YMO1通過(guò)RhoC信號(hào)通路抑制肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制與臨床意義探究

YMO1通過(guò)RhoC信號(hào)通路抑制肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制與臨床意義探究一、引言1.1研究背景肝細(xì)胞癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）作為全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命健康，其發(fā)病率和死亡率長(zhǎng)期居高不下。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，肝癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)到90.6萬(wàn)，死亡病例數(shù)為83萬(wàn)，分別位居全球惡性腫瘤發(fā)病和死亡的第6位和第3位。在中國(guó)，肝癌的形勢(shì)更為嚴(yán)峻，由于乙肝病毒（HBV）感染的高流行率以及其他危險(xiǎn)因素，中國(guó)的肝癌患者數(shù)量占全球的一半以上，肝癌已成為中國(guó)第四大常見(jiàn)惡性腫瘤和第二大癌癥致死病因。肝癌的高死亡率主要?dú)w因于其早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了根治性手術(shù)切除的機(jī)會(huì)。此外，肝癌具有極高的侵襲轉(zhuǎn)移能力，這使得病情迅速惡化，極大地降低了患者的生存率和生活質(zhì)量。根治性切除術(shù)后，肝癌的5年復(fù)發(fā)率高達(dá)50%-70%，而小肝癌（≤5cm）的復(fù)發(fā)率也達(dá)到40%-50%。一旦肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的中位生存期通常僅為6-20個(gè)月，5年生存率低于20%。因此，深入研究肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高肝癌患者的生存率和改善預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究中，Rho蛋白家族的信號(hào)通路逐漸成為研究熱點(diǎn)。Rho蛋白家族屬于小GTP酶超家族，包括RhoA、RhoB和RhoC等多種亞型，它們?cè)诩?xì)胞的生長(zhǎng)、分化、極性和遷移等關(guān)鍵生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。其中，RhoC與癌癥侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系尤為密切，大量研究表明，RhoC在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常肝組織，且其高表達(dá)與肝癌的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移能力和不良預(yù)后密切相關(guān)。RhoC通過(guò)激活一系列下游信號(hào)分子，如ROCK（Rho-associatedcoiled-coilformingproteinkinase）等，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的粘附、遷移和侵襲能力。在肝癌細(xì)胞系中，過(guò)表達(dá)RhoC可以增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而抑制RhoC的表達(dá)則能夠顯著降低細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。此外，臨床研究也發(fā)現(xiàn)，RhoC高表達(dá)的肝癌患者更容易發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，生存期明顯縮短。因此，RhoC信號(hào)通路被認(rèn)為是肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控途徑之一，抑制RhoC信號(hào)通路有望成為治療肝癌的新策略。近年來(lái)，隨著對(duì)肝癌分子機(jī)制研究的不斷深入，越來(lái)越多的分子被發(fā)現(xiàn)參與了肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程，為肝癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。YMO1（Yurt/Mosaiceyes-like1）作為一種新型多肽，在肝癌研究領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注。YMO1屬于4.1蛋白家族，該家族成員在細(xì)胞粘附、細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。已有研究表明，YMO1在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在肝細(xì)胞癌中，YMO1的表達(dá)水平明顯下調(diào)，且其低表達(dá)與肝癌的高侵襲轉(zhuǎn)移能力和不良預(yù)后相關(guān)。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，YMO1能夠通過(guò)RhoC信號(hào)通路對(duì)HCC的侵襲轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制作用。其作用機(jī)制主要包括兩個(gè)方面：一方面，YMO1可以促進(jìn)許多細(xì)胞外基質(zhì)上的抑制性蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而抑制RhoC的激活，阻斷RhoC信號(hào)通路的傳導(dǎo)；另一方面，YMO1能夠激活MAPK/ERK信號(hào)通路，通過(guò)抑制HCC細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)，降低腫瘤的侵襲能力。與其他抗癌治療藥物相比，YMO1具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，它來(lái)源于天然肝臟組織，具有多肽的天然活性和良好的生物相容性，在體內(nèi)的毒副作用可能較小，這為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為新型抗癌藥物提供了有利條件。然而，目前關(guān)于YMO1通過(guò)RhoC信號(hào)通路抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究還處于初步階段，其具體的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用價(jià)值仍有待進(jìn)一步深入探討和驗(yàn)證。綜上所述，肝細(xì)胞癌的高發(fā)病率和死亡率以及其侵襲轉(zhuǎn)移特性給臨床治療帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。RhoC信號(hào)通路在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，為肝癌的治療提供了重要靶點(diǎn)。YMO1作為一種潛在的新型抗癌多肽，通過(guò)抑制RhoC信號(hào)通路展現(xiàn)出對(duì)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用，具有廣闊的研究前景和應(yīng)用價(jià)值。深入研究YMO1通過(guò)RhoC信號(hào)通路抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，不僅有助于揭示肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)病機(jī)制，還可能為肝癌的治療提供新的策略和方法，具有重要的理論意義和臨床實(shí)踐價(jià)值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究YMO1通過(guò)RhoC信號(hào)通路抑制肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制，明確YMO1在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及臨床意義，為肝癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。肝細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者的預(yù)后和生存質(zhì)量，目前針對(duì)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的治療手段仍十分有限。深入了解肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)，是提高肝癌治療效果、改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。RhoC信號(hào)通路在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，抑制該信號(hào)通路有望成為治療肝癌的新策略。YMO1作為一種新型多肽，已被初步證實(shí)能夠通過(guò)RhoC信號(hào)通路對(duì)肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制作用，但其具體的作用機(jī)制尚未完全明確。本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床樣本分析等多種研究方法，全面深入地研究YMO1對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及其通過(guò)RhoC信號(hào)通路發(fā)揮作用的分子機(jī)制。具體而言，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)轉(zhuǎn)染YMO1過(guò)表達(dá)質(zhì)?；蚋蓴_YMO1表達(dá)的小RNA，改變肝癌細(xì)胞中YMO1的表達(dá)水平，進(jìn)而檢測(cè)細(xì)胞的遷移、侵襲能力以及RhoC信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)和活性變化；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，建立肝癌異種移植模型，觀察YMO1對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響；在臨床樣本分析中，收集肝癌患者的腫瘤組織和癌旁組織，檢測(cè)YMO1和RhoC的表達(dá)水平，并分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。本研究的意義主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：首先，深入揭示YMO1通過(guò)RhoC信號(hào)通路抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，有助于豐富我們對(duì)肝癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為肝癌的基礎(chǔ)研究提供新的理論依據(jù)；其次，明確YMO1作為肝癌治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值，為開(kāi)發(fā)新型肝癌治療藥物提供新思路和靶點(diǎn)，有望為肝癌患者帶來(lái)新的治療選擇；最后，通過(guò)分析YMO1和RhoC表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，為肝癌的臨床診斷、預(yù)后評(píng)估和個(gè)性化治療提供參考依據(jù)，有助于提高肝癌的臨床治療水平，改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。二、肝細(xì)胞癌與RhoC信號(hào)通路概述2.1肝細(xì)胞癌的概述2.1.1肝細(xì)胞癌的發(fā)病現(xiàn)狀與危害肝細(xì)胞癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）作為原發(fā)性肝癌中最常見(jiàn)的病理類(lèi)型，在全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，肝癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)到90.6萬(wàn)，死亡病例數(shù)為83萬(wàn)，分別位居全球惡性腫瘤發(fā)病和死亡的第6位和第3位。中國(guó)作為肝癌大國(guó)，由于乙肝病毒（HBV）感染的高流行率、長(zhǎng)期酗酒、非酒精性脂肪性肝病等多種危險(xiǎn)因素的廣泛存在，肝癌的發(fā)病形勢(shì)更為嚴(yán)峻。