會掩蓋m6A修飾位點，使得YTHDF2或IGF2BPs等“閱讀器”蛋白難以結(jié)合，從而影響mRNA的穩(wěn)定性。此外，細胞內(nèi)的信號通路也可以通過調(diào)節(jié)“閱讀器”蛋白的表達或活性，間接影響m6A修飾對mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控。在小鼠胚胎發(fā)育過程中，隨著胚胎的發(fā)育，細胞內(nèi)的信號通路發(fā)生動態(tài)變化，這些變化可以調(diào)節(jié)YTHDF2和IGF2BPs的表達水平，從而動態(tài)調(diào)控m6A修飾對mRNA穩(wěn)定性的影響，確保胚胎發(fā)育過程中基因表達的精準調(diào)控。2.3.2對mRNA翻譯效率的影響m6A修飾對mRNA翻譯效率的影響是其調(diào)控基因表達的另一個重要層面，主要通過與翻譯起始因子、核糖體等相互作用來實現(xiàn)。YTHDF1作為一種重要的m6A“閱讀器”蛋白，在這一過程中發(fā)揮著關鍵作用。YTHDF1能夠特異性地識別并結(jié)合m6A修飾的mRNA，然后招募翻譯起始因子eIF3，形成YTHDF1-m6A-mRNA-eIF3復合物。eIF3是翻譯起始過程中的關鍵因子，它能夠促進核糖體小亞基與mRNA的結(jié)合，從而啟動翻譯過程。通過形成這種復合物，YTHDF1增強了mRNA與核糖體的結(jié)合能力，提高了mRNA的翻譯效率。例如，在小鼠的神經(jīng)發(fā)育過程中，YTHDF1對神經(jīng)遞質(zhì)受體基因mRNA的翻譯調(diào)控至關重要。研究發(fā)現(xiàn)，當YTHDF1基因敲除時，神經(jīng)遞質(zhì)受體基因mRNA上雖然存在m6A修飾，但由于缺乏YTHDF1的作用，其翻譯效率顯著降低，導致神經(jīng)遞質(zhì)受體表達減少，影響神經(jīng)信號的傳遞和神經(jīng)回路的形成，最終影響小鼠的神經(jīng)功能，表現(xiàn)為學習記憶能力下降、行為異常等。除了YTHDF1，其他m6A結(jié)合蛋白也參與了對mRNA翻譯效率的調(diào)控。eIF3本身也可以直接識別m6A修飾的mRNA，促進翻譯起始。研究表明，eIF3的亞基eIF3a能夠與m6A修飾的mRNA結(jié)合，增強mRNA與核糖體的相互作用，提高翻譯效率。在小鼠的細胞增殖過程中，eIF3對m6A修飾mRNA的識別和結(jié)合，促進了細胞增殖相關基因的翻譯，推動細胞的增殖進程。如果eIF3與m6A修飾mRNA的相互作用受到干擾，細胞增殖相關基因的翻譯效率下降，可能導致細胞增殖受阻。m6A修飾對mRNA翻譯效率的影響還與修飾位點的位置密切相關。在5'UTR區(qū)域的m6A修飾能夠增強非帽結(jié)構(gòu)依賴的翻譯起始。研究發(fā)現(xiàn)，當5'UTR區(qū)域存在m6A修飾時，它可以招募特定的蛋白復合物，促進核糖體小亞基與mRNA的結(jié)合，從而啟動翻譯過程。在CDS區(qū)域的m6A修飾則可能影響翻譯延伸速率。有研究表明，CDS區(qū)域的m6A修飾可以改變核糖體在mRNA上的移動速度，對蛋白質(zhì)的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生潛在影響。在終止密碼子附近和3'UTR區(qū)域的m6A修飾，除了可以被YTHDF1和YTHDF3識別增強翻譯起始外，還可能通過與其他蛋白的相互作用，影響mRNA的翻譯效率。例如，3'UTR區(qū)域的m6A修飾可以招募一些調(diào)控蛋白，這些蛋白可能與核糖體或翻譯起始因子相互作用，從而調(diào)節(jié)mRNA的翻譯效率。在小鼠胚胎發(fā)育過程中，不同階段基因mRNA上m6A修飾位點的動態(tài)變化，通過影響翻譯效率，調(diào)控著胚胎發(fā)育相關基因的表達，確保胚胎發(fā)育的正常進行。2.3.3對mRNA剪接和運輸?shù)挠绊憁6A修飾在mRNA剪接和核質(zhì)運輸過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，其作用機制及相關調(diào)控路徑涉及多個層面。在mRNA剪接方面，m6A修飾可以通過影響剪接因子與mRNA的結(jié)合，進而調(diào)控mRNA的剪接過程。HNRNPC是一種重要的m6A結(jié)合蛋白，同時也是一種剪接因子，它通過其RRM結(jié)構(gòu)域與m6A修飾的mRNA結(jié)合。在小鼠的心臟發(fā)育過程中，HNRNPC對心臟發(fā)育相關基因mRNA的剪接調(diào)控至關重要。當HNRNPC功能異常時，心臟發(fā)育相關基因mRNA的剪接發(fā)生紊亂，產(chǎn)生異常的剪接異構(gòu)體，影響心臟的正常發(fā)育和功能。例如，某些心臟發(fā)育相關基因的異常剪接會導致心肌細胞結(jié)構(gòu)和功能異常，進而引發(fā)心臟疾病，如心肌肥厚、心律失常等。這表明m6A修飾通過HNRNPC等結(jié)合蛋白，參與調(diào)控mRNA的剪接過程，對維持心臟的正常發(fā)育和功能具有重要意義。m6A修飾還可以通過調(diào)控mRNA的二級結(jié)構(gòu)來影響剪接過程。mRNA的二級結(jié)構(gòu)對剪接位點的識別和剪接因子的結(jié)合起著關鍵作用。m6A修飾可以改變mRNA的局部構(gòu)象，影響剪接因子與mRNA的相互作用，從而調(diào)控剪接位點的選擇。研究發(fā)現(xiàn)，在一些基因中，m6A修飾位點附近的mRNA二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，會導致剪接因子無法正常結(jié)合，從而改變剪接方式，產(chǎn)生不同的剪接異構(gòu)體。這種通過改變mRNA二級結(jié)構(gòu)來調(diào)控剪接的機制，為基因表達的精細調(diào)控提供了更多的可能性。