生物分離技術(shù)自己的筆記VIP

分派系數(shù)m:

〃?=q/q

式中,cs和cm分別為組份在固定相和流動(dòng)相中的濃度。

m類型:A.B型曲線是一條典型的吸附等溫線，吸附色譜法屬于這類曲線。C和D型吸附等溫線很少碰到。

C曲線為線性分派等溫線。

線性色譜：溶質(zhì)濃度低時(shí),m為常數(shù)時(shí)的色譜

意義：容易理解，溶質(zhì)流過色譜柱時(shí),m大的組份通過色譜柱所需要的時(shí)間長,m小的組份需要的時(shí)間短;

當(dāng)樣品中各組份在兩相的m不同時(shí)，就能實(shí)現(xiàn)差速遷移，達(dá)成分離的目的。

按原理分類（P122掌握）

旗掾牖涌趟分醐懈

麻能般質(zhì)都邠劃涮靴

?刪艷誥法

施解法桶m

觸作胭崎蛹樵鞅幃融鼾郎

，撇解法惴懿分積寸

物秣爆法寐枷的域?qū)②埠裏o酬靴

吸附等溫線

當(dāng)吸附劑與溶液中的溶質(zhì)達(dá)成平衡時(shí)，其吸附量q*同溶液中溶質(zhì)的平衡應(yīng)與溫度有關(guān)。

當(dāng)溫度一定期，吸附量只和濃度有關(guān),q*=f（c）—吸附等溫線。

幾種常見的吸防等溫線

1-Henrv型i2—Freundlich型；

3-Langmuir型:4一矩形

A）、Henrytype

在一定溫度下，平衡時(shí)吸附劑吸附溶質(zhì)濃度q*與液相溶質(zhì)濃度c之間的關(guān)系為線性函數(shù):

q=me

m為分派系數(shù)。

適應(yīng)條件：在低濃度范圍之內(nèi)成立。當(dāng)濃度較高時(shí)，上式無效。

B)、Freundlichtype

其經(jīng)驗(yàn)公式為

夕'=kc"

其中,k和B為常數(shù)，B一般在0.1/之間。當(dāng)吸附劑對(duì)溶質(zhì)的吸附作用非常大的時(shí)候，B也許小于0.1,

此時(shí)游離濃度對(duì)吸附濃度的影響很小。

Freundlich等溫線可以描述大多數(shù)抗生素、類固醇、的類激素等在溶液中的吸附過程。

C)^Langmuirtype

1+，

當(dāng)吸附劑對(duì)溶質(zhì)的吸附作用非常大時(shí)，這時(shí)存在3<0.1,或用前式表達(dá)Kb非常大，這時(shí)游離的溶質(zhì)濃度

對(duì)吸附濃度影響極小，接近不可逆吸附。

D)、Rectangletype

如在固定化單克隆抗體的免疫親和吸附中，一般存在B<0.1。

1.塔板理論(platetheory)

塔板理論的假設(shè)：

(1)在每一個(gè)平衡過程間隔內(nèi).平衡可以迅速達(dá)成；

(2)將載氣看作成脈動(dòng)(間歇)過程；

(3)試樣沿色譜柱方向的擴(kuò)散可忽略；

(4)每次分派的分派系數(shù)相同，

n稱為理論塔板數(shù)(iheoreticalplalenumber)。與精播塔同樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)n的增長而增長，隨

塔板高H的增大而減小。

n=L/H

n與半峰寬及峰底的關(guān)系式為：

?式中U?（或Y1/2）應(yīng)采用同一單位（時(shí)間或距離）。上式示：在IR一定期，假如色譜峰越窄，則說明n越

大,H越小，柱效能越高。

在實(shí)際工作中，按上式計(jì)算出來的n和H值有時(shí)并不能充足地反映色譜柱的分離效能，由于采用IR計(jì)算時(shí),

沒有扣除死時(shí)間tM,所以，常用有效塔板數(shù)n有效表達(dá)柱效：

%=U%

有效塔板高為:

例2已知一根1米長的色譜柱的有效塔板數(shù)為1600塊，組份A在該柱上的調(diào)整保存時(shí)間為100秒，試求

A峰的半峰寬及有效塔塔板高度。

解圖卜"偌=1°°儒=5%器

塔板理論的特點(diǎn)和局限性

（1）當(dāng)色譜柱長度一定期，塔板數(shù)n越大（塔板高度H越?。?，被測(cè)組分在柱內(nèi)被分派的次數(shù)越多，柱效能

則越高，所得色譜峰越窄。

（2）不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分派系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)

指明測(cè)定物質(zhì)。

?（3）柱效不能表達(dá)被分離組分的實(shí)際分離效果，當(dāng)兩組分的分派系數(shù)K相同時(shí)，無論該色譜柱的塔板數(shù)

多大，都無法分離。

?（4）塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的載氣（流動(dòng)相）流速下柱效不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也無法指出影響

柱效的因素及提高柱效的途徑。

?速率方程（也稱范.弟姆特力程式）…影響杜效的因素

他們吸取了塔板理論中塔板高的概念，并同時(shí)考慮影響塔板高的動(dòng)力學(xué)因素，指出：譜峰擴(kuò)寬受三個(gè)動(dòng)力

學(xué)因素的控制，即渦流擴(kuò)散，分子擴(kuò)散項(xiàng)，傳質(zhì)阻力項(xiàng)。這樣，二述塔板高方程表達(dá)

H=A+B/u+Cu

H:理論塔板高度,

a：載氣的線速度3川$）

?、一渦流擴(kuò)散項(xiàng)

A=2人dp

dp:固定相的平均顆粒直徑

心固定相的填充不均勻因子

?固定相顆粒越小dpi,填充的越均勻,AI,HI,柱效nt。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象

減輕，色譜峰較窄。

?B/。一分子擴(kuò)散項(xiàng)

B=2vDg

y：浮曲因子,填充柱色譜,v<io

Dg:試樣組分分子在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)(cm2?$-/)

(1)存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散；

(2)擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬,Ht(nI),分離變差；

13)分子擴(kuò)散項(xiàng)與流速有關(guān)，流速I,滯留時(shí)間t,擴(kuò)散t;

?(4)擴(kuò)散系數(shù)：Dga(M載氣)-1/2；M載氣f,B值I。

?Cu一傳質(zhì)阻力項(xiàng)

傳質(zhì)阻力涉及氣相傳質(zhì)阻力Cg和液相傳質(zhì)阻力CL即：

C=(Cg+CL)

我氣流速高時(shí)：

傳質(zhì)阻力項(xiàng)是影響柱效的重要因素，流速，柱效。

我氣流速低時(shí)：

?分子擴(kuò)散項(xiàng)成為影響柱效的重要因素，流速，柱效。

?速率理論的要點(diǎn)

I)組分分子在柱內(nèi)運(yùn)營的多途徑與渦流擴(kuò)散、濃度梯度所導(dǎo)致的分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力使氣液兩相間的分派

平衡不能瞬間達(dá)成等因素是導(dǎo)致色譜峰擴(kuò)展柱效卜降的重要因素。

(2)通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。

(3)速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對(duì)柱效及分離的影響。

(4)各種因素互相制約，如載氣流速增大，分了?擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小，使柱效提高，但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影響

增大，又使柱效下降；柱溫升高，有助于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴(kuò)散的影響，選擇最佳條件，才干使柱效達(dá)