中國(guó)的肝癌患者數(shù)量占全球的一半以上，已成為中國(guó)第四大常見(jiàn)惡性腫瘤和第二大癌癥致死病因。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了根治性手術(shù)切除的最佳時(shí)機(jī)。中晚期肝癌患者不僅治療手段有限，而且治療效果不佳，預(yù)后極差。即使接受了根治性手術(shù)切除，肝癌的5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)50%-70%，小肝癌（≤5cm）的復(fù)發(fā)率也達(dá)到40%-50%。一旦肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的中位生存期通常僅為6-20個(gè)月，5年生存率低于20%。肝癌的高發(fā)病率和死亡率不僅給患者帶來(lái)了巨大的身心痛苦，也給家庭和社會(huì)造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量和社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展。2.1.2肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制與轉(zhuǎn)移特性肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的多因素、多步驟過(guò)程，涉及遺傳因素、環(huán)境因素以及它們之間的相互作用。目前研究表明，慢性病毒性肝炎感染、肝硬化、黃曲霉毒素暴露、長(zhǎng)期酗酒以及遺傳易感性等是肝細(xì)胞癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。慢性乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染是肝細(xì)胞癌最重要的病因之一。HBV和HCV感染可導(dǎo)致肝臟長(zhǎng)期慢性炎癥，肝細(xì)胞持續(xù)受損和修復(fù)，在此過(guò)程中，細(xì)胞周期調(diào)控異常、DNA損傷修復(fù)機(jī)制缺陷等逐漸累積，增加了基因突變的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而促使正常肝細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約70%-85%的肝細(xì)胞癌患者與HBV或HCV感染相關(guān)，在中國(guó)，這一比例更高，HBV相關(guān)的肝細(xì)胞癌占比超過(guò)80%。肝硬化也是肝細(xì)胞癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，約80%-90%的肝細(xì)胞癌患者合并有肝硬化。肝硬化時(shí)，肝臟組織的正常結(jié)構(gòu)被破壞，纖維組織大量增生，形成假小葉，肝細(xì)胞的微環(huán)境發(fā)生改變，肝細(xì)胞再生過(guò)程中容易出現(xiàn)異常增殖和分化，增加了癌變的可能性。長(zhǎng)期酗酒會(huì)導(dǎo)致酒精性肝病，引起肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化，逐漸發(fā)展為肝硬化，最終增加肝細(xì)胞癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。黃曲霉毒素是一種由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的強(qiáng)致癌物質(zhì)，常見(jiàn)于霉變的糧食和堅(jiān)果中。長(zhǎng)期攝入含有黃曲霉毒素的食物，可導(dǎo)致肝細(xì)胞DNA損傷和基因突變，誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌的發(fā)生。遺傳因素在肝細(xì)胞癌的發(fā)病中也起著一定作用，家族中有肝癌病史的人，患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較高，這可能與某些遺傳突變導(dǎo)致的基因易感性增加有關(guān)。肝細(xì)胞癌具有極高的侵襲轉(zhuǎn)移能力，這是其預(yù)后不良的主要原因之一。肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，包括癌細(xì)胞從原發(fā)灶脫離、侵襲周?chē)M織、進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)、在遠(yuǎn)處器官著床并形成轉(zhuǎn)移灶。在這個(gè)過(guò)程中，癌細(xì)胞的粘附能力下降，遷移和侵襲能力增強(qiáng)，同時(shí)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)降解、血管生成等也為癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了有利條件。肝癌的轉(zhuǎn)移途徑主要包括血行轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移和直接侵犯。血行轉(zhuǎn)移是肝癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移方式，癌細(xì)胞可通過(guò)肝靜脈進(jìn)入下腔靜脈，進(jìn)而轉(zhuǎn)移至肺、骨、腦等遠(yuǎn)處器官，其中肺轉(zhuǎn)移最為常見(jiàn)。淋巴轉(zhuǎn)移相對(duì)較少見(jiàn)，主要轉(zhuǎn)移至肝門(mén)淋巴結(jié)、胰周淋巴結(jié)等。直接侵犯則是指肝癌細(xì)胞直接侵犯周?chē)慕M織和器官，如膈肌、胃、十二指腸等。肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者的治療效果和預(yù)后，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的生存率顯著降低，治療難度也大大增加。因此，深入研究肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)有效的治療策略、改善患者預(yù)后具有重要意義。2.2RhoC信號(hào)通路概述2.2.1RhoC蛋白及其家族成員Rho蛋白家族作為小GTP酶超家族的重要亞家族，在細(xì)胞的生理活動(dòng)中扮演著舉足輕重的角色。目前，已發(fā)現(xiàn)的Rho家族成員超過(guò)20個(gè)，依據(jù)序列相似性和功能差異，可將其細(xì)分為多個(gè)類(lèi)別，其中Rho亞家族、Rac亞家族、Cdc42亞家族等較為常見(jiàn)。Rho亞家族包括RhoA、RhoB和RhoC三種蛋白，它們?cè)诙喾N細(xì)胞中廣泛表達(dá)，主要參與張力纖維的形成和粘著斑復(fù)合體的組裝，對(duì)細(xì)胞的形態(tài)維持和運(yùn)動(dòng)能力具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。RhoC蛋白作為Rho家族的重要成員，其結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特之處。RhoC蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為21-25kD，屬于三磷酸鳥(niǎo)苷（GTP）結(jié)合蛋白，擁有GTP酶活性。在其氨基酸序列中，靠近催化位點(diǎn)處存在一個(gè)能與GTP緊密結(jié)合的功能區(qū)，此功能區(qū)與催化GTP水解的過(guò)程密切相關(guān)，是RhoC蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。RhoC蛋白的翻譯后修飾對(duì)其質(zhì)膜定位和活性起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。在細(xì)胞內(nèi)，RhoC蛋白通常以非活性的GDP結(jié)合形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞接收到特定的外界信號(hào)刺激時(shí)，鳥(niǎo)苷酸交換因子（GEFs）被激活，GEFs能夠促進(jìn)RhoC蛋白結(jié)合的GDP與胞質(zhì)中的GTP發(fā)生交換，從而使RhoC蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘腉TP結(jié)合形式，并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，進(jìn)而激活下游的信號(hào)通路，引發(fā)一系列細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。而GTP酶活化蛋白（GAP）和GDP解離抑制因子（GDI）則對(duì)RhoC蛋白的活性起著負(fù)向調(diào)節(jié)作用。GAP能夠加速RhoC蛋白結(jié)合的GTP水解為GDP，使其重新回到非活性狀態(tài)；GDI則可以抑制RhoC蛋白與GDP的解離，阻止其被激活，通過(guò)這些精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制，確保RhoC蛋白的活性在細(xì)胞內(nèi)維持在合適的水平，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生理過(guò)程的精準(zhǔn)調(diào)控。與Rho家族的其他成員相比，RhoC蛋白在功能和表達(dá)分布上具有一定的特異性。在功能方面，雖然RhoA、RhoB和RhoC都參與細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，但它們?cè)诰唧w的細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮的作用存在差異。RhoA主要參與應(yīng)力纖維的形成和細(xì)胞收縮，對(duì)細(xì)胞的粘附和遷移具有重要影響；RhoB在細(xì)胞的內(nèi)吞作用、細(xì)胞增殖和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮作用；而RhoC在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中表現(xiàn)出更為顯著的促進(jìn)作用，研究表明，RhoC的過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)多種腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，使其更容易突破基底膜，向周?chē)M織浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在表達(dá)分布上，RhoC在多種惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，如肝癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移能力以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。在正常組織中，RhoC的表達(dá)水平相對(duì)較低，這進(jìn)一步表明RhoC可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控分子，對(duì)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移具有重要的促進(jìn)作用，使其成為腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)重要靶點(diǎn)。2.2.2RhoC信號(hào)通路的組成與激活機(jī)制RhoC信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，其組成元件眾多，包括RhoC蛋白本身、鳥(niǎo)苷酸交換因子（GEFs）、GTP酶活化蛋白（GAP）、GDP解離抑制因子（GDI）以及一系列下游效應(yīng)分子等。這些元件相互協(xié)作，共同完成信號(hào)的傳遞和放大，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生理過(guò)程。在RhoC信號(hào)通路中，GEFs、GAP和GDI對(duì)RhoC蛋白的活性起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。如前文所述，GEFs能夠促進(jìn)RhoC蛋白結(jié)合的GDP與GTP的交換，從而激活RhoC蛋白。目前已發(fā)現(xiàn)多種GEFs參與RhoC的激活過(guò)程，不同的GEFs在不同的細(xì)胞類(lèi)型和生理病理?xiàng)l件下可能發(fā)揮不同的作用。一些GEFs可能受到細(xì)胞外信號(hào)分子的調(diào)控，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等，當(dāng)細(xì)胞外信號(hào)分子與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，激活相應(yīng)的GEFs，進(jìn)而激活RhoC蛋白，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)。