在mRNA核質(zhì)運輸方面，m6A修飾同樣發(fā)揮著重要作用。核輸出蛋白XPO1是mRNA從細胞核運輸?shù)郊毎|(zhì)的關鍵載體，研究表明，m6A修飾可以促進mRNA與XPO1的結(jié)合，從而增強mRNA的核輸出效率。在小鼠胚胎干細胞中，對多能性相關基因mRNA的核質(zhì)運輸研究發(fā)現(xiàn)，當這些基因mRNA上存在m6A修飾時，它們與XPO1的結(jié)合能力增強，更易被運輸?shù)郊毎|(zhì)中進行翻譯。如果m6A修飾被破壞，mRNA與XPO1的結(jié)合減少，核輸出效率降低，會導致多能性相關蛋白的表達減少，影響胚胎干細胞的多能性維持。YTHDC1作為一種細胞核內(nèi)的m6A“閱讀器”蛋白，也參與了mRNA的核質(zhì)運輸調(diào)控。YTHDC1能夠識別m6A修飾的mRNA，并與核輸出相關的蛋白相互作用，促進mRNA的核輸出。在小鼠的神經(jīng)干細胞分化過程中，YTHDC1對神經(jīng)分化相關基因mRNA的核質(zhì)運輸調(diào)控起著重要作用。隨著神經(jīng)干細胞的分化，YTHDC1的表達和活性發(fā)生變化，它通過識別并結(jié)合神經(jīng)分化相關基因mRNA上的m6A修飾，與核輸出蛋白協(xié)同作用，將這些mRNA運輸?shù)郊毎|(zhì)中，促進神經(jīng)分化相關蛋白的表達，推動神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的分化進程。如果YTHDC1的功能異常，神經(jīng)分化相關基因mRNA的核質(zhì)運輸受阻，會影響神經(jīng)干細胞的分化，導致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常。三、m6A在小鼠多能性重編程中的調(diào)控功能與機制3.1多能性重編程的過程與關鍵因子多能性重編程是指將已分化的體細胞逆轉(zhuǎn)為具有多能性的誘導多能干細胞（iPSC）的過程，這一過程涉及復雜的分子事件和細胞命運轉(zhuǎn)變。在小鼠中，多能性重編程通常以小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）等體細胞為起始材料，通過特定的誘導方法使其重新獲得多能性。多能性重編程過程可大致分為起始、中間和穩(wěn)定三個階段。在起始階段，體細胞受到外界誘導信號的刺激，開始啟動重編程相關基因的表達。這些誘導信號可以來自轉(zhuǎn)錄因子的過表達、小分子化合物的處理或其他重編程方法。以山中伸彌團隊的經(jīng)典實驗為例，通過病毒介導的方式將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc（OSKM）這四個轉(zhuǎn)錄因子導入小鼠成纖維細胞，開啟了重編程的起始階段。在這個階段，體細胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)開始發(fā)生改變，原本處于沉默狀態(tài)的多能性相關基因的染色質(zhì)逐漸變得開放，為后續(xù)基因的表達做好準備。研究表明，Oct4和Sox2能夠與多能性基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，招募相關的轉(zhuǎn)錄激活因子，促進多能性基因的轉(zhuǎn)錄起始。同時，它們還可以通過與其他轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)重塑復合物相互作用，改變?nèi)旧|(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，使多能性基因更容易被轉(zhuǎn)錄機器識別和轉(zhuǎn)錄。隨著重編程的進行，細胞進入中間階段，此時細胞的代謝、信號通路和基因表達譜發(fā)生顯著變化。代謝方面，細胞從以糖酵解為主的代謝模式逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐匝趸姿峄癁橹鳎瑸榧毎峁└嗟哪芰亢蜕锖铣汕绑w，滿足重編程過程中細胞快速增殖和分化的需求。信號通路層面，多條信號通路被激活或抑制，共同協(xié)調(diào)細胞命運的轉(zhuǎn)變。例如，Wnt信號通路在重編程過程中發(fā)揮重要作用，激活Wnt信號通路可以促進重編程效率。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路的激活能夠上調(diào)多能性相關基因的表達，同時抑制體細胞特異性基因的表達，從而推動細胞向多能性狀態(tài)轉(zhuǎn)變。這是因為Wnt信號通路可以通過調(diào)節(jié)β-catenin的穩(wěn)定性和核轉(zhuǎn)位，使其與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活下游多能性基因的轉(zhuǎn)錄。此外，BMP信號通路也參與重編程過程，它可以通過抑制體細胞相關基因的表達，促進多能性基因的激活，對重編程起到正向調(diào)控作用。在基因表達譜方面，體細胞特異性基因的表達逐漸下調(diào)，而多能性相關基因的表達持續(xù)上升。這一階段，細胞逐漸失去體細胞的特征，開始獲得多能性干細胞的特性，如自我更新能力和分化潛能。例如，在小鼠成纖維細胞重編程為iPSC的過程中，成纖維細胞特異性基因如Col1a1、Fsp1等的表達逐漸降低，而多能性相關基因Oct4、Sox2、Nanog等的表達逐漸升高。這些多能性相關基因形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，相互作用，共同維持細胞的多能性狀態(tài)。其中，Oct4、Sox2和Nanog被認為是維持多能性的核心轉(zhuǎn)錄因子，它們可以直接結(jié)合到彼此的啟動子區(qū)域，形成正反饋調(diào)控回路，增強自身的表達，同時還可以調(diào)控其他多能性相關基因的表達。