SET介導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的體內(nèi)外多維度解析：機(jī)制與治療靶點探索

SET介導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的體內(nèi)外多維度解析：機(jī)制與治療靶點探索一、引言1.1研究背景乳腺癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅女性健康的主要疾病之一，在臨床惡性腫瘤中占據(jù)著極高的發(fā)病率。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬例，超越肺癌成為全球第一大癌，且其發(fā)病率仍呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢。在我國，乳腺癌同樣是女性最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重影響著廣大女性的生命健康和生活質(zhì)量。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個涉及多基因、多信號通路異常的復(fù)雜病理過程，其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移更是成為治療過程中難以攻克的難題，導(dǎo)致患者預(yù)后不佳，生存率降低。盡管目前臨床上針對乳腺癌已經(jīng)有手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療及靶向治療等多種治療手段，但仍無法完全滿足患者的治療需求，且部分患者會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，使得治療效果大打折扣。因此，深入探索乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的治療靶點和治療策略，對于提高乳腺癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有至關(guān)重要的意義。SET蛋白（SET）是一種廣泛存在于多種細(xì)胞中的核蛋白，具有多種生物學(xué)功能，在基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期和凋亡等重要細(xì)胞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。近年來，越來越多的研究表明，SET蛋白在多種腫瘤中呈現(xiàn)出異常高表達(dá)的狀態(tài)，并且與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。在乳腺癌領(lǐng)域，SET蛋白的異常表達(dá)也被發(fā)現(xiàn)與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展緊密相連，其可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性。例如，已有研究報道SET蛋白可以通過調(diào)節(jié)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體的表達(dá)，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞對紫杉醇等化療藥物產(chǎn)生耐藥性，從而影響乳腺癌的化療效果。此外，SET蛋白還可能參與乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等過程，但其具體的作用機(jī)制尚未完全明確。鑒于SET蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用，深入研究SET介導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為，不僅有助于揭示乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，為乳腺癌的早期診斷和預(yù)后評估提供新的生物標(biāo)志物；而且可能為乳腺癌的治療提供新的靶點和治療策略，為開發(fā)更加有效的治療方法奠定基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究SET介導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為，全面剖析SET在乳腺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制，具體而言，研究目的包括以下幾個方面：首先，利用人乳腺癌組織標(biāo)本和公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)（如TCGA、GEO等），精準(zhǔn)分析SET表達(dá)在乳腺癌中的特點，明確其表達(dá)模式與乳腺癌病理特征之間的關(guān)聯(lián)；其次，通過體外細(xì)胞實驗，深入研究SET對人乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，詳細(xì)探討SET在乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)過程中的作用機(jī)制，如SET是否通過調(diào)控某些關(guān)鍵信號通路來影響乳腺癌細(xì)胞的這些惡性行為；最后，通過體內(nèi)實驗，建立小鼠移植瘤模型，進(jìn)一步探究SET對乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，并全面評估SET作為治療靶點的潛力，為后續(xù)的臨床治療提供理論依據(jù)。本研究具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。在理論方面，深入研究SET介導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為，有助于進(jìn)一步揭示乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，填補(bǔ)目前在SET蛋白與乳腺癌關(guān)系研究領(lǐng)域的空白，豐富我們對乳腺癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的認(rèn)識。