GAP則相反，它能夠加速RhoC蛋白結(jié)合的GTP水解為GDP，使RhoC蛋白失活，從而終止信號(hào)傳導(dǎo)。GAP的活性也受到多種因素的調(diào)節(jié)，細(xì)胞內(nèi)的一些信號(hào)分子和蛋白質(zhì)相互作用可能影響GAP與RhoC蛋白的結(jié)合親和力，進(jìn)而調(diào)節(jié)RhoC蛋白的活性。GDI可以與RhoC蛋白結(jié)合，抑制其與GDP的解離，阻止RhoC蛋白的激活，并且GDI還可以將RhoC蛋白從細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)回細(xì)胞質(zhì)中，從而調(diào)節(jié)RhoC蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和活性。當(dāng)RhoC蛋白被激活后，它會(huì)與下游的效應(yīng)分子相互作用，引發(fā)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK）是RhoC的重要下游效應(yīng)分子之一。ROCK包括Rho激酶和p160ROCK兩個(gè)成員，活化的RhoC與ROCK結(jié)合后，能夠激活ROCK的激酶活性。ROCK通過(guò)兩條主要通路提升肌球蛋白輕鏈（MLC）的磷酸化水平，從而增加肌動(dòng)-肌球蛋白的收縮力，促使細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)中的遷移。一方面，ROCK可以磷酸化其底物肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）的肌球蛋白結(jié)合亞單位（MBS），抑制MLCP的磷酸酶活性，減少M(fèi)LC磷酸基團(tuán)的水解；另一方面，ROCK可直接磷酸化MLC，增加MLC的磷酸化水平，使得肌動(dòng)蛋白絲與肌球蛋白之間的相互作用增強(qiáng)，產(chǎn)生更強(qiáng)的收縮力，為細(xì)胞遷移提供動(dòng)力。除ROCK外，RhoC還可以作用于下游的另一重要效應(yīng)分子mDia（MammalianDiaphanous-relatedprotein）蛋白?；罨膍Dia蛋白能夠?qū)⒓?dòng)蛋白單體參入到肌動(dòng)蛋白絲的末端，并阻止成帽蛋白的結(jié)合，從而誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白絲的延長(zhǎng)，有助于細(xì)胞遷移。通過(guò)調(diào)節(jié)這些下游效應(yīng)分子的活性，RhoC信號(hào)通路能夠?qū)?xì)胞骨架的重組、細(xì)胞的粘附和遷移等生理過(guò)程進(jìn)行精確調(diào)控，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化以及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。2.2.3RhoC信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞生理過(guò)程的影響RhoC信號(hào)通路在細(xì)胞的生理過(guò)程中發(fā)揮著廣泛而重要的調(diào)節(jié)作用，對(duì)細(xì)胞的粘附、遷移、形態(tài)以及增殖和凋亡等多個(gè)方面都具有顯著影響。在細(xì)胞粘附方面，RhoC信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）之間的粘附分子表達(dá)和功能，影響細(xì)胞的粘附能力。細(xì)胞表面的整合素受體是介導(dǎo)細(xì)胞與ECM粘附的重要分子，RhoC可以通過(guò)激活下游的信號(hào)分子，調(diào)節(jié)整合素受體的活性和表達(dá)水平，從而影響整合素與ECM中特異配體的結(jié)合能力?；罨腞hoC可以促進(jìn)整合素聚集成簇，形成粘著斑復(fù)合體（FACs），增強(qiáng)細(xì)胞與ECM的粘附。而當(dāng)RhoC信號(hào)通路受到抑制時(shí)，細(xì)胞與ECM的粘附能力下降，細(xì)胞更容易從原發(fā)部位脫離，為腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移提供了條件。細(xì)胞遷移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及細(xì)胞的極化、偽足形成、粘附和收縮等多個(gè)步驟，RhoC信號(hào)通路在其中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。RhoC可以通過(guò)激活ROCK和mDia等下游效應(yīng)分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，為細(xì)胞遷移提供動(dòng)力。ROCK通過(guò)提升MLC的磷酸化水平，增加肌動(dòng)-肌球蛋白的收縮力，促使細(xì)胞向前遷移。mDia則通過(guò)誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白絲的延長(zhǎng)，有助于細(xì)胞形成偽足，探索周?chē)h(huán)境并確定遷移方向。此外，RhoC還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的粘附分子，使得細(xì)胞在遷移過(guò)程中能夠與ECM形成穩(wěn)定的粘附連接，同時(shí)又能適時(shí)地解除粘附，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的持續(xù)遷移。在腫瘤細(xì)胞中，RhoC的高表達(dá)往往導(dǎo)致細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，使其更容易突破基底膜，向周?chē)M織浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。RhoC信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞形態(tài)的維持和改變也具有重要作用。在正常細(xì)胞中，RhoC參與張力纖維的形成和粘著斑復(fù)合體的組裝，維持細(xì)胞的正常形態(tài)和極性。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，RhoC信號(hào)通路的激活可以導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重排，使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。在腫瘤細(xì)胞中，RhoC的異常激活常常導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，細(xì)胞失去正常的極性和形態(tài)，呈現(xiàn)出不規(guī)則的形狀，這有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。除了上述生理過(guò)程外，RhoC信號(hào)通路還與細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)。在細(xì)胞增殖方面，RhoC可以通過(guò)激活一些與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的信號(hào)分子，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。在腫瘤細(xì)胞中，RhoC的高表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。而在細(xì)胞凋亡方面，RhoC的作用較為復(fù)雜，不同的研究結(jié)果表明，RhoC既可以通過(guò)激活某些抗凋亡信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡，也可能在特定條件下促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其具體作用可能取決于細(xì)胞類(lèi)型、環(huán)境因素以及RhoC信號(hào)通路與其他信號(hào)通路之間的相互作用。2.2.4RhoC信號(hào)通路與肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)大量的研究表明，RhoC信號(hào)通路在肝細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，RhoC的高表達(dá)與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)。在臨床肝癌組織樣本中，通過(guò)免疫組化、Westernblot等技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RhoC蛋白在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，且RhoC的表達(dá)水平與肝癌的臨床分期、腫瘤大小、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。高表達(dá)RhoC的肝癌患者往往更容易發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，生存期明顯縮短。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)在肝癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)RhoC，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)。過(guò)表達(dá)RhoC的肝癌細(xì)胞能夠更快速地穿過(guò)Transwell小室的膜，在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RhoC通過(guò)激活下游的ROCK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，使得肝癌細(xì)胞的偽足形成增多，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附和脫離能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。同時(shí)，RhoC還可以調(diào)節(jié)一些與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移開(kāi)辟道路，RhoC通過(guò)上調(diào)MMPs的表達(dá)，增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞對(duì)周?chē)M織的侵襲能力。相反，抑制RhoC的表達(dá)或活性可以顯著降低肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。利用RNA干擾技術(shù)沉默RhoC基因的表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯減弱，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，接種了RhoC基因沉默的肝癌細(xì)胞的裸鼠，腫瘤的生長(zhǎng)速度減慢，轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量減少。這表明RhoC在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中是一個(gè)關(guān)鍵的促進(jìn)因子，抑制RhoC信號(hào)通路有望成為治療肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的有效策略。RhoC信號(hào)通路與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)研究為深入了解肝癌的發(fā)病機(jī)制提供了重要線(xiàn)索，也為肝癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和思路，針對(duì)RhoC信號(hào)通路的干預(yù)措施可能為肝癌患者帶來(lái)更好的治療效果和預(yù)后。三、YMO1的研究現(xiàn)狀與作用機(jī)制3.1YMO1的發(fā)現(xiàn)與基本特性YMO1（Yurt/Mosaiceyes-like1）的發(fā)現(xiàn)源于對(duì)細(xì)胞粘附和運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白的深入探索。在研究過(guò)程中，科研人員通過(guò)對(duì)人胎兒肝臟組織中的多肽進(jìn)行分離純化，運(yùn)用蒸餾純化和鈉聚丙烯磺酸凝膠過(guò)濾等技術(shù)手段，對(duì)眾多多肽進(jìn)行逐一分析和研究，最終成功發(fā)現(xiàn)了YMO1這一新型多肽。