成最高。

分離度也稱分辨度。它是指相鄰兩色譜保存值之差與兩峰底寬平均值之比，即

n

一般來說，當(dāng)Rsv1時(shí)，兩峰總有部分重疊；當(dāng)Rs=1時(shí)，兩峰能明顯分離；Rs>1.5時(shí)，兩峰才干完全分

離，當(dāng)然，更大的Rs值，分度效果會(huì)更好，但會(huì)延長分析時(shí)間。

運(yùn)用上式，可以直接從色譜圖上計(jì)算分離度。但該式?jīng)]有體現(xiàn)影響分離度的諸因素。而下式清楚地指出了,

分離度受柱效<1、選擇性a和容量因子k三個(gè)參數(shù)的控制：

R=應(yīng)"1力_

4a1+品

意義：

第一，增長塔板數(shù)，可以增長分離度，若通過增長柱長來增長塔板數(shù)，就會(huì)延長分析時(shí)間。所以，設(shè)法減少

塔板高H,才是增大分離度的最佳方法。

第二，加大容量因子可以增長分離度，但是會(huì)延長分析時(shí)間，至導(dǎo)致譜帶檢測(cè)困難.一般來說，當(dāng)k,10時(shí),

分離度的提高并不明顯；而當(dāng)k<2時(shí)，洗脫時(shí)間會(huì)出現(xiàn)極小值。因此，在色譜分離中，通常將k控制在2

7之間。

第三，選擇性參數(shù)的微小增大，都會(huì)使分離度得到較大的改善。當(dāng)>2時(shí)，即使在很短的時(shí)間內(nèi)，組份

也會(huì)完全分離。當(dāng)1時(shí)，要完畢分離，必須增長柱長，延長分析時(shí)間。例如，為了達(dá)成同樣的分離度,

當(dāng)=1.01時(shí)，所需的時(shí)間是=1.1時(shí)的84倍。顯然，當(dāng)=1時(shí)，無論如何提高柱效，加大容量因子

等.Rs均為零。在這種情況下，兩組份的分離是不也許的。

液相色譜

?凝膠色譜

?排阻極限(exclusionlimit)

凝膠過濾介質(zhì)的排阻極限是指不能擴(kuò)散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對(duì)分子質(zhì)量。

例如SephadexG50的排阻極限是30kD,即相對(duì)分子質(zhì)量大于該數(shù)值的分子不能送入到凝膠網(wǎng)

絡(luò)中，其洗脫體積為V0。

sephadex葡聚糖凝膠G-25（50,75,100,100）的粒度的選擇：

?組別分離時(shí)，選用孔徑小的顆粒，雖然分辯率低，但由于組分的Kd值差異大，也能得到較好的分離。

?分級(jí)分離時(shí)，以孔徑大的凝膠為主，并且規(guī)定顆粒大小均勻，以保證較高的分辯率。

?分子篩操作中的注意點(diǎn)

-上樣體積要足夠的小（一般為整個(gè)柱體積的1%?5%）,樣品中可以具有一定的鹽成分（一脫鹽

柱），柱子要有合適的長度。

■洗脫一般為無梯度的洗脫。

?針對(duì)分離的目的和樣品的特性要選用不同特性的色譜柱（各個(gè)廠家會(huì)有說明其合用的分子量范圍）,

以達(dá)成最佳的分離效果。

?分子篩也常用來測(cè)定蛋白的亞基裝配方式及全分子量的測(cè)定。

缺陷優(yōu)點(diǎn)

操作簡便選擇性低，料液解決量低

回收率高產(chǎn)品被稀釋

分離條件溫和②脫鹽

應(yīng)用廣泛合用十生物大分子的初級(jí)分離，脫鹽生物大分子溶液的脫鹽，以及

應(yīng)用廣泛合用于生物大分子的初級(jí)分離，脫鹽除去其中的低相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)。

樹指類：

Sephadex:交聯(lián)葡聚糖

Sepharose:瓊脂糖凝膠

BioGelA;BioGelP:聚丙烯醋胺凝膠分子篩

Sephacryl:JIJN,N-亞甲雙丙烯酰胺交聯(lián)的葡聚糖凝膠

離子互換色譜（1EC）

定義：運(yùn)用離子互換劑為固定相，根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子互換劑之間靜電互相作用力的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離的

洗脫色譜法。荷電溶質(zhì)在離子互換劑上的分派系數(shù)：

m(I)=A/IB+m0°

I:流動(dòng)相的離子強(qiáng)度;

m-：為離子強(qiáng)度無限大時(shí)溶質(zhì)的分派系數(shù)，是靜電互相作用以外的非特異性吸附引起的溶質(zhì)在離子

互換劑上的分派；

常數(shù)A和B為pH的函數(shù)：

?B:溶質(zhì)的靜電荷數(shù)與離子互換基的離子價(jià)數(shù)之比。蛋白質(zhì)為多價(jià)電解質(zhì)，在pH偏離等電點(diǎn)的溶液中

停電荷數(shù)常為兩位數(shù)以上，故B值比較大。

IEC操作很少采用恒定洗脫法，而多采用線性梯度洗脫法、逐次洗脫法。

離子取代順序

電荷高者

離子大者

(largerion)?

濃度大者會(huì)以垓＞

(higherconcentration)/

1.離子互換層析的基本環(huán)節(jié)：平衡、上樣吸附、洗脫、再生

2.層析柱平衡

緩沖液的用量至少為柱體積的2倍

平衡緩沖液的流速可略高于正常操作流速

平衡終點(diǎn)以流出液的離子濃度、導(dǎo)電性、pH值與緩沖液一致為準(zhǔn)，其中pH值最重要

3.樣品進(jìn)柱

為了達(dá)成滿意的分離效果，進(jìn)樣量一般為介質(zhì)互換容量的10-20%

?為了避免進(jìn)樣溶液中的離子強(qiáng)度過高，樣品濃度不宜太高

?樣品總量不應(yīng)超過柱的結(jié)合容量，上萍洋積一般元壽券的旗制。

缺陷優(yōu)點(diǎn)

IEC的操作變量遠(yuǎn)多于GFC,影響分解決量大，濃縮，高速；選擇高，所需柱長較短；

離特性的因素非常復(fù)雜。回收率高；離子互換劑種類多，價(jià)格也遠(yuǎn)低于親和吸附劑。

回收率高；離了?互換劑種類多，價(jià)格也遠(yuǎn)低于親和吸附劑。

疏水性互相作用層析（HIC）

?定義：是運(yùn)用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(tuán)（疏水性配基）的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸

附劑之間的弱疏水性互相作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法。

?配基修飾密度過小則疏水性吸附作用局限性，密度過大則洗脫困難。

?疏水性互相作用層析的應(yīng)用及特點(diǎn)

1.互補(bǔ)工具：HIC重要用于蛋白質(zhì)類分離純化，雖然HIC不如IEC的應(yīng)用廣泛，但可以作為IEC的

互補(bǔ)工具。如方法得當(dāng),HIC與IEC的分離效率相稱。

2.與鹽析銜接：由于在高濃度鹽溶液中疏水性較大，因此HIC可直接分離鹽析后的蛋白質(zhì)溶液。

可以通過調(diào)節(jié)疏水性配基鏈長和密度來控制吸附性能的大小，因此可根據(jù)目的產(chǎn)物的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)?/p>

吸附劑。

疏水性吸附的種類多，選擇余地大，價(jià)格與離子互換劑相稱。

反相層析（RPC）

?定義：運(yùn)用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶劑的水溶液為流動(dòng)相，根據(jù)溶質(zhì)極性（疏水性）的

差別進(jìn)行溶質(zhì)分離純化的洗脫層析法。

?前述HIC同樣,RPC中溶質(zhì)乜通過疏水性互相作用分派于固定相表面，但是RPC固定相表面完全被非

極性基團(tuán)所覆蓋，表現(xiàn)強(qiáng)烈的疏水性。因此，必須采用極性有機(jī)溶劑（如甲醉、乙虱等）或其水溶液

進(jìn)行溶質(zhì)的洗脫分離。

?RPC重要用于相對(duì)分子質(zhì)量低于500（）,特別是1000以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化，也可用于

蛋白質(zhì)等生物大分子的分析卻純化。由于反相介質(zhì)表面為強(qiáng)烈疏水性，并且流動(dòng)相為低極性有機(jī)溶劑,

生物活性大分子在RPC分離過程中容易變性失活。所以，以回收生物活性蛋白質(zhì)為目的時(shí)，應(yīng)注意選

用適宜的反相介質(zhì).