在實際應(yīng)用方面，本研究的成果可能為乳腺癌的治療和預(yù)防提供新的思路和靶點。如果能夠明確SET在乳腺癌細(xì)胞中的關(guān)鍵作用機(jī)制，那么就有可能開發(fā)出針對SET蛋白的靶向治療藥物，從而為乳腺癌患者提供更加精準(zhǔn)、有效的治療方案。此外，對SET的研究也可能為乳腺癌的早期診斷和預(yù)后評估提供新的生物標(biāo)志物，有助于提高乳腺癌的早期診斷率和患者的生存率。二、SET蛋白與乳腺癌研究基礎(chǔ)2.1SET蛋白結(jié)構(gòu)與功能SET蛋白基因位于人類9號染色體長臂3區(qū)4號帶，共包含2936個堿基。經(jīng)過轉(zhuǎn)錄剪切后，會產(chǎn)生2個異構(gòu)體，即模板活化因子Ⅰα（TAF-Ⅰα）和TAF-Ⅰβ，它們分別編碼290個及277個氨基酸。這兩種異構(gòu)體僅在氨基末端存在差異，而羧基末端完全一致，其共有的酸性尾由53個氨基酸組成，該酸性尾具備抑制乙酰轉(zhuǎn)移酶、裝配核小體、促進(jìn)腺病毒DNA復(fù)制以及參與染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄等作用。從結(jié)構(gòu)域來看，SET蛋白含有一個保守的SET結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域約由130個氨基酸殘基組成，根據(jù)果蠅中位置效應(yīng)花斑（PEV）的抑制子Su（var）3-9、Enhancerofzeste和Trithorax命名。SET結(jié)構(gòu)域由N端和C端形成的兩個不連續(xù)區(qū)域組成，稱作SET-N與SET-C，其N端和C端各自盤曲回旋成不相鄰近的空間構(gòu)象，通過3-4個短的β折疊，一個短螺旋和幾個環(huán)將這些二級結(jié)構(gòu)元件連接起來。在部分含SET結(jié)構(gòu)域的酶中，在SET結(jié)構(gòu)域N端和C端之間還包含一個插入序列SET-I，SET域兩側(cè)富含特定氨基酸序列，這些結(jié)構(gòu)特征共同決定了SET蛋白的獨特空間構(gòu)象，進(jìn)而影響其功能的發(fā)揮。在功能方面，SET蛋白在基因轉(zhuǎn)錄過程中扮演著重要角色。它能夠與染色質(zhì)相互作用，通過對組蛋白修飾酶活性的調(diào)節(jié)，影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄起始、延伸和終止等過程。研究表明，SET蛋白可以通過抑制組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）的活性，減少組蛋白的乙?；?，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加緊密，抑制基因的轉(zhuǎn)錄。相反，在某些情況下，SET蛋白也可能通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄激活，具體作用機(jī)制取決于細(xì)胞所處的環(huán)境和與之相互作用的蛋白。SET蛋白在DNA修復(fù)過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)DNA受到損傷時，如發(fā)生雙鏈斷裂、堿基損傷等，SET蛋白能夠迅速響應(yīng)，招募相關(guān)的DNA修復(fù)蛋白到損傷位點，促進(jìn)DNA修復(fù)過程的順利進(jìn)行。有研究發(fā)現(xiàn)，在紫外線誘導(dǎo)的DNA損傷模型中，SET蛋白可以與DNA損傷修復(fù)蛋白XRCC1相互作用，增強(qiáng)XRCC1在損傷位點的募集，從而加速堿基切除修復(fù)過程，維持基因組的穩(wěn)定性。如果SET蛋白功能缺失或異常，可能導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)障礙，增加基因突變的風(fēng)險，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，SET蛋白還參與細(xì)胞周期的調(diào)控。在細(xì)胞周期的不同階段，SET蛋白的表達(dá)水平和定位會發(fā)生動態(tài)變化，通過與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程。在G1期向S期轉(zhuǎn)換過程中，SET蛋白可以通過調(diào)節(jié)CyclinD1等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)和活性，影響細(xì)胞的增殖能力；在有絲分裂過程中，SET蛋白參與紡錘體的組裝和染色體的分離，確保細(xì)胞分裂的正常進(jìn)行。若SET蛋白在細(xì)胞周期調(diào)控中出現(xiàn)異常，可能導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，使細(xì)胞過度增殖，這是腫瘤發(fā)生的重要特征之一。在細(xì)胞凋亡方面，SET蛋白同樣具有重要的調(diào)節(jié)作用。正常情況下，SET蛋白可以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，維持細(xì)胞的存活。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如化療藥物、射線等作用時，SET蛋白的功能可能發(fā)生改變，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的啟動。具體來說，SET蛋白可以通過與凋亡相關(guān)蛋白，如caspase家族成員相互作用，調(diào)節(jié)凋亡信號通路的傳導(dǎo)。研究顯示，在某些腫瘤細(xì)胞中，下調(diào)SET蛋白的表達(dá)可以增強(qiáng)化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明SET蛋白可能是腫瘤治療中調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的潛在靶點。