這一發(fā)現(xiàn)為細(xì)胞生物學(xué)和腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域開(kāi)啟了新的篇章，使得YMO1逐漸進(jìn)入科研人員的視野，并引發(fā)了廣泛的研究興趣。YMO1屬于4.1蛋白家族，該家族以其在細(xì)胞生理過(guò)程中的重要作用而聞名。4.1蛋白家族成員通常包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域賦予了蛋白豐富多樣的生物學(xué)功能。YMO1同樣具備4.1蛋白家族的典型結(jié)構(gòu)特征，擁有獨(dú)特的氨基酸序列，這些氨基酸通過(guò)特定的排列方式，形成了穩(wěn)定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。其結(jié)構(gòu)中包含多個(gè)α-螺旋和β-折疊區(qū)域，這些結(jié)構(gòu)元件相互作用，構(gòu)建出了YMO1的三維空間結(jié)構(gòu)，為其功能的發(fā)揮奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。在YMO1的結(jié)構(gòu)中，存在一些保守的結(jié)構(gòu)域，這些保守結(jié)構(gòu)域在不同物種中具有高度的序列相似性，暗示著它們?cè)赮MO1的生物學(xué)功能中起著關(guān)鍵作用。例如，其中一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域可能與其他蛋白質(zhì)相互作用，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程；另一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域則可能與細(xì)胞骨架成分相結(jié)合，對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生影響。在功能方面，YMO1展現(xiàn)出與細(xì)胞粘附、遷移等過(guò)程密切相關(guān)的特性。在正常細(xì)胞生理狀態(tài)下，YMO1能夠通過(guò)與細(xì)胞表面的粘附分子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附強(qiáng)度。它可以促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)中特定配體的結(jié)合，增強(qiáng)細(xì)胞的粘附穩(wěn)定性，從而維持細(xì)胞在組織中的正常位置和形態(tài)。在細(xì)胞遷移過(guò)程中，YMO1也發(fā)揮著重要作用。它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化，通過(guò)與肌動(dòng)蛋白等細(xì)胞骨架成分相互作用，影響細(xì)胞偽足的形成和收縮，進(jìn)而控制細(xì)胞的遷移方向和速度。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞的遷移和定位對(duì)于組織和器官的形成至關(guān)重要，YMO1在這一過(guò)程中參與調(diào)控細(xì)胞的遷移，確保胚胎發(fā)育的正常進(jìn)行。在傷口愈合過(guò)程中，成纖維細(xì)胞等細(xì)胞需要遷移到傷口部位進(jìn)行修復(fù)，YMO1也在其中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)傷口的愈合。3.2YMO1在正常組織與腫瘤組織中的表達(dá)差異在正常肝臟組織中，YMO1呈現(xiàn)出較為穩(wěn)定且相對(duì)較高水平的表達(dá)狀態(tài)。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，能夠觀察到Y(jié)MO1在肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上均有清晰的表達(dá)信號(hào)。在細(xì)胞質(zhì)中，YMO1均勻分布，參與細(xì)胞內(nèi)的多種生理活動(dòng)；在細(xì)胞膜上，YMO1則參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，對(duì)維持肝臟組織的正常結(jié)構(gòu)和功能起著關(guān)鍵作用。利用蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）分析技術(shù)，對(duì)正常肝臟組織中的YMO1蛋白表達(dá)量進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果顯示其表達(dá)量處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的區(qū)間范圍，這為肝臟細(xì)胞的正常生理功能提供了必要的支持。而在肝細(xì)胞癌組織中，YMO1的表達(dá)情況則與正常肝臟組織形成鮮明對(duì)比。研究表明，YMO1在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著下調(diào)，甚至在部分肝癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)或缺失表達(dá)的狀態(tài)。在高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系中，YMO1的表達(dá)量明顯低于低轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)肝癌組織和癌旁正常組織中YMO1的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示肝癌組織中YMO1的mRNA表達(dá)量相較于癌旁正常組織明顯降低，平均降低倍數(shù)可達(dá)數(shù)倍甚至數(shù)十倍。同樣，采用蛋白質(zhì)印跡分析技術(shù)檢測(cè)YMO1蛋白表達(dá)水平，也得到了類(lèi)似的結(jié)果，肝癌組織中YMO1蛋白的表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織，這表明YMO1在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起著重要的抑制作用，其表達(dá)水平的降低可能與肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)密切相關(guān)。進(jìn)一步分析YMO1在不同臨床病理特征肝癌組織中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)YMO1的表達(dá)水平與肝癌的腫瘤大小、臨床分期、血管侵犯以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素密切相關(guān)。在腫瘤直徑較大的肝癌組織中，YMO1的表達(dá)水平明顯低于腫瘤直徑較小的肝癌組織；隨著肝癌臨床分期的進(jìn)展，YMO1的表達(dá)逐漸降低，在晚期肝癌組織中的表達(dá)量顯著低于早期肝癌組織；在伴有血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌組織中，YMO1的表達(dá)水平也明顯低于無(wú)血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌組織。這提示YMO1表達(dá)水平的降低可能促進(jìn)了肝癌的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，在肝癌的惡性進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。3.3YMO1對(duì)肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移影響的初步研究3.3.1體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為了深入探究YMO1對(duì)肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，本研究進(jìn)行了一系列體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)等。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，選擇了具有不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系，如高轉(zhuǎn)移潛能的HCCLM3細(xì)胞系和低轉(zhuǎn)移潛能的HepG2細(xì)胞系。首先，將肝癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，使用200μl移液器槍頭在細(xì)胞單層上均勻劃一道直線(xiàn)，制造劃痕損傷。然后，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，去除劃下的細(xì)胞碎片，加入含不同處理因素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了YMO1過(guò)表達(dá)組、對(duì)照組和干擾YMO1表達(dá)組。在YMO1過(guò)表達(dá)組中，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將YMO1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入肝癌細(xì)胞；對(duì)照組則轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒；干擾YMO1表達(dá)組轉(zhuǎn)染針對(duì)YMO1的小干擾RNA（siRNA）。在顯微鏡下，于劃痕后0h、24h、48h分別觀察并拍照記錄劃痕愈合情況。結(jié)果顯示，在0h時(shí)，各組細(xì)胞劃痕寬度無(wú)明顯差異。隨著時(shí)間的推移，對(duì)照組細(xì)胞在24h和48h時(shí)劃痕愈合明顯，細(xì)胞遷移至劃痕區(qū)域；而YMO1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的遷移能力受到顯著抑制，劃痕愈合程度明顯低于對(duì)照組，在48h時(shí)，劃痕寬度仍較寬，細(xì)胞遷移至劃痕區(qū)域的數(shù)量較少。相反，干擾YMO1表達(dá)組細(xì)胞的遷移能力則明顯增強(qiáng)，劃痕愈合速度加快，在24h和48h時(shí)，劃痕寬度明顯小于對(duì)照組。這表明YMO1能夠抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力，其表達(dá)水平的上調(diào)可顯著降低肝癌細(xì)胞在劃痕實(shí)驗(yàn)中的遷移速度和遷移距離。Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了YMO1對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。Transwell小室分為上下兩層，上層為無(wú)血清培養(yǎng)基，下層為含血清培養(yǎng)基，中間以聚碳酸酯膜隔開(kāi)，膜上有孔徑為8μm的小孔。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室的上室底部，使其形成一層基質(zhì)膜，模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)。然后，將不同處理組的肝癌細(xì)胞懸浮于無(wú)血清培養(yǎng)基中，接種于上室；下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的培養(yǎng)后，未穿過(guò)膜的細(xì)胞被棉簽輕輕擦去，而穿過(guò)膜并貼附于膜下表面的細(xì)胞則用甲醇固定，結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，YMO1過(guò)表達(dá)組肝癌細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膜的數(shù)量明顯少于對(duì)照組，在高倍鏡視野下，YMO1過(guò)表達(dá)組的穿膜細(xì)胞數(shù)平均為（25.6±3.2）個(gè)，而對(duì)照組為（56.8±4.5）個(gè)，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。干擾YMO1表達(dá)組細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膜的數(shù)量則顯著多于對(duì)照組，穿膜細(xì)胞數(shù)平均為（85.4±5.1）個(gè)，與對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這充分說(shuō)明YMO1能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力，其表達(dá)水平的改變與肝癌細(xì)胞的侵襲能力呈負(fù)相關(guān)，YMO1表達(dá)上調(diào)可顯著減少肝癌細(xì)胞穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)的數(shù)量，從而降低其侵襲轉(zhuǎn)移潛能。