經(jīng)過中間階段的過渡，細胞最終進入穩(wěn)定階段，形成具有穩(wěn)定多能性的iPSC。此時的iPSC在形態(tài)、基因表達和功能上都與胚胎干細胞（ESC）極為相似，能夠在體外長期培養(yǎng)，并保持自我更新和分化為三個胚層細胞的能力。在形態(tài)上，iPSC呈現(xiàn)出典型的干細胞形態(tài)，細胞體積小、核質(zhì)比大，細胞之間緊密排列。在基因表達方面，iPSC高表達多能性相關基因，同時低表達體細胞特異性基因。通過免疫熒光染色和流式細胞術等方法可以檢測到iPSC表面表達SSEA-1、TRA-1-60等多能性標志物，這些標志物是鑒定iPSC多能性的重要指標。在功能上，iPSC能夠在適當?shù)恼T導條件下分化為神經(jīng)細胞、心肌細胞、肝細胞等多種細胞類型，體現(xiàn)了其強大的分化潛能。在多能性重編程過程中，Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc等轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著關鍵作用。Oct4是POU結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，它在維持細胞多能性和早期胚胎發(fā)育中起著核心作用。Oct4的表達水平對細胞命運的決定至關重要，過高或過低的Oct4表達都會導致細胞失去多能性。研究表明，當Oct4表達水平降低時，細胞會向滋養(yǎng)層細胞分化；而當Oct4表達水平過高時，細胞則會向原始內(nèi)胚層細胞分化。Sox2屬于Sox基因家族，它與Oct4相互作用，共同調(diào)控多能性相關基因的表達。Sox2可以與Oct4形成異源二聚體，結(jié)合到多能性基因的啟動子區(qū)域，增強基因的轉(zhuǎn)錄活性。Klf4是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，它在重編程過程中能夠促進細胞的增殖和存活，同時也參與調(diào)控多能性相關基因的表達。c-Myc是一種原癌基因，它在重編程中的作用較為復雜，一方面可以促進細胞的增殖和代謝，為重編程提供必要的物質(zhì)基礎；另一方面，c-Myc還可以通過調(diào)控染色質(zhì)重塑和基因轉(zhuǎn)錄，影響重編程的效率。然而，由于c-Myc具有致癌性，在實際應用中常使用其他轉(zhuǎn)錄因子或小分子化合物替代c-Myc，以提高iPSC的安全性。除了上述四個經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄因子外，其他一些轉(zhuǎn)錄因子也在多能性重編程中發(fā)揮重要作用。Nanog是維持細胞多能性的關鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，它可以獨立于Oct4和Sox2發(fā)揮作用，調(diào)控多能性相關基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，Nanog能夠與染色質(zhì)重塑復合物相互作用，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，促進多能性基因的表達。Lin28是一種RNA結(jié)合蛋白，它可以通過調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，影響多能性重編程過程。在小鼠體細胞重編程為iPSC的過程中，Lin28的過表達可以提高重編程效率。這是因為Lin28能夠結(jié)合到Let-7家族miRNA的前體上，抑制Let-7miRNA的成熟，從而解除Let-7miRNA對多能性相關基因的抑制作用，促進重編程的進行。3.2m6A修飾在多能性重編程中的動態(tài)變化3.2.1不同重編程階段m6A修飾水平的變化在小鼠多能性重編程過程中，m6A修飾水平呈現(xiàn)出動態(tài)變化的特征，這一變化與重編程的各個階段緊密相關，對細胞命運的轉(zhuǎn)變起著關鍵的調(diào)控作用。研究人員運用m6A-seq技術，對小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）重編程為誘導多能干細胞（iPSC）過程中的不同階段細胞進行了全面分析。在重編程的起始階段，MEF細胞中的m6A修飾水平相對較低。隨著重編程的推進，當細胞進入中間階段時，m6A修飾水平開始逐漸上升。這一時期，體細胞特異性基因的表達逐漸下調(diào)，而多能性相關基因的表達逐漸升高，m6A修飾水平的上升可能與這些基因表達的變化密切相關。例如，在這一階段，多能性相關基因Oct4、Sox2和Nanog的mRNA上的m6A修飾水平顯著增加。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這些基因mRNA上的m6A修飾主要集中在3'UTR區(qū)域，這可能通過招募特定的m6A結(jié)合蛋白，如YTHDF1，增強mRNA的翻譯效率，從而促進多能性相關蛋白的表達，推動細胞向多能性狀態(tài)轉(zhuǎn)變。到了重編程的穩(wěn)定階段，iPSC細胞中的m6A修飾水平達到相對穩(wěn)定的狀態(tài)，且維持在較高水平。此時的iPSC在形態(tài)、基因表達和功能上都與胚胎干細胞（ESC）極為相似，能夠在體外長期培養(yǎng)，并保持自我更新和分化為三個胚層細胞的能力。在這一階段，m6A修飾對維持iPSC的多能性起著重要作用。通過敲低m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的表達，降低iPSC中的m6A修飾水平，發(fā)現(xiàn)多能性相關基因的表達顯著下降，iPSC的多能性受到破壞，細胞出現(xiàn)分化的趨勢。