?因此RPC多采用減少流動(dòng)相極性（水含量）的線性梯度洗脫法。

分離能力：SEC<HIC-IEC<RPC

1.使樣品變性的趨勢(shì):SEC<IEC~HIC〈RPC

2.液相色譜按分離機(jī)制分為那幾大類？

3.簡述柱層析系統(tǒng)的工藝流程。

4.何謂保存值、分派容量K、分離度？

5.何為理論塔板高度和理論塔板數(shù)？如何計(jì)算？

6.簡述IEC的工作原理？

簡述凝膠色譜的工作原理？

IEC操作很少采用恒定洗脫法，而多采用線性梯度洗脫法(lineargradien【elution逐次洗脫法(stepwise

elution),為什么?

思考題

1.液相色譜按分離機(jī)制分為那幾大類？

2.簡述柱層析系統(tǒng)的工藝流程。

3.何謂保存值、分派容量K、分離度？

4.何為理論塔板高度和理論塔板數(shù)？如何計(jì)算？

5.簡述IEC的工作原理？

簡述凝膠色譜的工作原理？

IEC操作很少采用恒定洗脫法，而多采用線性梯度洗脫法(lineargradientelution)＞逐次洗脫法(stepwise

elution),為什么？

第二章發(fā)酵液預(yù)解決

?發(fā)酵液預(yù)解決目的

1.便于固液分離

黏度大的懸浮液，不宜過游

目的產(chǎn)物在發(fā)酵液中的濃度通常較低

2.成分復(fù)雜，固體粒子可壓縮性人，懸浮物顆粒小，相對(duì)密度與液相相差不人

3.除去部分雜質(zhì)和改變發(fā)酵液的過濾性能

1.發(fā)酵液預(yù)解決的內(nèi)容：

2.發(fā)酵液雜質(zhì)的去除，涉及除去蛋白質(zhì)、無機(jī)離子、色素、熱原、毒性物質(zhì)等；

改善培養(yǎng)液的解決性能.重要是通過減少黏度、調(diào)節(jié)適宜的pH值和溫度、絮凝和凝聚等操作來實(shí)現(xiàn)。

無機(jī)離子的去除

1.高價(jià)無機(jī)離子，如Ca2+、Mg2+、Fe3+等的存在，會(huì)影響離子互換樹脂對(duì)生物活性物質(zhì)的互換容量。

2.鈣離子的去除

?加入草酸，生成草酸鈣，沉淀去除。

?草酸與鎂離子結(jié)合生成草酸鎂，去除Mg2+

?草酸酸化發(fā)酵液，改變其狡體狀態(tài)，有助于目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入液相。

3.在用量大時(shí)，可用其可溶性鹽。

4.反映生成的草酸鈣還能促使蛋白質(zhì)凝固，提高濾液質(zhì)量。

5.鎂離子的去除

?可加入三聚磷酸鈉，形成絡(luò)合物。

?還可用磷酸鹽解決，大大戒少鈣和鎂離子。

?3.鐵離子的去除

一股用黃血鹽去除，形成普魯士藍(lán)沉淀。

可溶性蛋白質(zhì)的去除

-雜蛋白的存在，對(duì)分離純化會(huì)產(chǎn)生三種影響

-減少離子互換法和大網(wǎng)格樹脂吸附法的樹脂吸附能力

-在用有機(jī)溶劑或雙水相萃取會(huì)產(chǎn)生乳化現(xiàn)象；

?常規(guī)過濾及膜過濾，會(huì)污染灌膜。

去除方法重要有：鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法、加熱法、有機(jī)溶劑沉淀法、吸附法、其他沉淀法。

鹽析法

水溶性蛋白質(zhì)溶液是親水膠體體系，其分子與水有很大的親和力。

水化層和雙電層是膠體體系穩(wěn)定的必要條件。

離子半徑小而帶電荷較多的陰離子鹽析效果比較好，含高價(jià)離子的鹽比1-1價(jià)型鹽的鹽析效果好。

硫酸錢是使用最普遍的鹽，硫酸鈉和氯化鈉也常用于鹽析。

等電點(diǎn)沉淀法

在等電點(diǎn)狀態(tài)時(shí)，所帶電荷為（）。處在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的靜電排斥力最小，使它失去了

作為膠體體系穩(wěn)定的基本因素;迅速結(jié)合成聚集體，極易沉淀析出。

等電點(diǎn)沉淀一般在低離子強(qiáng)度和pH值約為等電點(diǎn)的條件下進(jìn)行。

等電點(diǎn)沉淀法一般多用于疏水性較大的蛋白質(zhì)。

與鹽析沉淀法相比，等電點(diǎn)沉淀省去了后續(xù)的脫鹽操作。

有機(jī)溶劑沉淀法

?有機(jī)溶劑的加入，使蛋白質(zhì)分子表面荷電基團(tuán)或親水基團(tuán)的水化限度減少，即破壞蛋白質(zhì)膠體的

水化膜，同時(shí)也可減少溶液的介電常數(shù)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的靜電引力增大，產(chǎn)生凝聚和沉淀。

?在低離子強(qiáng)度和等電點(diǎn)附近，較易生成沉淀，所需有機(jī)溶劑用量較少

?蛋白質(zhì)分子量越大，有機(jī)溶劑沉淀越易進(jìn)行，所需有機(jī)溶劑用量越少

由于有機(jī)溶劑易引起目的蛋白變性，沉淀必須在低溫下.進(jìn)行。只合用于解決量較少的情況。

吸附法

-雜蛋白可以被某些吸附劑或沉淀劑吸附除去。

運(yùn)用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用，生成亞鐵第化鋅鉀膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)，應(yīng)用于四環(huán)素類抗生素的生

產(chǎn)中。

發(fā)酵液解決性能的改善

1.減少發(fā)酵液的黏度

?減少液體黏度可提高過濾速率。

?常用方法有加熱法和加水稀釋法。

?2.調(diào)節(jié)pH值

pH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，通過調(diào)節(jié)pH值可改善其過濾特性。

3.絮凝

采用細(xì)胞絮凝技術(shù)，可增大懸浮液中固體粒子的大小，提高其沉降速率，再結(jié)合其他的萌解決方法減少發(fā)