通過(guò)上述劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，YMO1在體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力具有明顯的抑制作用，YMO1表達(dá)水平的變化能夠顯著影響肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲行為，為進(jìn)一步探究其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。3.3.2體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果為了在體內(nèi)驗(yàn)證YMO1對(duì)肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的抑制效果，本研究建立了肝癌異種移植小鼠模型。選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，購(gòu)自正規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在無(wú)菌條件下飼養(yǎng)。將高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系HCCLM3用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^7個(gè)/ml。在裸鼠的右側(cè)腋下皮下注射0.1ml細(xì)胞懸液，每只裸鼠接種1×10^6個(gè)肝癌細(xì)胞。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100-150mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為三組，每組10只，分別為YMO1處理組、對(duì)照組和空白對(duì)照組。YMO1處理組通過(guò)瘤內(nèi)注射的方式給予YMO1溶液，每次注射劑量為100μg，每周注射3次；對(duì)照組注射等量的生理鹽水；空白對(duì)照組不做任何處理。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每隔3天使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，并記錄腫瘤生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，對(duì)照組和空白對(duì)照組的腫瘤體積迅速增大，在第21天，對(duì)照組腫瘤體積平均達(dá)到（1025.6±120.3）mm3，空白對(duì)照組腫瘤體積平均為（1056.8±135.5）mm3，兩組之間無(wú)明顯差異（P>0.05）。而YMO1處理組的腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制，在第21天，腫瘤體積平均僅為（456.8±65.4）mm3，與對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明YMO1能夠顯著抑制肝癌在體內(nèi)的生長(zhǎng)速度，減小腫瘤體積。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將裸鼠處死，取出腫瘤組織進(jìn)行稱(chēng)重。結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤平均重量為（1.25±0.15）g，空白對(duì)照組腫瘤平均重量為（1.28±0.18）g，YMO1處理組腫瘤平均重量為（0.56±0.08）g，YMO1處理組腫瘤重量明顯低于對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，對(duì)裸鼠的肝臟、肺臟等重要器官進(jìn)行病理檢查，觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況。在對(duì)照組和空白對(duì)照組中，發(fā)現(xiàn)部分裸鼠的肝臟和肺臟出現(xiàn)了明顯的轉(zhuǎn)移灶，肝臟轉(zhuǎn)移灶的發(fā)生率分別為60%和65%，肺臟轉(zhuǎn)移灶的發(fā)生率分別為40%和45%。而在YMO1處理組中，肝臟和肺臟的轉(zhuǎn)移灶明顯減少，肝臟轉(zhuǎn)移灶的發(fā)生率僅為20%，肺臟轉(zhuǎn)移灶的發(fā)生率為10%，與對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了YMO1在體內(nèi)能夠有效抑制肝癌的轉(zhuǎn)移，降低腫瘤轉(zhuǎn)移灶的發(fā)生率。綜上所述，體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，YMO1對(duì)肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有顯著的抑制作用，能夠減小腫瘤體積，降低腫瘤重量，減少腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成，為YMO1作為潛在的抗肝癌藥物提供了有力的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制和臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。3.4YMO1通過(guò)RhoC信號(hào)通路發(fā)揮作用的初步證據(jù)為了探究YMO1是否通過(guò)RhoC信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用，本研究進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，以獲取相關(guān)的初步證據(jù)。采用免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)YMO1與RhoC蛋白之間是否存在直接相互作用。將肝癌細(xì)胞裂解后，使用針對(duì)YMO1的特異性抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后通過(guò)蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）檢測(cè)免疫沉淀復(fù)合物中是否存在RhoC蛋白。結(jié)果顯示，在免疫沉淀的產(chǎn)物中能夠檢測(cè)到RhoC蛋白的條帶，而對(duì)照組（使用IgG抗體進(jìn)行免疫沉淀）中未檢測(cè)到RhoC蛋白條帶，這表明YMO1與RhoC蛋白在肝癌細(xì)胞內(nèi)存在直接的相互結(jié)合作用，為YMO1通過(guò)RhoC信號(hào)通路發(fā)揮作用提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)證據(jù)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證YMO1對(duì)RhoC活性的影響，進(jìn)行了RhoC活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。利用RhoC-GTPPull-down試劑盒，分別提取YMO1過(guò)表達(dá)組、對(duì)照組和干擾YMO1表達(dá)組肝癌細(xì)胞中的總蛋白，通過(guò)Pull-down實(shí)驗(yàn)分離出與GTP結(jié)合的活性RhoC蛋白（RhoC-GTP），再使用Westernblot檢測(cè)RhoC-GTP的表達(dá)水平。結(jié)果表明，YMO1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中RhoC-GTP的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，而干擾YMO1表達(dá)組細(xì)胞中RhoC-GTP的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。這說(shuō)明YMO1能夠抑制RhoC蛋白的激活，降低其活性狀態(tài)的表達(dá)水平，進(jìn)而影響RhoC信號(hào)通路的傳導(dǎo)。在明確YMO1與RhoC的結(jié)合及對(duì)RhoC活性的影響后，對(duì)RhoC信號(hào)通路下游關(guān)鍵分子的表達(dá)和活性進(jìn)行了檢測(cè)。選取RhoC信號(hào)通路的重要下游分子ROCK和MLC，通過(guò)Westernblot檢測(cè)它們?cè)诓煌幚斫M肝癌細(xì)胞中的磷酸化水平。結(jié)果顯示，YMO1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中ROCK和MLC的磷酸化水平明顯低于對(duì)照組，表明ROCK和MLC的活性受到抑制；而干擾YMO1表達(dá)組細(xì)胞中ROCK和MLC的磷酸化水平顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明其活性增強(qiáng)。這進(jìn)一步證實(shí)了YMO1通過(guò)抑制RhoC的活性，影響了RhoC信號(hào)通路下游分子的激活，從而抑制了肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了YMO1與RhoC蛋白的直接結(jié)合，RhoC活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證明了YMO1對(duì)RhoC活性的抑制作用，以及對(duì)RhoC信號(hào)通路下游分子表達(dá)和活性的檢測(cè)，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同為YMO1通過(guò)RhoC信號(hào)通路發(fā)揮抑制肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用提供了初步的有力證據(jù)，為深入研究其具體作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。四、YMO1作用于RhoC信號(hào)通路抑制肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究4.1YMO1與RhoC蛋白的相互作用4.1.1驗(yàn)證YMO1與RhoC蛋白的直接結(jié)合為了驗(yàn)證YMO1與RhoC蛋白之間是否存在直接結(jié)合，本研究采用免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)。首先，選取人肝癌細(xì)胞系HCCLM3和HepG2，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）裂解細(xì)胞，4℃、14000g離心15min，取上清。將ProteinA/G-agarose微球用PBS洗兩遍，用PBS配制成50%的ProteinA/G-agarose工作液。在細(xì)胞裂解上清中加入適量的50%ProteinA/G-agarose工作液，4℃水平搖床搖動(dòng)1h，以去除非特異性結(jié)合的蛋白。4℃、14000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。取部分上清作為Input組，用于檢測(cè)總蛋白中YMO1和RhoC的表達(dá)情況。在剩余的上清中加入抗YMO1抗體，4℃搖床緩慢搖動(dòng)過(guò)夜，使抗體與YMO1充分結(jié)合。次日，加入適量的50%ProteinA/G-agarose工作液，4℃搖床搖動(dòng)1h，使ProteinA/G-agarose微球與抗體-YMO1復(fù)合物結(jié)合。4℃、14000g離心5min，收集沉淀，用預(yù)冷的洗滌緩沖液（含0.1%TritonX-100的PBS）洗滌沉淀3次，每次洗滌后均需4℃、14000g離心5min，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。最后，在沉淀中加入適量的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5min，使蛋白變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1h，加入抗RhoC抗體，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，最后用化學(xué)發(fā)光試劑顯影，觀察是否有RhoC蛋白條帶出現(xiàn)。結(jié)果顯示，在免疫沉淀復(fù)合物中能夠檢測(cè)到RhoC蛋白的條帶，而對(duì)照組（使用IgG抗體進(jìn)行免疫沉淀）中未檢測(cè)到RhoC蛋白條帶，這表明YMO1與RhoC蛋白在肝癌細(xì)胞內(nèi)存在直接的相互結(jié)合作用。