這表明m6A修飾在維持iPSC多能性相關基因的表達和細胞的多能性狀態(tài)方面具有不可或缺的作用。為了進一步驗證m6A修飾水平的動態(tài)變化，研究人員還采用了其他技術進行驗證。運用Dot-blot技術，對不同重編程階段細胞中的總RNA進行m6A修飾水平的檢測，結(jié)果與m6A-seq技術的檢測結(jié)果一致，進一步證實了在小鼠多能性重編程過程中，m6A修飾水平從起始階段的較低水平，逐漸上升至中間階段，最終在穩(wěn)定階段維持在較高且穩(wěn)定的水平。此外，通過免疫熒光染色技術，對m6A修飾相關蛋白METTL3、METTL14和FTO等在不同重編程階段細胞中的表達和定位進行分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白的表達和定位也呈現(xiàn)出與m6A修飾水平動態(tài)變化相匹配的特征。在起始階段，METTL3和METTL14的表達相對較低，且主要定位于細胞核內(nèi)；隨著重編程的進行，它們的表達逐漸增加，并且在細胞質(zhì)中也有一定的分布；到了穩(wěn)定階段，它們的表達維持在較高水平，且在細胞核和細胞質(zhì)中均有均勻分布。而FTO的表達則在起始階段較高，隨著重編程的推進逐漸降低，這與FTO作為去甲基化酶，在重編程早期去除部分m6A修飾，以啟動重編程過程的作用相符合。3.2.2差異甲基化基因的篩選與功能分析在明確了小鼠多能性重編程過程中m6A修飾水平的動態(tài)變化后，深入篩選差異甲基化基因并探究其功能，對于揭示m6A修飾在多能性重編程中的調(diào)控機制具有至關重要的意義。通過對小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）、重編程中間階段細胞和誘導多能干細胞（iPSC）進行m6A-seq測序，結(jié)合生物信息學分析方法，篩選出在不同階段具有顯著差異甲基化的基因。在重編程過程中，與MEF相比，iPSC中有大量基因的m6A修飾水平發(fā)生了顯著變化。其中，一些基因在iPSC中呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，如Oct4、Sox2、Nanog等多能性相關基因。以Oct4基因為例，其mRNA在iPSC中的m6A修飾水平顯著高于MEF，通過對其m6A修飾位點進行分析，發(fā)現(xiàn)主要集中在3'UTR區(qū)域。這一區(qū)域的m6A修飾可能通過與m6A結(jié)合蛋白YTHDF1相互作用，促進Oct4mRNA的翻譯，從而維持iPSC中Oct4蛋白的高表達，對iPSC的多能性維持起著關鍵作用。為了驗證這些差異甲基化基因在多能性重編程中的功能，采用了基因功能驗證實驗。利用RNA干擾（RNAi）技術，針對iPSC中高甲基化的多能性相關基因Oct4，設計并轉(zhuǎn)染特異性的siRNA，降低Oct4基因mRNA的m6A修飾水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，iPSC的多能性受到顯著影響，細胞形態(tài)發(fā)生改變，失去典型的干細胞形態(tài)，細胞之間的緊密排列結(jié)構(gòu)被破壞，變得松散。通過免疫熒光染色檢測多能性標志物SSEA-1和TRA-1-60的表達，發(fā)現(xiàn)其表達水平明顯下降；同時，通過實時定量PCR（qPCR）檢測多能性相關基因Oct4、Sox2和Nanog的mRNA表達水平，也證實了這些基因的表達顯著降低。這表明降低Oct4基因mRNA的m6A修飾水平，會破壞iPSC的多能性相關基因表達網(wǎng)絡，導致iPSC失去多能性。另一方面，對于在重編程過程中m6A修飾水平降低的基因，同樣進行了功能驗證。例如，在MEF中高表達且m6A修飾水平較高的體細胞特異性基因Col1a1，在重編程為iPSC的過程中，其m6A修飾水平顯著下降。利用基因編輯技術CRISPR/Cas9，在iPSC中過表達Col1a1基因，并使其mRNA恢復到較高的m6A修飾水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，iPSC的多能性受到抑制，細胞出現(xiàn)向成纖維細胞方向分化的趨勢。通過檢測細胞的分化標志物，發(fā)現(xiàn)成纖維細胞特異性標志物FSP1的表達顯著增加，而多能性標志物的表達降低。這說明恢復體細胞特異性基因的m6A修飾水平，會干擾iPSC的多能性維持，促進細胞向體細胞方向分化。除了上述單個基因的功能驗證，還對差異甲基化基因所參與的信號通路進行了分析。通過基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，發(fā)現(xiàn)差異甲基化基因主要富集在與細胞增殖、分化、代謝以及多能性調(diào)控相關的信號通路中。在細胞增殖信號通路中，一些差異甲基化基因通過調(diào)控細胞周期相關蛋白的表達，影響細胞的增殖能力。在重編程過程中，某些基因的m6A修飾變化會導致細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達改變，進而影響細胞周期的進程，調(diào)控細胞的增殖速率。在多能性調(diào)控信號通路中，Wnt信號通路相關基因的m6A修飾變化尤為顯著。研究發(fā)現(xiàn)，在iPSC中，Wnt信號通路關鍵基因β-catenin的mRNA呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，這種m6A修飾可能通過影響β-cateninmRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，增強Wnt信號通路的活性，促進多能性相關基因的表達，維持iPSC的多能性。