酵液黏度，就能采用普通過濾方法，簡樸有效地實(shí)現(xiàn)固液分離。

絮凝和凝聚的區(qū)別

絮凝是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)的過程，是一種以物

理的集合為主的過程。凝聚是指在中性鹽作用下，由于雙電層排斥電位的減少（或由于微粒所帶電荷被加

入的帶有相反電荷的高價(jià)離子中和），而使膠體體系不穩(wěn)定，微?；ハ囵ぶ谝黄鸬默F(xiàn)象。

細(xì)抱絮凝的種類

按是否添加絮凝劑分為兩類：

（1）自身絮凝

酵母細(xì)胞產(chǎn)生絮凝，由細(xì)胞表面蛋白和酵母細(xì)胞外壁的甘露聚糖結(jié)合所引起。

（2）絮凝劑絮凝：

?從化學(xué)結(jié)構(gòu)看，重要分為三類：高聚物、無機(jī)鹽、有機(jī)溶劑和表面活性劑。

?根據(jù)活性基團(tuán)在水中解離情況，可分為非離子型、陰離子型（含段基）和陽離子型（含胺基）。

?高聚物絮凝劑具有長鏈狀的結(jié)構(gòu)，運(yùn)用長鏈上的活性基團(tuán)，通過靜電引力，形成橋架連接，從而生成

菌團(tuán)沉淀。

微生物絮凝劑：微生物在代謝過程中所分泌的特殊的高分子產(chǎn)物，能使液體中不易沉降的固體顆粒、菌體

細(xì)抱及膠體粒子等凝集沉降。重要成分是多糖、糖蛋白、蛋白質(zhì)和核酸。殼聚糖就是其中一種。

蛋白質(zhì)為主的絮凝劑對(duì)溫度變化敏感，多糖組成的絮凝劑則熱穩(wěn)定好。

絮凝機(jī)理與動(dòng)力學(xué)

絮凝機(jī)理：（1）膠體理論（2）高聚物架橋理論（3）雙電層理論

絮凝動(dòng)力學(xué)

?絮凝初期，顆粒聚并快，此時(shí)攪拌應(yīng)劇烈些：絮凝后期，顆粒聚并速度變慢，攪拌速率應(yīng)減少。

增氏顆粒（細(xì)胞）的濃度，有助于聚并絮凝。

加大攪拌，增長速率梯度，有助于顆粒聚并；但攪拌速率過大時(shí)，剪切力會(huì)導(dǎo)致絮凝體破裂。

絮凝的優(yōu)化

1）影響絮凝效果的因素：

2）絮凝劑濃度：濃度增長有助于架橋充足，但是過多的加量會(huì)引起吸附飽和，絮凝劑爭奪膠粒而使

絮凝團(tuán)的粒徑變小

3）絮凝劑分子量：分子量提高、鏈增長，可使架橋效果明顯，但分子量不能超過一定的限度，由于隨

分子量提高，高分子絮凝劑的水溶性減少，因此，分子量的選擇應(yīng)適當(dāng)。

4）絮凝劑類型：

5）溶液的pH：溶液pH的變化會(huì)影響絮凝劑功能團(tuán)的電離度，從而影響分子鏈的伸展形態(tài)。電離度

增大，鏈節(jié)上相鄰離子基團(tuán)間的電排斥作用，使分子鏈從卷曲狀態(tài)變?yōu)樯煺範(fàn)顟B(tài)，架橋能力提高。

6）攪拌速度和時(shí)間

7）助凝劑

思考題

?為什么要進(jìn)行發(fā)酵液預(yù)解決？解決的目的及內(nèi)容分別是什么？

?發(fā)酵液金屬離子的去除方法分別有哪曲？雜蛋白去除的方法和機(jī)理分別是什么？

?發(fā)酵液解決性能的改善有哪些方法？

?有哪些絮凝劑可以使用？

影響絮凝效果的因素？

第三章固液分離技術(shù)

固液分離的方法

有分離篩、懸浮分離、重力沉降以及離心和過濾等。用于發(fā)酵液固液分離的重要是離心和過濾

-L過漉：運(yùn)用多孔性介質(zhì)（如濾布）截留固液懸浮物中的固體顆粒，從而實(shí)現(xiàn)固液分離的方法。

?深層過濾

?深層過濾所用的過濾介質(zhì)為硅藻土、砂、顆?；钚蕴亢退芰项w粒等，過濾介質(zhì)填充于過濾器內(nèi)形

成過濾層。過濾介質(zhì)起重要作用。合用于固體含量少于lg/L、顆粒直徑在5?100um的懸浮液。

?濾餅過濾

濾餅過濾的過濾介質(zhì)是濾布。懸浮液通過濾布時(shí)，固體顆粒被阻攔形成濾餅，濾餅起重要過濾作用。合用

于固體含量大于lg/L的懸浮液。

按過濾推動(dòng)力的不同，濾餅過濾又分為常壓過濾、加壓過濾和真空過濾三類。

過濾理論

（I）過漉速率：單位時(shí)間內(nèi)通過過濾面積的漉液體積，又稱漉液的透過速率。

（2）濾餅阻力

?發(fā)酵液過濾的謔餅比阻與一般的可壓縮濾餅不同。當(dāng)濾餅中所含固形物濃度達(dá)成一定的界線時(shí)，比

阻會(huì)忽然升高，過濾速率會(huì)迅速下降，甚至不能過濾。

對(duì)于不可壓縮性濾餅，比阻值為常數(shù)。但對(duì)于可壓縮性濾餅濾餅的比阻值是a,是操作壓力差的函數(shù)，隨操

作壓力差的提高而增大的。因此開始過濾時(shí)應(yīng)注意不能不久提高壓差，通常靠液柱的自然壓差進(jìn)料，并應(yīng)