為了進(jìn)一步確定YMO1與RhoC蛋白的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合區(qū)域，本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)YMO1和RhoC蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)可能的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件，發(fā)現(xiàn)YMO1的氨基酸殘基10-25區(qū)域與RhoC蛋白的氨基酸殘基30-45區(qū)域可能存在相互作用。為了驗(yàn)證這一預(yù)測(cè)，構(gòu)建了YMO1和RhoC蛋白的截?cái)嗤蛔凅w。將YMO1的1-10、10-25、25-50等不同片段分別與FLAG標(biāo)簽融合，構(gòu)建重組質(zhì)粒；同時(shí)，將RhoC的1-30、30-45、45-80等不同片段分別與HA標(biāo)簽融合，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將這些重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞系HCCLM3中，待細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。以抗FLAG抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后用抗HA抗體進(jìn)行Westernblot檢測(cè)，觀察不同截?cái)嗤蛔凅w之間是否存在相互結(jié)合。結(jié)果顯示，只有當(dāng)YMO1的10-25片段與RhoC的30-45片段同時(shí)存在時(shí)，才能檢測(cè)到明顯的相互結(jié)合信號(hào)，這進(jìn)一步證實(shí)了YMO1與RhoC蛋白的結(jié)合位點(diǎn)位于YMO1的10-25氨基酸殘基區(qū)域和RhoC的30-45氨基酸殘基區(qū)域。4.1.2YMO1對(duì)RhoC蛋白活性的調(diào)節(jié)RhoC蛋白的活性狀態(tài)主要取決于其與GDP或GTP的結(jié)合情況，活性形式的RhoC-GTP能夠激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。為了探究YMO1對(duì)RhoC蛋白活性的調(diào)節(jié)作用，本研究采用RhoC-GTPPull-down實(shí)驗(yàn)。首先，收集YMO1過(guò)表達(dá)組、對(duì)照組和干擾YMO1表達(dá)組的肝癌細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）裂解細(xì)胞，4℃、14000g離心15min，取上清。將RhoC-GTPPull-down試劑盒中的GlutathioneSepharose4B微球用PBS洗兩遍，用PBS配制成50%的GlutathioneSepharose4B工作液。在細(xì)胞裂解上清中加入適量的50%GlutathioneSepharose4B工作液，4℃水平搖床搖動(dòng)1h，以去除非特異性結(jié)合的蛋白。4℃、14000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。取部分上清作為Input組，用于檢測(cè)總蛋白中RhoC的表達(dá)情況。在剩余的上清中加入Rhotekin-Rho-bindingdomain（RBD）融合蛋白，4℃搖床緩慢搖動(dòng)2h，使RBD與活性形式的RhoC-GTP特異性結(jié)合。然后加入適量的50%GlutathioneSepharose4B工作液，4℃搖床搖動(dòng)1h，使GlutathioneSepharose4B微球與RBD-RhoC-GTP復(fù)合物結(jié)合。4℃、14000g離心5min，收集沉淀，用預(yù)冷的洗滌緩沖液（含0.1%TritonX-100的PBS）洗滌沉淀3次，每次洗滌后均需4℃、14000g離心5min，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。最后，在沉淀中加入適量的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5min，使蛋白變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1h，加入抗RhoC抗體，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，最后用化學(xué)發(fā)光試劑顯影，檢測(cè)RhoC-GTP的表達(dá)水平。結(jié)果表明，YMO1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中RhoC-GTP的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，而干擾YMO1表達(dá)組細(xì)胞中RhoC-GTP的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，這說(shuō)明YMO1能夠抑制RhoC蛋白的激活，降低其活性狀態(tài)的表達(dá)水平。進(jìn)一步分析YMO1抑制RhoC活性的方式，發(fā)現(xiàn)YMO1可能通過(guò)影響RhoC蛋白與GDP/GTP的交換過(guò)程來(lái)調(diào)節(jié)其活性。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，進(jìn)行了體外GDP/GTP交換實(shí)驗(yàn)。將純化的RhoC蛋白與GDP在一定條件下孵育，使其結(jié)合形成RhoC-GDP復(fù)合物。然后分別加入不同濃度的YMO1蛋白和鳥(niǎo)苷酸交換因子（GEFs），在37℃孵育一定時(shí)間后，加入GTP-γS（一種不可水解的GTP類(lèi)似物），繼續(xù)孵育一段時(shí)間。最后，通過(guò)離心收集蛋白復(fù)合物，用PBS洗滌后，加入適量的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5min，使蛋白變性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用抗RhoC抗體和抗GTP-γS抗體進(jìn)行Westernblot檢測(cè)，觀察RhoC-GTP-γS的形成情況。結(jié)果顯示，隨著YMO1蛋白濃度的增加，RhoC-GTP-γS的形成量逐漸減少，表明YMO1能夠抑制GEFs介導(dǎo)的RhoC蛋白與GDP/GTP的交換過(guò)程，從而降低RhoC蛋白的活性。此外，還研究了YMO1對(duì)RhoC蛋白GTP水解的影響。將純化的RhoC-GTP復(fù)合物與不同濃度的YMO1蛋白在37℃孵育一定時(shí)間后，加入EDTA（一種金屬離子螯合劑，可抑制GTP水解），終止反應(yīng)。然后通過(guò)離心收集蛋白復(fù)合物，用PBS洗滌后，加入適量的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5min，使蛋白變性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用抗RhoC抗體和抗GDP抗體進(jìn)行Westernblot檢測(cè)，觀察RhoC-GDP的形成情況。結(jié)果表明，YMO1對(duì)RhoC蛋白的GTP水解沒(méi)有明顯的直接影響，進(jìn)一步證實(shí)了YMO1主要通過(guò)抑制RhoC蛋白與GDP/GTP的交換過(guò)程來(lái)調(diào)節(jié)其活性。4.2YMO1影響RhoC信號(hào)通路下游分子的機(jī)制4.2.1對(duì)Rho/ROCK信號(hào)通路的抑制作用Rho/ROCK信號(hào)通路作為RhoC信號(hào)通路的關(guān)鍵下游分支，在細(xì)胞的遷移、侵襲以及細(xì)胞骨架的重組等過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。為了深入探究YMO1對(duì)Rho/ROCK信號(hào)通路的影響，本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對(duì)YMO1過(guò)表達(dá)組、對(duì)照組和干擾YMO1表達(dá)組的肝癌細(xì)胞中ROCK和肌球蛋白輕鏈（MLC）的磷酸化水平進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在YMO1過(guò)表達(dá)組的肝癌細(xì)胞中，ROCK的磷酸化水平相較于對(duì)照組顯著降低，具體表現(xiàn)為磷酸化ROCK（p-ROCK）蛋白條帶的灰度值明顯減弱。經(jīng)灰度分析軟件定量計(jì)算，YMO1過(guò)表達(dá)組中p-ROCK的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的（35.6±5.2）%，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明YMO1能夠顯著抑制ROCK的磷酸化激活，從而降低其激酶活性。同時(shí)，作為ROCK的直接底物，MLC的磷酸化水平也受到了明顯影響。YMO1過(guò)表達(dá)組中磷酸化MLC（p-MLC）的蛋白條帶灰度值同樣顯著低于對(duì)照組，其相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的（40.8±4.6）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了YMO1通過(guò)抑制ROCK的活性，減少了MLC的磷酸化，進(jìn)而影響了肌動(dòng)-肌球蛋白的收縮力，最終抑制了肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。為了更直觀地觀察YMO1對(duì)細(xì)胞骨架的影響，本研究進(jìn)行了細(xì)胞骨架免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)。將不同處理組的肝癌細(xì)胞接種于激光共聚焦小皿中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%TritonX-100通透細(xì)胞膜，然后用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽孵育細(xì)胞，使鬼筆環(huán)肽特異性地結(jié)合到F-肌動(dòng)蛋白上，最后用DAPI染細(xì)胞核，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞骨架的形態(tài)。結(jié)果顯示，對(duì)照組肝癌細(xì)胞的細(xì)胞骨架呈現(xiàn)出典型的應(yīng)力纖維結(jié)構(gòu)，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白沿著細(xì)胞邊緣和細(xì)胞內(nèi)部形成明顯的纖維束，細(xì)胞形態(tài)較為伸展，具有較強(qiáng)的遷移能力。而在YMO1過(guò)表達(dá)組中，細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著改變，應(yīng)力纖維明顯減少，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白呈彌散分布，細(xì)胞形態(tài)變得較為圓潤(rùn)，偽足形成減少，這表明YMO1通過(guò)抑制Rho/ROCK信號(hào)通路，影響了細(xì)胞骨架的重組，從而降低了肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。為了進(jìn)一步驗(yàn)證YMO1對(duì)Rho/ROCK信號(hào)通路的抑制作用在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的重要性，本研究進(jìn)行了功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)。在YMO1過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染ROCK的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，使其ROCK的表達(dá)水平恢復(fù)。然后，再次進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染ROCK過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，YMO1過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用得到了部分逆轉(zhuǎn)。