2.2乳腺癌的現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)近年來，乳腺癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢，已成為嚴(yán)重威脅女性健康的首要惡性腫瘤。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，乳腺癌的新發(fā)病例高達(dá)226萬例，一舉超越肺癌，躍居全球癌癥發(fā)病率首位。在中國，乳腺癌同樣是女性最為常見的惡性腫瘤，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)出年輕化的特點。2024年上半年國家癌癥中心發(fā)布的中國惡性腫瘤疾病負(fù)擔(dān)情況表明，2022年我國乳腺癌新發(fā)病例達(dá)到35.72萬人，每10萬人中發(fā)病51.17例，死亡率為每10萬人中死亡10.86人。隨著生活方式的改變、環(huán)境污染以及人口老齡化等因素的影響，預(yù)計未來乳腺癌的發(fā)病率還將持續(xù)攀升。乳腺癌的死亡率雖在一些發(fā)達(dá)國家通過早期篩查和綜合治療有所下降，但在全球范圍內(nèi)，尤其是發(fā)展中國家，仍然居高不下。在我國，盡管乳腺癌的診療水平不斷提高，但由于早期診斷率較低、患者就診病期較晚以及缺乏規(guī)范化的治療等原因，乳腺癌的死亡率仍然處于較高水平。乳腺癌患者的5年生存率與發(fā)達(dá)國家相比存在一定差距，嚴(yán)重影響了患者的生命健康和生活質(zhì)量。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是乳腺癌治療過程中面臨的兩大難題，也是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。乳腺癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，即使在早期接受了手術(shù)切除等治療，仍有部分患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的情況。研究表明，一至三期乳腺癌十年復(fù)發(fā)率為5.8%，甚至超過十年仍有較高的復(fù)發(fā)可能。不同分子亞型的乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險存在差異，其中三陰性乳腺癌和HER2陽性乳腺癌的復(fù)發(fā)率相對較高，而LuminalA型乳腺癌總體療效較好，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移情況相對較少。一旦乳腺癌發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，治療難度將大大增加，患者的預(yù)后往往較差，5年生存率顯著降低。目前，對于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，缺乏有效的治療手段，常規(guī)的化療、放療、內(nèi)分泌治療及靶向治療等往往難以取得理想的治療效果，且容易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，使得患者陷入“化療再化療，再到無藥可用”的困境。此外，乳腺癌的治療還面臨著諸多挑戰(zhàn)。例如，乳腺癌的異質(zhì)性很強(qiáng)，不同患者的腫瘤細(xì)胞在生物學(xué)行為、分子特征等方面存在很大差異，這使得治療方案的選擇變得更加復(fù)雜，難以實現(xiàn)精準(zhǔn)治療。同時，乳腺癌治療過程中還會出現(xiàn)各種不良反應(yīng)和并發(fā)癥，如化療藥物的毒副作用、放療引起的放射性損傷、內(nèi)分泌治療導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松等，這些不僅會影響患者的治療依從性，還會降低患者的生活質(zhì)量。因此，深入探索乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的治療靶點和治療策略，已成為當(dāng)前乳腺癌研究領(lǐng)域的迫切需求。2.3SET與乳腺癌相關(guān)性研究進(jìn)展近年來，SET與乳腺癌的相關(guān)性研究取得了一定的進(jìn)展，為深入了解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制和治療靶點提供了新的思路。多項研究表明，SET在乳腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與乳腺癌的惡性程度及不良預(yù)后密切相關(guān)。在乳腺癌細(xì)胞增殖方面，研究發(fā)現(xiàn)SET可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。在對人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231的研究中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)SET的表達(dá)能夠顯著增加細(xì)胞的增殖能力，而敲低SET則可抑制細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，SET可能通過與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程。具體來說，SET可以增強(qiáng)CDK2和CDK4的活性，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而加速細(xì)胞的增殖。此外，SET還可以通過調(diào)節(jié)一些轉(zhuǎn)錄因子的活性，如E2F家族成員，影響細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖。在乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面，SET也發(fā)揮著重要的作用。有研究表明，SET的高表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)密切相關(guān)。在乳腺癌細(xì)胞系中，過表達(dá)SET能夠顯著提高細(xì)胞的侵襲和遷移能力，而抑制SET的表達(dá)則可降低細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。