緩慢地逐步地升高壓力。

過濾速率的影響因素

影響過濾速率的因素重要有兩個(gè)：

(1)過程的推動(dòng)力

?真空過濾最大真空度一般在85kPa以下；

?加壓過濾的壓力差一般在500kPa以下。

(2)過濾阻力

?與懸浮液的性質(zhì)有關(guān)，黏度越大越不利于過濾

與過濾介質(zhì)和濾餅的性質(zhì)有關(guān)，濾餅阻力是由菌種和發(fā)酵條件決定。

改善過渡性能的方法

(1)絮凝

(2)加助漉劑：助漉劑是一種不可壓縮的多孔微粒。工業(yè)上常用的助濾劑有硅藻土、纖維素、白土、

炭粒、淀粉等。助濾劑可預(yù)先涂在過濾介質(zhì)表面;厚2mm;也可直接加入發(fā)酵液中，用量約等于懸浮液中固

體含量，濾速最快。助濾劑的種類應(yīng)根據(jù)目的產(chǎn)物、過漉介質(zhì)夾擬定，粒度必須與懸浮液中固體粒子的尺

寸相適應(yīng)。

(3)加入反映劑

?加入不影響目的產(chǎn)物的反映劑；

?反映劑之間能互相或能和發(fā)酵液中的雜質(zhì)反映，生成不溶性沉淀，從而那你呢提高過濾速率。

假如發(fā)酵液中具有不溶性多糖，過濾前最佳用酶將其轉(zhuǎn)化為單糖。

過濾設(shè)備及選擇

常用的過濾發(fā)酵液的設(shè)備重要有板框過濾機(jī)、加壓葉濾機(jī)和鼓式真空過漉機(jī)三類。

膜過濾和微濾

?膜分離是運(yùn)用品有一定選擇透過特性的過濾介質(zhì)進(jìn)行物質(zhì)的分離純化，過程的實(shí)質(zhì)是物質(zhì)通過膜

傳遞速率不同而得以分離，過程近似于篩分。

經(jīng)預(yù)解決的發(fā)酵液為懸浮液，可使用微濾進(jìn)行固液分離

離心原理

依靠慣性離心力的作用而實(shí)現(xiàn)的沉降過程。合用于兩相密度差較小，顆粒粒度較細(xì)，在重力場中的沉降

效率很低的非均相體系。

區(qū)帶離心：可分為差速區(qū)帶離心和平衡區(qū)帶離心。

兩種區(qū)帶離心的共同之處是：離心之前要先用某種低分子量溶液(如蔗糖溶液)調(diào)配好密度梯度，然后將

待解決的料液加在已形成密度梯度的溶液之上，進(jìn)行離心。

平衡區(qū)帶離心與差速區(qū)帶離心的不同之處：其密度梯度比差速區(qū)帶離心的密度梯度大。離心操作后，料液

中的高分子溶質(zhì)在與其自身密度用等的溶劑密度處形成穩(wěn)定的區(qū)帶，區(qū)帶中的溶質(zhì)濃度以該處密度為中心,

呈高斯分布。

思考題

1.固液分離的方法有哪些？其原理分別是什么？

2.生物產(chǎn)業(yè)過濾和離心分離常用的設(shè)備是什么？

3.改善過濾過程的方法有哪些？

第四章細(xì)胞破碎和分離提取技術(shù)

?細(xì)胞破碎技術(shù)：運(yùn)用外力破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)涉及目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)。

a)機(jī)械方法破碎：涉及珠磨法、高壓勻漿法、撞擊破碎法和超聲波法等。

b)優(yōu)點(diǎn)：

c)解決量大，速度快，時(shí)間短，效率高，是工業(yè)規(guī)模細(xì)胞破碎的重要手段。

d)細(xì)胞受到擠壓、剪切和撞擊作用。

機(jī)械攪拌產(chǎn)生熱量，破碎需冷卻。

(1)珠磨法

細(xì)胞懸浮液與極小的研磨劑[如玻璃小珠、石英砂、氧化鋁(cKlmm)]一起高速攪拌，細(xì)胞與研磨

劑之間互相碰撞、剪切，使細(xì)胞達(dá)成某種限度破碎，釋放內(nèi)含物。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡便穩(wěn)定、破碎率可以控制、易放大。特別合用于有大量菌絲體的微生物和一些有質(zhì)地堅(jiān)

硬亞細(xì)胞器的微生物。

(2)高壓勻漿法

運(yùn)用高壓迫使懸浮液通過針形閥，由于忽然減壓和高速?zèng)_撞導(dǎo)致細(xì)胞破裂。在高壓勻漿器中，細(xì)胞經(jīng)歷

了高速導(dǎo)致的剪切、碰撞和從高壓到常壓的突變，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁的破壞，細(xì)胞膜隨之破裂，胞內(nèi)產(chǎn)物

得到釋放。

?優(yōu)點(diǎn)：操作參數(shù)少，且易于穩(wěn)定；操作時(shí)樣品損失量少，合用于酵母和大多數(shù)細(xì)胞。

?對(duì)?于易堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌及一些易損傷勻漿閥、質(zhì)地堅(jiān)硬的亞細(xì)胞器一般不合用。具有包涵體的

基因工程菌也不宜該設(shè)備。

(3)超聲波破碎法

原理：運(yùn)用頻率高于20kHz的超聲波在水中傳播，產(chǎn)生能釋放巨大能量的激化和突發(fā)，即空穴作用。

空穴作用產(chǎn)生的空穴泡由于受到超聲波的沖擊而閉合，從而產(chǎn)生一個(gè)高達(dá)數(shù)百個(gè)大氣壓的沖擊力壓力,

由此引起懸浮細(xì)胞上產(chǎn)生剪切力，使細(xì)胞液體產(chǎn)生流動(dòng)而破碎細(xì)胞。

優(yōu)點(diǎn)：解決少量樣品操作方便，液體損失量少，破碎率高。

缺陷：有效能量運(yùn)用率極低，產(chǎn)生大量的熱，操作需在冰水中進(jìn)行或通入冷卻劑，不易放大，不適于大規(guī)模

操作，實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模破碎常用。

細(xì)抱物理破碎方法

(1)滲透壓沖擊法

?先將細(xì)胞放在高滲介質(zhì)中，達(dá)成平衡后，介質(zhì)被忽然稀釋，或者將細(xì)胞轉(zhuǎn)入低滲溶液中。由于滲透壓的

忽然變化，水迅速通過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，引起細(xì)胞壁和膜膨脹破裂，從而將產(chǎn)物釋放出來。

合用于破碎易破細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先經(jīng)酶解決的細(xì)胞，以及合成受克制而強(qiáng)度減弱的細(xì)胞

(2)冷凍-融化法

通過水結(jié)晶的形成和隨后的融化而使細(xì)胞破碎的方法。

細(xì)抱化學(xué)法破碎

(1)堿解決：

pHll.5-12.5堿解決細(xì)胞20-30min可導(dǎo)致細(xì)胞溶解。

易破壞蛋白的活性，使蛋白失活。

(2)酸熱法

運(yùn)用鹽酸對(duì)細(xì)胞壁中的某些成分(重要是多糖和蛋白)的水解作用，改變其空間結(jié)構(gòu)，使本來結(jié)構(gòu)緊密的

細(xì)抱壁變得疏松，同時(shí)經(jīng)沸水浴解決，導(dǎo)致細(xì)胞膨脹并加速水解，破壞胞壁結(jié)構(gòu)，使得內(nèi)含物釋放。

化學(xué)試劑法

(1)EDTA

EDTA可解決革蘭氏陰性菌(E.coli),對(duì)細(xì)胞的外層膜有破壞作用。解決其它革蘭氏陰性菌，可提高通

透性。

(2盾機(jī)溶劑法

異丙醇解決酵母細(xì)胞釋放超氧化物歧化能。

(3)表面活性劑

表面活性劑或多或少地溶解膜結(jié)構(gòu)中的脂蛋白，使細(xì)胞滲透作用增強(qiáng)。

?生物破碎法：運(yùn)用酶反映分解、破壞細(xì)胞壁上特殊的化學(xué)健而達(dá)成破壁的目的，又稱酶溶法。常用的

溶酶有溶菌酶、蛋白酶、糖昔酶等

溶菌能對(duì)細(xì)菌類細(xì)胞有效，重要是革蘭氏陽性菌

超臨界細(xì)胞破碎技術(shù)

超臨界流體是指溫度和壓力處在臨界條件之上的流體，它具有類似于氣體的低黏度和類似于液體的高密度,

有按好的流動(dòng)性、傳質(zhì)性能和溶解性能。

選擇性釋放目的產(chǎn)物的一般原則

⑴僅破壞或破碎存在R的產(chǎn)物的位置周邊

⑵機(jī)械破碎法和化學(xué)法并用可使操作條件更加溫和，在相同的目的產(chǎn)物釋放率條件卜;減少細(xì)胞的破碎限

度。

思考題

?L珠磨法、高壓勻漿法、超聲波破碎法分別是什么原理？常用什么設(shè)備？

?2.選擇破碎方法的原則？

3.酶溶法的原理是什么？對(duì)細(xì)菌和酵母分別常用什么酶？

革蘭氏陽性菌懸浮液中加入溶菌酶，不久就產(chǎn)生溶壁現(xiàn)象。

但對(duì)于革蘭氏陰性菌，單獨(dú)采用溶菌酶無效果，必須與螯合劑EDTA一起使用。

放線菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽性菌，以肽聚糖為重要成分，所以也能采用溶菌酶。

酵母和真菌由于細(xì)胞壁的組分重要是纖維素、葡聚糖、兒丁質(zhì)等，常用蝸牛睡、纖維素施、多糖瓶等。

植物細(xì)胞壁的重要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。

細(xì)胞破碎后，細(xì)胞碎片的分離是一個(gè)難題，以下為細(xì)胞碎片分離的有效方法。

雙水相分離技術(shù)