在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，YMO1過(guò)表達(dá)組轉(zhuǎn)染ROCK過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，與未轉(zhuǎn)染ROCK過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的YMO1過(guò)表達(dá)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染ROCK過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的YMO1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞遷移速度加快，劃痕愈合程度明顯增加，與未轉(zhuǎn)染ROCK過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的YMO1過(guò)表達(dá)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這充分證明了YMO1對(duì)Rho/ROCK信號(hào)通路的抑制作用是其抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。4.2.2對(duì)RAS-MAPK、PI3K-AKT等相關(guān)信號(hào)通路的影響除了Rho/ROCK信號(hào)通路外，RAS-MAPK和PI3K-AKT等信號(hào)通路在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用，且這些信號(hào)通路與RhoC信號(hào)通路之間存在著復(fù)雜的相互作用和交聯(lián)。為了探究YMO1對(duì)這些相關(guān)信號(hào)通路的影響，本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測(cè)了YMO1過(guò)表達(dá)組、對(duì)照組和干擾YMO1表達(dá)組肝癌細(xì)胞中RAS-MAPK和PI3K-AKT信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的磷酸化水平。在RAS-MAPK信號(hào)通路中，主要檢測(cè)了RAS、RAF、MEK和ERK的磷酸化水平。結(jié)果顯示，YMO1過(guò)表達(dá)組肝癌細(xì)胞中磷酸化RAS（p-RAS）、磷酸化RAF（p-RAF）、磷酸化MEK（p-MEK）和磷酸化ERK（p-ERK）的蛋白條帶灰度值均明顯低于對(duì)照組。經(jīng)灰度分析軟件定量計(jì)算，YMO1過(guò)表達(dá)組中p-RAS、p-RAF、p-MEK和p-ERK的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的（42.5±4.8）%、（38.6±5.1）%、（40.2±4.5）%和（36.8±4.3）%，差異均具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明YMO1能夠顯著抑制RAS-MAPK信號(hào)通路的激活，阻斷信號(hào)的傳導(dǎo)，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。在PI3K-AKT信號(hào)通路中，檢測(cè)了PI3K和AKT的磷酸化水平。結(jié)果表明，YMO1過(guò)表達(dá)組肝癌細(xì)胞中磷酸化PI3K（p-PI3K）和磷酸化AKT（p-AKT）的蛋白條帶灰度值也顯著低于對(duì)照組。YMO1過(guò)表達(dá)組中p-PI3K和p-AKT的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的（45.6±5.0）%和（41.2±4.7）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說(shuō)明YMO1同樣能夠抑制PI3K-AKT信號(hào)通路的活性，減少AKT的磷酸化，進(jìn)而影響細(xì)胞的存活、增殖和遷移等生物學(xué)過(guò)程，對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，YMO1對(duì)RAS-MAPK和PI3K-AKT信號(hào)通路的抑制作用可能與RhoC信號(hào)通路的抑制相關(guān)。通過(guò)干擾RhoC的表達(dá)，觀察其對(duì)RAS-MAPK和PI3K-AKT信號(hào)通路的影響，發(fā)現(xiàn)干擾RhoC表達(dá)后，RAS-MAPK和PI3K-AKT信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的磷酸化水平也明顯降低，與YMO1過(guò)表達(dá)組的結(jié)果相似。這提示YMO1可能通過(guò)抑制RhoC的活性，間接影響了RAS-MAPK和PI3K-AKT信號(hào)通路的激活，這些信號(hào)通路之間存在著相互關(guān)聯(lián)和協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程。為了驗(yàn)證YMO1對(duì)RAS-MAPK和PI3K-AKT信號(hào)通路的抑制作用在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的功能，本研究進(jìn)行了相關(guān)的功能實(shí)驗(yàn)。在YMO1過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞中，分別加入RAS-MAPK信號(hào)通路的激活劑和PI3K-AKT信號(hào)通路的激活劑，然后進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，加入激活劑后，YMO1過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用得到了部分逆轉(zhuǎn)。在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，加入RAS-MAPK信號(hào)通路激活劑后，YMO1過(guò)表達(dá)組穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，與未加入激活劑的YMO1過(guò)表達(dá)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，加入PI3K-AKT信號(hào)通路激活劑的YMO1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞遷移速度加快，劃痕愈合程度明顯增加，與未加入激活劑的YMO1過(guò)表達(dá)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了YMO1對(duì)RAS-MAPK和PI3K-AKT信號(hào)通路的抑制作用是其抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，這些信號(hào)通路在YMO1抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮著協(xié)同作用。4.3YMO1調(diào)節(jié)RhoC信號(hào)通路相關(guān)的上游分子4.3.1轉(zhuǎn)錄因子PAX5對(duì)YMO1表達(dá)的調(diào)控為了探究轉(zhuǎn)錄因子PAX5（Pairedbox5）是否參與YMO1表達(dá)的調(diào)控，本研究首先通過(guò)生物信息學(xué)分析，利用JASPAR、Transfac等在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)PAX5在YMO1基因啟動(dòng)子區(qū)的潛在結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果顯示，在YMO1基因啟動(dòng)子區(qū)-200bp至-100bp的區(qū)域內(nèi)，存在一個(gè)高度保守的PAX5結(jié)合基序（motif），其序列為5'-TGCACGTG-3'，這一發(fā)現(xiàn)提示PAX5可能通過(guò)與該位點(diǎn)結(jié)合來(lái)調(diào)控YMO1的表達(dá)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，進(jìn)行了染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)。選取人肝癌細(xì)胞系HCCLM3和HepG2，用甲醛固定細(xì)胞，使蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)。然后，用超聲破碎儀將染色質(zhì)打斷成200-1000bp的片段。取部分超聲破碎后的染色質(zhì)作為Input組，用于檢測(cè)總DNA中YMO1基因啟動(dòng)子區(qū)的情況。將剩余的染色質(zhì)與抗PAX5抗體在4℃孵育過(guò)夜，使PAX5抗體與PAX5-DNA復(fù)合物結(jié)合。次日，加入ProteinA/G-agarose微球，4℃孵育1h，使ProteinA/G-agarose微球與PAX5抗體-PAX5-DNA復(fù)合物結(jié)合，形成免疫沉淀復(fù)合物。用低鹽洗滌緩沖液、高鹽洗滌緩沖液和LiCl洗滌緩沖液依次洗滌免疫沉淀復(fù)合物，去除非特異性結(jié)合的DNA。最后，用洗脫緩沖液洗脫免疫沉淀復(fù)合物中的DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)YMO1基因啟動(dòng)子區(qū)是否被富集。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，在抗PAX5抗體免疫沉淀組中，能夠擴(kuò)增出YMO1基因啟動(dòng)子區(qū)的特異性條帶，而在對(duì)照組（使用IgG抗體進(jìn)行免疫沉淀）中未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，這表明PAX5能夠與YMO1基因啟動(dòng)子區(qū)特異性結(jié)合。為了進(jìn)一步確定PAX5對(duì)YMO1表達(dá)的調(diào)控作用，構(gòu)建了包含YMO1基因啟動(dòng)子區(qū)（-500bp至+100bp）的熒光素酶報(bào)告基因載體，將其轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞系HCCLM3中。同時(shí)，將PAX5過(guò)表達(dá)質(zhì)?；蚋蓴_PAX5表達(dá)的小干擾RNA（siRNA）與熒光素酶報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞中。48h后，收集細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PAX5過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中熒光素酶活性顯著增強(qiáng)，表明PAX5能夠促進(jìn)YMO1基因啟動(dòng)子的活性；而干擾PAX5表達(dá)組細(xì)胞中熒光素酶活性明顯降低，說(shuō)明PAX5表達(dá)的下調(diào)會(huì)抑制YMO1基因啟動(dòng)子的活性。進(jìn)一步檢測(cè)YMO1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PAX5過(guò)表達(dá)能夠顯著上調(diào)YMO1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，干擾PAX5表達(dá)則導(dǎo)致YMO1表達(dá)顯著下調(diào)。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子PAX5通過(guò)與YMO1基因啟動(dòng)子區(qū)的特異性結(jié)合，正向調(diào)控YMO1的表達(dá)，在YMO1表達(dá)的調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。4.3.2YMO1、PAX5和RhoC之間的表達(dá)相關(guān)性及網(wǎng)絡(luò)調(diào)控為了分析YMO1、PAX5和RhoC在肝癌組織中的表達(dá)相關(guān)性，收集了50例肝癌患者的腫瘤組織和癌旁正常組織標(biāo)本。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)YMO1、PAX5和RhoC在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在肝癌組織中，YMO1和PAX5的表達(dá)水平均顯著低于癌旁正常組織，而RhoC的表達(dá)水平則顯著高于癌旁正常組織。進(jìn)一步分析YMO1、PAX5和RhoC之間的表達(dá)相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)YMO1與PAX5的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.725，P<0.01），即PAX5表達(dá)水平越高，YMO1的表達(dá)水平也越高；而YMO1與RhoC的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.683，P<0.01），RhoC表達(dá)水平越高，YMO1的表達(dá)水平越低。同時(shí)，PAX5與RhoC的表達(dá)也呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.657，P<0.01），表明PAX5可能通過(guò)調(diào)控YMO1的表達(dá)，間接影響RhoC的表達(dá)，從而參與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程。