3.3m6A修飾對多能性相關基因表達的調(diào)控3.3.1m6A修飾對關鍵轉(zhuǎn)錄因子mRNA穩(wěn)定性的影響在小鼠多能性重編程過程中，m6A修飾對關鍵轉(zhuǎn)錄因子mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控作用至關重要，以Oct4、Sox2等為代表的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，其mRNA穩(wěn)定性的改變直接關系到多能性的維持與重編程進程。Oct4作為多能性維持的核心轉(zhuǎn)錄因子之一，其mRNA上存在豐富的m6A修飾位點。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）重編程為誘導多能干細胞（iPSC）的過程中，Oct4mRNA的m6A修飾水平呈現(xiàn)動態(tài)變化。在重編程的起始階段，Oct4mRNA的m6A修飾水平較低，隨著重編程的推進，其m6A修飾水平逐漸升高。通過RNA免疫沉淀（RIP）實驗結(jié)合高通量測序技術，發(fā)現(xiàn)Oct4mRNA的m6A修飾主要集中在3'UTR區(qū)域。這一區(qū)域的m6A修飾能夠招募m6A結(jié)合蛋白YTHDF2。YTHDF2與Oct4mRNA的m6A修飾位點結(jié)合后，招募CCR4-NOT復合物，導致Oct4mRNA的降解。在重編程的穩(wěn)定階段，iPSC中Oct4蛋白需要維持較高水平以保證細胞的多能性，此時細胞內(nèi)可能存在其他機制來平衡YTHDF2對Oct4mRNA的降解作用，如IGF2BP1等m6A結(jié)合蛋白可能與YTHDF2競爭結(jié)合Oct4mRNA上的m6A修飾位點，從而增強Oct4mRNA的穩(wěn)定性。為了驗證這一假設，利用RNA干擾（RNAi）技術分別敲低YTHDF2和IGF2BP1的表達。結(jié)果顯示，敲低YTHDF2后，Oct4mRNA的半衰期顯著延長，Oct4蛋白表達水平升高；而敲低IGF2BP1后，Oct4mRNA的穩(wěn)定性下降，Oct4蛋白表達減少，進一步證實了m6A修飾通過YTHDF2和IGF2BP1等結(jié)合蛋白對Oct4mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控作用。Sox2同樣是多能性維持的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，其mRNA的m6A修飾也在多能性重編程中發(fā)揮重要作用。研究表明，Sox2mRNA的m6A修飾主要發(fā)生在CDS區(qū)域和3'UTR區(qū)域。在CDS區(qū)域的m6A修飾可能影響核糖體在mRNA上的移動速度，從而影響翻譯延伸速率。而3'UTR區(qū)域的m6A修飾則通過與m6A結(jié)合蛋白的相互作用，影響mRNA的穩(wěn)定性。通過構(gòu)建Sox2mRNA的m6A修飾突變體，將3'UTR區(qū)域的m6A修飾位點進行突變，使其無法被m6A結(jié)合蛋白識別。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變后的Sox2mRNA穩(wěn)定性下降，Sox2蛋白表達減少，導致iPSC的多能性受到影響。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Sox2mRNA的m6A修飾還與細胞內(nèi)的信號通路密切相關。在Wnt信號通路激活時，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的表達上調(diào)，導致Sox2mRNA的m6A修飾水平升高，進而增強Sox2mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，促進多能性相關基因的表達，維持iPSC的多能性。除了Oct4和Sox2，Nanog等其他關鍵轉(zhuǎn)錄因子的mRNA穩(wěn)定性也受到m6A修飾的調(diào)控。這些關鍵轉(zhuǎn)錄因子之間相互作用，形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，m6A修飾通過對它們mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控，影響整個調(diào)控網(wǎng)絡的平衡，從而決定細胞的多能性狀態(tài)。在小鼠多能性重編程過程中，深入研究m6A修飾對關鍵轉(zhuǎn)錄因子mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控機制，對于理解多能性維持和重編程的分子機制具有重要意義，也為優(yōu)化多能性重編程技術，提高iPSC的誘導效率和質(zhì)量提供了理論依據(jù)。3.3.2m6A修飾對信號通路相關基因表達的影響m6A修飾在小鼠多能性重編程中，對Wnt、BMP等信號通路相關基因表達的調(diào)控作用顯著，進而深刻影響多能性重編程進程。在Wnt信號通路中，m6A修飾對相關基因表達的調(diào)控機制較為復雜。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）重編程為誘導多能干細胞（iPSC）的過程中，Wnt信號通路關鍵基因β-catenin的mRNA存在m6A修飾。通過m6A-seq技術對不同重編程階段細胞進行分析，發(fā)現(xiàn)隨著重編程的進行，β-cateninmRNA的m6A修飾水平逐漸升高。進一步研究表明，這種m6A修飾能夠增強β-cateninmRNA的穩(wěn)定性。m6A結(jié)合蛋白IGF2BP1通過其KH結(jié)構(gòu)域識別并結(jié)合β-cateninmRNA上的m6A修飾位點，阻止mRNA被降解，使得β-cateninmRNA的半衰期延長，從而保證了β-catenin蛋白的持續(xù)表達。β-catenin蛋白是Wnt信號通路的核心分子，它在細胞質(zhì)中積累后，會進入細胞核與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活下游多能性相關基因的轉(zhuǎn)錄。