因兩種水溶性聚合物的水溶液，或一種水溶性聚合物水溶液與鹽溶液混合時(shí)的不相容性而形成有明顯界面

的兩相系統(tǒng)。

?雙水相萃取的特點(diǎn)：

-具有特殊的物理性質(zhì)：含水量高（75%-90%）,兩相界面張力極低（10-7-10-4mN/in）,相間密度

差低，這有助手保持生物活性和強(qiáng)化相間的物質(zhì)傳遞。

,分相時(shí)間短（5-15min）

?萃取環(huán)境和條件溫和

?生物相容性好，有時(shí)有穩(wěn)定作用

?分派系數(shù)可控，容易放大

?大量雜質(zhì)可以與固體物質(zhì)一起去除

缺陷和局限性

?雙水相系統(tǒng)含較高濃度的水溶性聚合物和鹽.，會(huì)帶到產(chǎn)物中，去除需要輔助解決方法

,成本較高。

選擇性較低，分離純化倍數(shù)低，一般只合用于粗分離

?具體操作：

?萃取：適量的細(xì)胞勻漿液與雙水相體系（一般為PEG/鹽）混合。

上下相的分離：在萃取達(dá)成平衡后，就必須使上下相分離。有兩種方法：重力沉降和離心分離。

多聚物的分離：當(dāng)目的蛋白是分派在PEG富集的上相中（細(xì)胞或細(xì)胞碎片所有分派在下相中，只有目的

產(chǎn)物分派在上相中），相與相分離后，在上相中加入鹽，形成新為雙水相體系，在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)重

新被萃取進(jìn)入鹽相，而大量的PEG得到回收，鹽相中殘余的PEG可用超濾或透析除去。

膨脹床分離技術(shù)

膨脹床吸附技術(shù)（EBA或EB）,亦稱擴(kuò)張床吸附。膨脹床吸附集澄清、濃縮和初步純化于一體的分離純化

技術(shù)，它兼具流化床和填充床吸附的優(yōu)點(diǎn)，既能比較容易地讓固體顆粒通過填料層，又可以填充床的模式

來吸附FI的產(chǎn)物。

膨脹床的操作按順序可分為五個(gè)部分:（1）平衡、（2）吸附、（3）沖洗、（4）洗脫和⑸在位清洗。

泡載分離技術(shù)

?泡載分離又稱為泡沫分離，根據(jù)表面吸附的原理，運(yùn)用通氣鼓泡在液相中形成的氣泡為載體，對(duì)■液

相中的溶質(zhì)或顆粒進(jìn)行分離。待分離物質(zhì)自身具有表面活性（如表面活性劑）

泡沫分離的優(yōu)點(diǎn)：1）特別適合于對(duì)低濃度的產(chǎn)品進(jìn)行分離；2）分辨率高，可濃縮表面活性高的成分；3）

富集率高；4）運(yùn)營成本低；5）操作簡便。

缺陷：表面活性劑難以回收，消耗量大，返混現(xiàn)象影響分離效率，穩(wěn)定性差，濃度難以控制。

思考題

?1.雙水相去除細(xì)胞碎片分離目的產(chǎn)物的原理和一般過程？

?2.膨脹床的概念？膨脹床吸附分離的特點(diǎn)和原理是什么？一般的操作過程？

?3.何謂泡沫分離技術(shù)？其原理是什么？

?4.比較雙水相分離技術(shù)、膨脹床分離技術(shù)和泡沫分離技術(shù)的優(yōu)缺陷。

第六章沉淀和膜分離技術(shù)

沉淀分離技術(shù)（重要涉及有機(jī)溶劑沉淀、鹽析、高聚物沉淀和聚電介質(zhì)沉淀、等電點(diǎn)沉淀等。）

沉淀是指在溶液中加入沉淀劑使溶質(zhì)溶解度減少，形成固相從溶液中析出從而達(dá)成分離的一種技術(shù)。

優(yōu)點(diǎn)：過程簡樸，成本低，原料易得，便于小批量生產(chǎn)，在產(chǎn)物濃度越高的溶液中沉淀越有利，收率越

高

缺陷：過濾困難，對(duì)于復(fù)雜產(chǎn)品體系，分離度不高，產(chǎn)品質(zhì)量較低，需重新精制。

重要涉及有機(jī)溶劑沉淀、鹽析、高聚物沉淀和聚電介質(zhì)沉淀、等電點(diǎn)沉淀等。

沉淀法基本原理就是采用適當(dāng)?shù)拇胧└淖內(nèi)芤旱睦砘瘏?shù)，控制溶液各種成分的溶解度，根據(jù)不同物質(zhì)在

溶劑中溶解度不同而達(dá)成分離的目的。

有機(jī)溶劑沉淀法的原理：有機(jī)溶劑沉淀是指在溶液中加入極性有機(jī)物（如甲醇、乙醇、丙醉等），使溶

質(zhì)從溶液中沉淀析出，達(dá)成分離的目的。

有機(jī)溶劑沉淀法機(jī)理

A減少溶劑介電常數(shù)（介電常數(shù)D有機(jī)vD水），使蛋白質(zhì)或酶分子間靜電引力增大，因互相吸引而

聚

合泣淀。

B破壞水化膜：由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶，它們?cè)谌芙庥谒耐瑫r(shí)從蛋白質(zhì)分子周邊的水化層中

奪走了水分子，破壞水化層，使蛋白質(zhì)沉淀。

C疏水基團(tuán)暴露：有機(jī)溶劑也許破壞蛋白質(zhì)的某種鍵，使疏水集團(tuán)暴漏。

有機(jī)溶劑沉析劑選擇依據(jù)：

水溶性要好、介電常數(shù)要小

致變性作用要?。鬃恚?/p>

毒性要小、揮發(fā)性適中、容易獲取

沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核甘酸最常用的是乙醍。乙醇是最

常用的沉淀劑

有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素

溫度：有機(jī)溶劑沉淀一定要在低溫下進(jìn)行

pH值

樣品濃度：樣品較稀時(shí)，將增長有機(jī)溶劑投入量和損耗；樣品太濃會(huì)增長共沉作用。一般認(rèn)為蛋白質(zhì)

的初濃度以0.5—2%為好，多糖則以1—2%較合適。

中性鹽濃度：較低濃度的中性鹽存在有助于沉淀作用，減少蛋白質(zhì)變性。一般中性鹽濃度以0.01-

0.05mol/L為好，常用的中性鹽為醋酸鈉、醋酸鐵、氯化鈉等

優(yōu)點(diǎn)在于：

I）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)等只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀：

2）沉淀不用脫鹽；

缺陷是：

I）對(duì)具有生物活性的大分子容易引起變性失活，

2）操作規(guī)定在低溫下進(jìn)行。

3）成本高

4）易燃溶劑

鹽析沉淀法

在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)在水溶液中的溶解度減少，產(chǎn)生沉淀的過程。