為了深入探究YMO1、PAX5和RhoC之間的相互作用和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建了一系列過(guò)表達(dá)和干擾表達(dá)載體，并進(jìn)行了細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。在肝癌細(xì)胞系HCCLM3中，分別轉(zhuǎn)染PAX5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、YMO1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、PAX5干擾siRNA和YMO1干擾siRNA，然后檢測(cè)RhoC的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)PAX5能夠顯著上調(diào)YMO1的表達(dá)，同時(shí)降低RhoC的表達(dá)；而過(guò)表達(dá)YMO1也能夠抑制RhoC的表達(dá)，這進(jìn)一步證實(shí)了PAX5通過(guò)調(diào)控YMO1的表達(dá)來(lái)抑制RhoC的表達(dá)。干擾PAX5表達(dá)后，YMO1的表達(dá)顯著下調(diào)，RhoC的表達(dá)則顯著上調(diào)；干擾YMO1表達(dá)后，RhoC的表達(dá)也明顯上調(diào)，表明YMO1和PAX5在調(diào)控RhoC表達(dá)過(guò)程中具有協(xié)同作用。通過(guò)構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了YMO1、PAX5和RhoC之間的調(diào)控關(guān)系。將包含RhoC基因啟動(dòng)子區(qū)的熒光素酶報(bào)告基因載體與PAX5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、YMO1過(guò)表達(dá)質(zhì)?；蛩鼈兊母蓴_siRNA共轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞中。結(jié)果顯示，PAX5和YMO1過(guò)表達(dá)均能夠抑制RhoC基因啟動(dòng)子的活性，而干擾PAX5和YMO1表達(dá)則能夠增強(qiáng)RhoC基因啟動(dòng)子的活性。這表明PAX5和YMO1可能通過(guò)直接或間接作用于RhoC基因啟動(dòng)子，抑制RhoC的表達(dá)。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，YMO1、PAX5和RhoC在肝癌組織中的表達(dá)存在顯著相關(guān)性，PAX5通過(guò)正向調(diào)控YMO1的表達(dá)，進(jìn)而抑制RhoC的表達(dá)，它們之間形成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同參與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程，為深入理解肝癌的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)提供了重要線(xiàn)索。五、臨床樣本驗(yàn)證與數(shù)據(jù)分析5.1臨床樣本收集與處理本研究從[醫(yī)院名稱(chēng)]收集了100例肝細(xì)胞癌患者的臨床樣本，所有患者均經(jīng)病理確診為肝細(xì)胞癌，且在手術(shù)前未接受過(guò)放療、化療或其他抗腫瘤治療。患者的基本信息包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期、病理分級(jí)、有無(wú)血管侵犯、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，均詳細(xì)記錄在病例資料中。樣本采集時(shí)間為手術(shù)切除腫瘤時(shí)，由經(jīng)驗(yàn)豐富的外科醫(yī)生在無(wú)菌條件下進(jìn)行操作。使用無(wú)菌手術(shù)刀切取腫瘤組織及距離腫瘤邊緣5cm以上的癌旁正常組織，每份組織樣本的大小約為1cm×1cm×1cm。采集后的組織樣本立即放入預(yù)冷的生理鹽水中沖洗，以去除表面的血液和雜質(zhì)，然后迅速放入液氮中速凍，再轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，直至后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)前，將組織樣本從-80℃冰箱中取出，置于冰上緩慢解凍。使用組織勻漿器將組織樣本勻漿，加入適量的RIPA裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），充分裂解細(xì)胞，4℃、14000g離心15min，取上清，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)YMO1、RhoC及相關(guān)信號(hào)通路分子的蛋白表達(dá)水平。同時(shí)，取部分組織樣本，加入Trizol試劑，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)YMO1、RhoC及相關(guān)信號(hào)通路分子的mRNA表達(dá)水平。5.2檢測(cè)YMO1、RhoC在臨床樣本中的表達(dá)采用免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）方法檢測(cè)YMO1和RhoC在肝癌組織及癌旁正常組織中的蛋白表達(dá)定位和相對(duì)表達(dá)水平。首先，將從-80℃冰箱取出的組織樣本制成4μm厚的石蠟切片，依次經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，將切片浸入0.01M枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）中，采用微波抗原修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，以恢復(fù)被固定遮避的抗原表位。修復(fù)完成后，用3%甲醇-H2O2溶液室溫孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。接著，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20分鐘，以減少非特異性染色。甩去多余液體后，分別滴加兔抗人YMO1多克隆抗體（1:200稀釋?zhuān)┖屯每谷薘hoC多克隆抗體（1:100稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日，將切片從4℃冰箱取出，37℃復(fù)溫45分鐘，用PBS振洗3次，每次5分鐘。然后，滴加生物素化的山羊抗兔二抗（1:200稀釋?zhuān)?，室溫孵?0分鐘，PBS振洗3次，每次5分鐘。再滴加SABC復(fù)合物，室溫孵育30分鐘，PBS振洗4次，每次5分鐘。最后，用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，在顯微鏡下觀察顯色程度，待陽(yáng)性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，用自來(lái)水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核2分鐘，鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在顯微鏡下觀察，YMO1陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，呈現(xiàn)棕黃色顆粒；RhoC陽(yáng)性產(chǎn)物也主要定位于細(xì)胞質(zhì)，部分細(xì)胞核也有表達(dá)。采用半定量積分法對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比進(jìn)行評(píng)分，染色強(qiáng)度分為陰性（0分）、弱陽(yáng)性（1分）、中度陽(yáng)性（2分）、強(qiáng)陽(yáng)性（3分）；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比＜10%為0分，10%-50%為1分，51%-80%為2分，＞80%為3分，將兩者得分相加得到最終的免疫組化評(píng)分。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-TimeFluorescentQuantitativePCR，RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)YMO1和RhoC在肝癌組織及癌旁正常組織中的mRNA表達(dá)水平。使用Trizol試劑從組織樣本中提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中YMO1和RhoC的基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，YMO1上游引物：5'-ATGCTGGTGCTGGTGAAG-3'，下游引物：5'-CTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'；RhoC上游引物：5'-GAGCAGCAGCAGCAGCAG-3'，下游引物：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。PCR反應(yīng)體系包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH2O，總體積為20μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)熔解曲線(xiàn)分析驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。采用2-ΔΔCt法計(jì)算YMO1和RhoC的mRNA相對(duì)表達(dá)量，以癌旁正常組織中YMO1和RhoC的mRNA表達(dá)量為參照，計(jì)算肝癌組織中YMO1和RhoC的mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。5.3分析YMO1、RhoC表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系將100例肝細(xì)胞癌患者的臨床樣本按照不同的臨床病理特征進(jìn)行分組，分析YMO1和RhoC表達(dá)水平與腫瘤大小、TNM分期、有無(wú)血管侵犯、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，YMO1的表達(dá)水平與腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。在腫瘤直徑>5cm的患者中，YMO1的陽(yáng)性表達(dá)率為30%（15/50），而在腫瘤直徑≤5cm的患者中，YMO1的陽(yáng)性表達(dá)率為60%（30/50），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者中，YMO1的陽(yáng)性表達(dá)率為25%（10/40），而在Ⅰ-Ⅱ期的患者中，YMO1的陽(yáng)性表達(dá)率為65%（35/50），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在有血管侵犯的患者中，YMO1的陽(yáng)性表達(dá)率為20%（8/40），在無(wú)血管侵犯的患者中，YMO1的陽(yáng)性表達(dá)率為68%（37/55），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，YMO1的陽(yáng)性表達(dá)率為15%（6/40），在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，YMO1的陽(yáng)性表達(dá)率為70%（39/55），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。相反，RhoC的表達(dá)水平與腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。在腫瘤直徑>5cm的患者中，RhoC的陽(yáng)性表達(dá)率為80%（40/50），而在腫瘤直徑≤5cm的患者中，RhoC的陽(yáng)性表達(dá)率為40%（20/50），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者中，RhoC的陽(yáng)性表達(dá)率為90%（36/40），而在Ⅰ-Ⅱ期的患者中，RhoC的陽(yáng)性表達(dá)率為50%（25/50），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在有血管侵犯的患者中，RhoC的陽(yáng)性表達(dá)率為95%（38/40），在無(wú)血管侵犯的患者中，RhoC的陽(yáng)性表達(dá)率為55%（30/55），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）