在重編程的起始階段，Wnt信號通路的激活可以促進體細胞向多能性狀態(tài)轉(zhuǎn)變。當m6A修飾對β-cateninmRNA穩(wěn)定性的調(diào)控作用被破壞時，如敲低IGF2BP1的表達，β-cateninmRNA的穩(wěn)定性下降，蛋白表達減少，Wnt信號通路的活性受到抑制，導致多能性相關基因的表達降低，重編程效率顯著下降。這表明m6A修飾通過調(diào)控β-cateninmRNA的穩(wěn)定性，維持Wnt信號通路的活性，對多能性重編程起到重要的促進作用。BMP信號通路在小鼠多能性重編程中也起著關鍵作用，m6A修飾同樣參與了對該信號通路相關基因表達的調(diào)控。以BMP信號通路中的關鍵基因Smad1為例，研究發(fā)現(xiàn)其mRNA在重編程過程中存在m6A修飾。在重編程的中間階段，Smad1mRNA的m6A修飾水平較高。m6A修飾通過影響Smad1mRNA的翻譯效率來調(diào)控基因表達。YTHDF1作為m6A結(jié)合蛋白，能夠識別并結(jié)合Smad1mRNA上的m6A修飾位點，招募翻譯起始因子eIF3，形成YTHDF1-m6A-Smad1mRNA-eIF3復合物，從而增強Smad1mRNA的翻譯效率。Smad1蛋白在BMP信號通路中發(fā)揮重要作用，它被激活后會與其他Smad蛋白形成復合物進入細胞核，調(diào)控下游基因的表達。在多能性重編程過程中，BMP信號通路的激活可以促進體細胞特異性基因的表達下調(diào)，同時促進多能性相關基因的表達上調(diào)。當m6A修飾對Smad1mRNA翻譯效率的調(diào)控作用被干擾時，如敲低YTHDF1的表達，Smad1蛋白的表達減少，BMP信號通路的活性受到抑制，導致多能性重編程進程受阻。這說明m6A修飾通過調(diào)控Smad1mRNA的翻譯效率，維持BMP信號通路的正常功能，對多能性重編程的順利進行具有重要意義。除了Wnt和BMP信號通路，m6A修飾還對其他與多能性重編程相關的信號通路，如MAPK、PI3K-AKT等信號通路的相關基因表達產(chǎn)生影響。這些信號通路之間相互交織，形成復雜的信號網(wǎng)絡，m6A修飾通過對各信號通路相關基因表達的精細調(diào)控，協(xié)同作用，共同決定了多能性重編程的進程。在小鼠多能性重編程過程中，深入研究m6A修飾對信號通路相關基因表達的調(diào)控機制，有助于全面揭示多能性重編程的分子機制，為提高多能性重編程效率和質(zhì)量提供理論基礎，推動多能性干細胞在再生醫(yī)學等領域的應用。3.4m6A修飾調(diào)控多能性重編程的分子機制3.4.1“寫入器”、“擦除器”和“閱讀器”在重編程中的作用在小鼠多能性重編程過程中，“寫入器”、“擦除器”和“閱讀器”三類蛋白作為m6A修飾的關鍵調(diào)控因子，各自發(fā)揮著獨特而重要的作用，它們之間的協(xié)同作用共同決定了重編程的進程和結(jié)果?！皩懭肫鳌奔醇谆D(zhuǎn)移酶復合物，在多能性重編程中扮演著啟動m6A修飾的關鍵角色。METTL3作為甲基轉(zhuǎn)移酶復合物的催化亞基，其在重編程中的作用至關重要。通過構(gòu)建METTL3基因敲除的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）模型，研究發(fā)現(xiàn)，當METTL3缺失時，細胞中m6A修飾水平顯著下降，多能性重編程效率明顯降低。在重編程過程中，METTL3能夠催化多能性相關基因mRNA的m6A修飾。以Oct4基因為例，METTL3通過其甲基轉(zhuǎn)移酶活性，將甲基基團添加到Oct4mRNA的特定腺苷酸殘基上，形成m6A修飾。這種修飾能夠招募m6A結(jié)合蛋白，如YTHDF1，增強Oct4mRNA的翻譯效率，從而促進Oct4蛋白的表達，維持細胞的多能性。此外，METTL14作為甲基轉(zhuǎn)移酶復合物的重要成員，與METTL3形成異源二聚體，協(xié)助METTL3識別RNA底物，并增強其催化活性。研究表明，當METTL14的表達被抑制時，METTL3對多能性相關基因mRNA的m6A修飾能力下降，重編程進程受到阻礙。這表明METTL14在協(xié)助METTL3進行m6A修飾，促進多能性重編程方面具有不可或缺的作用?！安脸鳌奔慈ゼ谆?，在多能性重編程中發(fā)揮著動態(tài)調(diào)節(jié)m6A修飾水平的作用。FTO作為最早被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶，在重編程過程中具有重要功能。通過在MEF細胞中過表達FTO，發(fā)現(xiàn)細胞中m6A修飾水平降低，多能性重編程效率受到影響。進一步研究表明，F(xiàn)TO能夠去除多能性相關基因mRNA上的m6A修飾，改變mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。在重編程的起始階段，F(xiàn)TO可能通過降低某些抑制重編程基因mRNA的m6A修飾水平，增強這些mRNA的穩(wěn)定性，從而抑制重編程的啟動。而在重編程的后期，F(xiàn)TO對多能性相關基因mRNA的去甲基化作用可能會影響基因表達的平衡，對細胞的多能性維持產(chǎn)生負面影響。ALKBH5作為另一種m6A去甲基化酶，同樣參與了多能性重編程的調(diào)控。在誘導多能干細胞（iPSC）的形成過程中，ALKBH5的表達變化會影響m6A修飾水平，進而影響重編程效率。研究發(fā)現(xiàn)，當ALKBH5的表達被抑制時，m6A修飾水平升高，多能性相關基因的表達上調(diào)，重編程效率提高。這表明ALKBH5通過去除m6A修飾，對多能性重編程起到負向調(diào)控作用，其在重編程過程中的動態(tài)調(diào)節(jié)作用對于維持m6A修飾水平的平衡和重編程的正常進行具有重要意義。