鹽析法機(jī)理

（1）破壞水化膜：將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，于是蛋白質(zhì)分子周邊的

水化膜層減弱乃至消失，使蛋白質(zhì)分子因熱運(yùn)動(dòng)碰撞聚集。

（2）中和電荷，減少靜電斥力：中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，靜電斥力減少,

導(dǎo)致蛋白溶解度減少，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。

鹽析用鹽的選擇

在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異，一般的規(guī)律為：半徑小的高價(jià)離子的鹽

析作用較強(qiáng)，半徑大的低價(jià)離了?作用較弱

陰離子鹽析效果：

PO43->SO42->CH3C00->Cl->N03->SCN-

陽離子鹽析效果：

NH4+>K+>Na+

陰離子的影響人于陽離子

蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度的關(guān)系

logS=0-KsI

B和Ks的物理意義

B-B代表截距，即當(dāng)崗子強(qiáng)度為零，也就是純水中的假想溶解度的對(duì)數(shù)。與蛋白質(zhì)種類、溫度、pH值有

關(guān)，與鹽無關(guān)：

Ks—鹽析常數(shù)，代表圖中直線的斜率；從一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表白，Ks與溫度和pH無關(guān)，但和蛋白質(zhì)與鹽的種類

有關(guān)。但這種變化不是很大，例如以硫酸鐵作為沉淀劑時(shí)，Ks值對(duì)不同的蛋白質(zhì)來說，其變化不會(huì)超過1

倍，

用鹽析法分離蛋白質(zhì)的二種方法

第一類叫Ks分段鹽析法，在一定PH和溫度下通過改變離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)，（固定pH,溫度，改變鹽濃度），

由于蛋白質(zhì)對(duì)離子強(qiáng)度的變化非常敏感，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，用于初期的粗提液；

第二種叫B分段鹽析法，在一定離子強(qiáng)度下通過改變PH和溫度來實(shí)現(xiàn)，（固定離子強(qiáng)度，改變pH及溫

度），由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，用于后期進(jìn)一步分離純化和結(jié)晶。

鹽析的影響因素

pH值為提高鹽析效率，多將溶液PH值調(diào)到目的蛋白等電點(diǎn)處

溫度在低離子強(qiáng)度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增長而增長。但在高濃度下，蛋白質(zhì)、

酶和多肽類物質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降。（B隨溫度升高減小，熱促失水膜Ks不隨溫度而變）

蛋白質(zhì)濃度，高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量，若蛋白濃度過高，會(huì)發(fā)生嚴(yán)重共沉淀作用，除雜蛋白

的效果會(huì)明顯下降。在低濃度蛋白質(zhì)溶液中鹽析，所用的鹽量較多，共沉淀作用比較少，但回收率會(huì)減少。

鹽析法特點(diǎn)：

I.成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。

2.操作簡樸、安全。

3.不會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，經(jīng)透析去鹽后，能得

到保持生物活性的純化蛋白質(zhì),

4.分離效果不抱負(fù)，通常只是作為初步的分離

純化，還需要結(jié)合其它的純化方法。

鹽析中常用的鹽：硫酸錢、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉

高聚物沉淀（非離子性聚合物（PEG）:是一種水溶性的高分子聚合物）

機(jī)理：這些親水性高分子上有許多可結(jié)合水分子的羥基，加入后結(jié)合自由水分子，破壞蛋白質(zhì)的水化膜。

優(yōu)點(diǎn)：

I.室溫

2.顆粒大，易于收集

3.提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性

4.PEG難回收，成本高

思考題

常用的沉淀方法涉及哪些？

?有機(jī)溶劑沉淀法的原理是什么？

?影響有機(jī)溶劑沉析的重要因素有哪些？

?何謂鹽析？其原理是什么？

?何謂“Ks”分級(jí)鹽析法？何謂“B”分級(jí)鹽析法？

?常用的鹽是什么，影響鹽析的重要因索有哪些？

?百聚物沉淀的原理是什么？常用的高聚物是什么？

第十一章電泳分離技術(shù)

電泳：指帶電顆粒在電場作用下,向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。

電泳技術(shù)：運(yùn)用帶電粒子在電場中移動(dòng)速度不同而達(dá)成分離的技術(shù)稱。

等電聚膠電泳(IFE):分離蛋白質(zhì)

以特殊的兩相電解質(zhì)為載體，在外加電場的作用卜.形成PH梯度場，具有特定等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)在PH梯度場

中形成蛋白質(zhì)區(qū)帶，從而得到蛋白質(zhì)組分。分辨率高，分離效率而，但兩性電解質(zhì)價(jià)格昂貴，只能一次性

使用，成本較高

一、電泳的基本原理

當(dāng)帶電離子以速度v在電場中移動(dòng)時(shí)，受到大小相等、方向相反的電場推動(dòng)力和平動(dòng)摩擦阻力的作

用，

物質(zhì)禽子在電場中差速遷移是電泳分離的基礎(chǔ)。

影響電泳速度的相關(guān)因素

?顆粒性質(zhì)帶電顆粒在電場中泳動(dòng)的速度與帶電顆粒的凈電荷量成正比，與顆粒的半徑成反比。

?電場強(qiáng)度E愈高，帶電顆粒的泳動(dòng)速度愈快。

?溶液性質(zhì)pH偏離分子的等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，解離度愈大，凈電荷愈多，泳動(dòng)速度越快；離子強(qiáng)度加A,

電流加大，泳動(dòng)速度加快;泳動(dòng)速度與溶液黏度成反比。

電滲(P225)是支持物自身所帶的電荷吸附溶液中性質(zhì)相反的離子，在電場中移動(dòng)的結(jié)果。其帶電愈高,

電滲力愈大。當(dāng)顆粒的泳動(dòng)方向與電滲方向一致時(shí)，加快顆粒的泳動(dòng)速度；當(dāng)顆粒的泳動(dòng)方向與電滲方向

相反時(shí)，則減少顆粒的泳動(dòng)速度。

焦耳熱電泳過程中釋放的熱量與電流強(qiáng)度的平方成正比,當(dāng)電場強(qiáng)度或電極緩沖液離子強(qiáng)度增高,

電流強(qiáng)度也增長，不僅減少分辨率(即電泳譜帶的展寬和組分的熱混和)，嚴(yán)重時(shí)甚至燒斷或熔化支持介

質(zhì)，

篩孔在篩孔大的凝膠中溶質(zhì)顆粒的泳動(dòng)速度快。

聚丙烯酰胺凝膠：

分離效果比瓊脂糖好，適宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小「Ikb的DNA片段和DNA序列分析。其裝載的

樣品量大，回收DNA純度高

由丙烯酰胺通過交聯(lián)劑N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

特性：機(jī)械性能，彈性，透明度，黏著度，孔徑大小

兩個(gè)單體總百分濃度：T=(a+b)/mX10(n與總濃度有關(guān)的交聯(lián)百分濃度：C=b/(a+b)X100%

A為丙烯酰胺的質(zhì)量，g：b為N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺質(zhì)量，g；m為水或緩沖溶液的終體積，mL

a:b<10,則凝膠脆，硬，呈乳白色

a:b>100,T=5%,則凝膠呈糊狀

a:b在30左右，凝膠富有彈性、且完全透明

聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑取決于總濃度T,有效孔徑隨T的增長而減少。

當(dāng)1X2.5%,可以篩分相對(duì)分子質(zhì)量為106以上的大分子，T>30%,可以篩分相對(duì)分子質(zhì)量小于2kDa的多

肽,

聚合引發(fā)劑：過硫酸鉉和核黃素等；增速劑：N,N,N',N'-四甲基乙二胺，3-二甲胺乙旗

丙烯酰胺和N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺：對(duì)中樞神經(jīng)有毒

聚丙烯酰胺凝膠電泳Polyacrylamidegelelectrophoresis(PAGE)