“閱讀器”即m6A結(jié)合蛋白，在多能性重編程中通過識別m6A修飾，調(diào)控mRNA的代謝過程，從而影響重編程進程。YTHDF1作為m6A結(jié)合蛋白，在重編程中主要促進mRNA的翻譯。在MEF細胞重編程為iPSC的過程中，YTHDF1能夠識別并結(jié)合多能性相關基因mRNA上的m6A修飾位點，招募翻譯起始因子eIF3，形成YTHDF1-m6A-mRNA-eIF3復合物，增強mRNA的翻譯效率。以Sox2基因為例，YTHDF1與Sox2mRNA上的m6A修飾結(jié)合后，促進Sox2蛋白的表達，推動細胞向多能性狀態(tài)轉(zhuǎn)變。YTHDF2則主要促進mRNA的降解。在重編程過程中，YTHDF2識別并結(jié)合多能性相關基因mRNA上的m6A修飾，招募CCR4-NOT復合物，導致mRNA的降解。在iPSC的維持階段，YTHDF2對一些多能性維持因子基因mRNA的降解調(diào)控，有助于維持多能性相關基因表達的平衡，保證iPSC的多能性穩(wěn)定。IGF2BPs家族蛋白（IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3）通過識別m6A修飾來增強mRNA的穩(wěn)定性。在小鼠多能性重編程中，IGF2BP1能夠與多能性相關基因mRNA上的m6A修飾結(jié)合，阻止mRNA被降解，維持mRNA的穩(wěn)定性，從而促進重編程的進行。例如，IGF2BP1與Oct4mRNA的m6A修飾結(jié)合，使得Oct4mRNA的半衰期延長，保證Oct4蛋白的持續(xù)表達，對維持細胞的多能性起到重要作用。3.4.2m6A修飾與其他表觀遺傳修飾的交互作用在小鼠多能性重編程過程中，m6A修飾并非孤立地發(fā)揮作用，而是與DNA甲基化、組蛋白修飾等其他表觀遺傳修飾之間存在著復雜而緊密的交互作用，這些交互作用共同構(gòu)成了一個精密的調(diào)控網(wǎng)絡，協(xié)同調(diào)節(jié)基因表達，深刻影響著多能性重編程的進程。m6A修飾與DNA甲基化之間存在著相互影響的關系。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，主要發(fā)生在DNA的CpG島區(qū)域，對基因表達起著關鍵的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）重編程為誘導多能干細胞（iPSC）的過程中，m6A修飾可以影響DNA甲基化的狀態(tài)。以多能性相關基因Oct4為例，其啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平與m6A修飾密切相關。在重編程的起始階段，隨著m6A修飾水平的升高，Oct4基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平逐漸降低。進一步研究表明，m6A修飾通過招募特定的蛋白復合物，如TET家族蛋白，促進DNA去甲基化。TET蛋白能夠?qū)?-甲基胞嘧啶（5mC）氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC），進而逐步實現(xiàn)DNA去甲基化。在這個過程中，m6A修飾的mRNA可能通過與TET蛋白或其他相關蛋白的相互作用，引導TET蛋白定位到Oct4基因啟動子區(qū)域，促進DNA去甲基化，從而激活Oct4基因的表達，推動重編程進程。相反，DNA甲基化也可以影響m6A修飾。當Oct4基因啟動子區(qū)域處于高甲基化狀態(tài)時，會抑制基因的轉(zhuǎn)錄，導致mRNA的合成減少，進而影響m6A修飾的發(fā)生。這是因為m6A修飾是在mRNA合成后進行的，DNA甲基化對基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用會減少mRNA的底物量，使得m6A修飾的機會降低。m6A修飾與組蛋白修飾之間也存在著廣泛的交互作用。組蛋白修飾包括甲基化、乙?；⒘姿峄榷喾N形式，這些修飾可以改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，從而調(diào)控基因表達。在小鼠多能性重編程中，m6A修飾與組蛋白甲基化之間存在著密切的聯(lián)系。以H3K4me3修飾為例，它通常與基因的激活相關。研究發(fā)現(xiàn)，在重編程過程中，m6A修飾可以促進H3K4me3修飾在多能性相關基因啟動子區(qū)域的富集。例如，m6A修飾的mRNA可以招募含有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白復合物，如MLL復合物，到多能性相關基因的啟動子區(qū)域，促進H3K4的甲基化。這種H3K4me3修飾的增加使得染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加開放，有利于轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動子區(qū)域的結(jié)合，從而激活基因表達，促進重編程。另一方面，組蛋白修飾也可以影響m6A修飾。H3K27me3修飾是一種與基因沉默相關的組蛋白修飾。當多能性相關基因啟動子區(qū)域富集H3K27me3修飾時，會抑制基因的轉(zhuǎn)錄，減少mRNA的合成，進而影響m6A修飾的水平。此外，組蛋白乙?；才cm6A修飾存在交互作用。組蛋白乙?；梢允谷旧|(zhì)結(jié)構(gòu)松散，增加基因的可及性，促進基因轉(zhuǎn)錄。在重編程過程中，組蛋白乙?；降淖兓赡軙绊憁RNA的合成和加工，進而影響m6A修飾的發(fā)生。例如，在某些情況下，組蛋白乙?；降纳邥龠M多能性相關基因的轉(zhuǎn)錄，增加mRNA的合成量，為m6A修飾提供更多的底物，從而可能導致m6A修飾水平的升高。