一、基本原理

以聚丙烯酰胺凝膠作為支持物的電泳方法。由于其分辨率高，不僅能分離具有各種大分子的混合物，并且

可以研究生物大分子的特性，如電荷、分子量、等電點(diǎn)及分子構(gòu)型(P227)。

緩沖體系的選擇

?PH值的選擇：從理論上來說，聚丙烯酰胺凝膠電泳可在各種PH值中進(jìn)行。但事實(shí)上在過酸或過堿的條

件下將發(fā)生某種水解反映，所以PH值應(yīng)限制在制在間。為保持天然蛋白質(zhì)的生物活性，PH范圍也許更

窄。有三種不連續(xù)系統(tǒng)可選用:高PH值系統(tǒng)(PH9.5,PH8.9);中PH值系統(tǒng)(PH8.0可低PH值系統(tǒng)(PH5.5,

PH4.9,PII3.6)

離了強(qiáng)度的選擇：一般使用較低離子強(qiáng)度，由于此時(shí)導(dǎo)電性低，產(chǎn)熱較少，同時(shí)可被分離的帶點(diǎn)顆粒對(duì)電

流的奉獻(xiàn)最大，從而加快電泳速度。但它必須可以緩沖被分離樣品中帶點(diǎn)顆粒對(duì)凝膠PII值的影響，所以不

可過低，且蛋白質(zhì)在過低的磷脂啜度下凝聚。一般。01-0.Imol/L,最常用0.05mol/L

凝膠濃度選擇

凝狡濃度太大，孔徑小于樣品分子的尺寸，電泳時(shí)蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠，電泳后樣品仍在加樣位置。

?凝膠濃度太小，孔徑太大，樣品中各種蛋白質(zhì)分子均隨緩沖溶液流向前推動(dòng)而不能得以很好地分離

濃縮膠與分離膠：

濃縮膠，又稱堆積膠。凝膠濃度較小，孔徑相對(duì)較大。能把較稀的樣品通過大孔徑凝膠的遷移作用而

使樣品在進(jìn)入分離膠前被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶中

分離膠，又稱電泳膠?？讖捷^小，通過選擇合適的凝膠濃度，使樣品組分得以很好地分離

?兩者重要區(qū)別在于孔徑和PH值，但常使用相同的緩沖系統(tǒng)。前者用PH6.8的Tris-HC1,后者用PH9.0的

Tris-HCL前者凝膠濃度常用4%,后者根據(jù)被分離樣品而定

均一股與梯度膠：

均一膠：整塊凝膠為同一濃度，或分離膠為同一濃度。雖不能給出高分辨率，但灌膠簡便，合用于簡樸組

分的樣品分離

梯度膠：分離膠部分由一定的濃度梯度組成，可以是線性梯度，也可以是指數(shù)梯度。通常從陰極到陽極，

濃度梯度逐漸增大，孔徑變?。帢O電壓相反），運(yùn)用分子篩作用提高分辨率，適合于復(fù)雜樣品的分離

染色方法：蛋白染色：考馬斯亮藍(lán)；銀染色方法（靈敏100倍）

聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)：

①孔徑大小可調(diào)節(jié)，可用于分離多種生物分子.

②機(jī)械強(qiáng)度好、彈性大，電滲低、分辨率高。

?③電泳分離后仍然保持生物活性，可用于生物大分子的制備。

?3.聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑和分子篩效應(yīng)

?凝膠是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介質(zhì)，能防止近流，把擴(kuò)散減到最小，并且能影響大分子

顆粒的移動(dòng)過程。

大分子在凝膠中的分離是受其電荷、大小、和形狀因素的影響。

凝皎的這種用于分離不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸篩分能力，故將此現(xiàn)象稱為分子篩效應(yīng)。

三.不連續(xù)凝膠電泳的分離原理

（一）原理

?系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

?凝膠系統(tǒng)的不連續(xù)性：上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。

?緩沖液離子組成及pH的不連續(xù)性：電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.8的

Tris-HCl緩沖液，而分澳膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。

?電位梯度的不連續(xù)性

在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效

應(yīng)，由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。

?1.濃縮效應(yīng)

?電泳進(jìn)行時(shí)，在快離子后面形成一離子濃度低的區(qū)域，該區(qū)域?yàn)榈碗妼?dǎo)區(qū)。

?電導(dǎo)強(qiáng)度與電導(dǎo)成反比，因此，在低電導(dǎo)區(qū)產(chǎn)生較高的電場強(qiáng)度。

?蛋白質(zhì)和慢離子在快離子后加速移動(dòng)。

?當(dāng)快離子和慢離子移動(dòng)速度相同口、J,在快離子和慢離子之間形成一個(gè)電速移動(dòng)的界面,

樣品蛋白質(zhì)聚集在這個(gè)移動(dòng)界面的附近，濃縮為一個(gè)狹窄的中間層（濃縮300多倍）。

濃縮膠為大孔徑（烯）TV5%,分離膠一般為小孔徑（濃）T>7.5%。樣品在濃凝膠中移動(dòng)快，當(dāng)

進(jìn)入分離膠時(shí)受到較大阻力，移動(dòng)速度減慢。因而，在2層凝膠交界處，由于凝膠孔徑的不連續(xù)性，使樣

品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶，得到濃縮。然后，再依據(jù)分子量大小和電荷性質(zhì)進(jìn)行電泳分離。

2.分子篩效應(yīng)

移動(dòng)界面到達(dá)濃縮膠和分離膠界面時(shí)，凝膠的pH變化明顯，緩沖液中甘氨酸的解離迅速增長，

遷移率超過蛋白質(zhì)分子，隨之高電場強(qiáng)度消失。故蛋白質(zhì)分子在均一的電壓梯度和pH值條件卜通過一定

孔徑的分離膠。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子量和構(gòu)型不同時(shí)，通過度離膠所受到的阻滯限度不同，導(dǎo)致泳動(dòng)率不同，結(jié)

果依據(jù)分子量的大小而分開。

3.電荷效應(yīng)

蛋白質(zhì)所帶電荷不同，泳動(dòng)率也不同，故在同一電場強(qiáng)度中，單位時(shí)間內(nèi)各分子遷移的距離存

在差異。因此，蛋白質(zhì)樣品經(jīng)分離膠電泳后，若樣品組分的分子量相同，則它們將按電荷順序排列，從而

導(dǎo)致分離。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)

?在聚丙烯酰胺凝膠中加入去污劑和還原劑(如SDS),蛋白質(zhì)電泳遷移率重要取決于分子量的大小，

而蛋白質(zhì)的電荷因素可以忽略

?SDS是一種陰離子表面活性劑，可與蛋白質(zhì)分子結(jié)合,形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

?在強(qiáng)還原劑疏基乙醉存在下，能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂,形成蛋白質(zhì)亞基。

?SDS是目前用于測(cè)定蛋白質(zhì)亞基分子量的一種最佳的方法。

一、基本原理(P228)

在蛋白質(zhì)樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，分子被解聚成多肽鏈，它們與SDS充