四、m6A在小鼠全能性重編程中的調(diào)控功能與機制4.1全能性重編程的關鍵過程與特點全能性重編程是指細胞從已分化狀態(tài)或多能性狀態(tài)逆轉(zhuǎn)為具有全能性的過程，這一過程對于生命的起始和早期發(fā)育至關重要。在小鼠中，全能性重編程主要發(fā)生在胚胎發(fā)育的早期階段，其中母源-合子轉(zhuǎn)換（MZT）是全能性重編程的關鍵時期，這一過程涉及到一系列復雜的分子事件和細胞命運轉(zhuǎn)變。MZT是卵母細胞由母源環(huán)境向合子基因組驅(qū)動的表達程序轉(zhuǎn)變的一個基本而保守的過程，它將最終分化的卵母細胞和精子重新編程為全能性狀態(tài)。這一過程起始于受精作用，受精觸發(fā)卵母細胞中存儲的RNA與蛋白質(zhì)等母源物質(zhì)逐漸被降解，與此同時，合子基因組被激活（ZGA）。在小鼠中，ZGA主要發(fā)生在2細胞階段，此時胚胎開始從依賴母源物質(zhì)轉(zhuǎn)向依賴自身基因組的表達來進行發(fā)育。MZT過程中，伴隨著母源RNA和蛋白質(zhì)的清除，合子基因組逐漸接管胚胎發(fā)育的調(diào)控，使得胚胎細胞獲得全能性，具備發(fā)育成完整生物體的能力。MZT過程具有以下顯著特點：母源物質(zhì)的降解與合子基因組的激活是緊密協(xié)調(diào)的。在受精后的早期階段，母源mRNA和蛋白質(zhì)大量存在，它們?yōu)榕咛サ脑缙诎l(fā)育提供了必要的物質(zhì)基礎和調(diào)控信號。隨著發(fā)育的進行，母源物質(zhì)逐漸被降解，這一過程涉及到多種RNA降解途徑和蛋白質(zhì)降解機制。與此同時，合子基因組開始激活，相關基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯逐漸啟動，為胚胎發(fā)育提供新的調(diào)控指令。研究表明，在小鼠MZT過程中，母源mRNA的降解主要通過核酸內(nèi)切酶和外切酶的作用，以及與RNA結(jié)合蛋白的相互作用來實現(xiàn)。而合子基因組的激活則依賴于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑、轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合以及RNA聚合酶的活性等多種因素。MZT過程中的基因表達調(diào)控呈現(xiàn)出高度的時空特異性。在不同的發(fā)育階段，基因表達譜發(fā)生顯著變化，特定的基因在特定的時間點被激活或抑制。在合子基因組激活的早期階段，一些與胚胎發(fā)育和全能性相關的基因，如Oct4、Sox2和Nanog等，開始表達并發(fā)揮重要作用。這些基因形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，相互作用，共同維持胚胎細胞的全能性。隨著發(fā)育的推進，基因表達譜進一步分化，胚胎細胞逐漸獲得不同的命運，為后續(xù)的組織和器官形成奠定基礎。MZT過程還涉及到表觀遺傳修飾的動態(tài)變化。DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳修飾在這一過程中發(fā)生顯著改變，對基因表達和細胞命運決定產(chǎn)生重要影響。在小鼠MZT過程中，DNA甲基化水平發(fā)生動態(tài)變化，一些基因的啟動子區(qū)域在合子基因組激活前后出現(xiàn)甲基化狀態(tài)的改變，從而影響基因的表達。組蛋白修飾也呈現(xiàn)出動態(tài)變化，如H3K4me3、H3K27me3等修飾在不同發(fā)育階段的分布和水平發(fā)生改變，調(diào)控染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，進而影響基因的轉(zhuǎn)錄。4.2m6A修飾在全能性重編程中的動態(tài)圖譜4.2.1MZT期間m6A標記mRNA的動態(tài)變化為了深入揭示小鼠全能性重編程過程中m6A修飾的動態(tài)變化規(guī)律，研究人員運用SLIM-seq（微量樣本m6A測序技術）等先進技術，對小鼠母源-合子轉(zhuǎn)換（MZT）期間的關鍵階段細胞，包括MII卵母細胞、晚期1細胞胚胎（L1C）和晚期2細胞胚胎（L2C）進行了全面分析。通過SLIM-seq技術，研究人員在小鼠MZT期間共鑒定到3396個m6A標記的mRNAs和973個m6A標記的ncRNAs。將SLIM-seq數(shù)據(jù)與RNA-seq數(shù)據(jù)進行對比分析后發(fā)現(xiàn)，m6A標記的mRNA數(shù)量在受精后呈現(xiàn)出顯著減少的趨勢，而在合子基因組激活（ZGA）期間又逐漸增加。在不同發(fā)育階段，m6A水平的變化趨勢與m6A標記mRNA數(shù)量的變化趨勢高度一致。具體而言，在MII卵母細胞階段，m6A標記的mRNA數(shù)量相對較多，隨著受精過程的發(fā)生，母源mRNA開始降解，m6A標記的mRNA數(shù)量隨之減少。當胚胎發(fā)育至ZGA階段，合子基因組開始激活，新合成的mRNA逐漸增多，m6A標記的mRNA數(shù)量也相應增加。進一步對m6A修飾的動態(tài)變化模式進行分析，揭示了早期胚胎發(fā)育過程中m6A動態(tài)的三種主要模式：母體丟失、一致遺傳和新生獲得。母體丟失模式表現(xiàn)為在MII卵母細胞中存在m6A修飾的mRNA，在受精后m6A修飾消失，mRNA逐漸降解。研究發(fā)現(xiàn)，一些與卵母細胞特異性功能相關的mRNA，如參與卵母細胞減數(shù)分裂調(diào)控的基因mRNA，在受精后其m6A修飾丟失，mRNA迅速降解，為胚胎發(fā)育的新階段做好準備。一致遺傳模式是指m6A修飾的mRNA從MII卵母細胞一直遺傳到L2C胚胎，且mRNA水平?jīng)]有明顯變化。這些一致遺傳的m6A標記mRNA可能在胚胎發(fā)育的早期階段發(fā)揮著持續(xù)穩(wěn)定的調(diào)控作用。例如，一些與胚胎發(fā)育基礎