研究發(fā)現(xiàn)，SET可能通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程來影響乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，這一過程賦予細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。SET可以通過抑制某些EMT抑制因子的表達(dá)，如E-cadherin，同時上調(diào)EMT促進(jìn)因子的表達(dá)，如N-cadherin、Vimentin等，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，從而增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。此外，SET還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的表達(dá)和活性，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。在乳腺癌的耐藥性方面，SET同樣參與其中。有研究報道，SET可以通過調(diào)節(jié)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體的表達(dá)，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞對紫杉醇等化療藥物產(chǎn)生耐藥性。SET可以上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中P-糖蛋白（P-gp）的表達(dá)，P-gp是一種ATP依賴的外排泵，能夠?qū)⒒熕幬飶募?xì)胞內(nèi)排出，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。此外，SET還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號通路，如PI3K/Akt信號通路，影響乳腺癌細(xì)胞的耐藥性。PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞存活、增殖和耐藥性中發(fā)揮著重要作用，SET可以通過激活PI3K/Akt信號通路，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的抗凋亡能力和耐藥性。SET在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，其與乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥性密切相關(guān)。然而，目前對于SET在乳腺癌中的具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究，這將為乳腺癌的治療提供新的靶點和治療策略。三、SET在乳腺癌中的表達(dá)特征分析3.1基于臨床組織標(biāo)本的SET表達(dá)檢測3.1.1標(biāo)本收集與處理本研究收集了[具體醫(yī)院名稱]在[具體時間段]內(nèi)進(jìn)行手術(shù)切除的乳腺癌組織標(biāo)本[X]例。所有患者在術(shù)前均未接受過化療、放療或內(nèi)分泌治療，以確保標(biāo)本的原始性和研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時，為了進(jìn)行對比分析，還收集了同一患者距離腫瘤邊緣[X]cm以上的癌旁正常乳腺組織標(biāo)本作為對照。在標(biāo)本收集過程中，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行。手術(shù)切除的乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中沖洗，去除血液及其他雜質(zhì)。然后，將組織切成約1cm×1cm×1cm大小的組織塊，一部分組織塊立即放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)的蛋白質(zhì)提取和Westernblot檢測；另一部分組織塊則放入10%中性福爾馬林溶液中固定，固定時間為12-24小時，隨后進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋處理，制成石蠟切片，用于免疫組化檢測。在進(jìn)行石蠟包埋時，確保組織塊的平整放置，以便后續(xù)切片的制作能夠完整地呈現(xiàn)組織形態(tài)。在標(biāo)本處理的每一個環(huán)節(jié)，都詳細(xì)記錄患者的臨床病理信息，包括年齡、腫瘤大小、病理類型、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體2（HER2）的表達(dá)狀態(tài)等，這些信息將為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析提供重要依據(jù)。3.1.2檢測方法選擇與實施免疫組化檢測SET蛋白表達(dá)采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法（SP法）。具體操作步驟如下：首先，將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，在二甲苯中浸泡兩次，每次10分鐘；然后依次經(jīng)過100%、95%、80%、70%的乙醇溶液各浸泡5分鐘，最后用蒸餾水沖洗3次，每次5分鐘。采用高壓熱修復(fù)抗原，將切片置于盛有0.01mol/L枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）的不銹鋼高壓鍋中，蓋上鍋蓋但不鎖定，加熱至沸騰后，將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后鎖定鍋蓋，小閥門升起，10分鐘后除去熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。冷卻后的切片用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。滴加3%H?O?室溫孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20分鐘，甩去多余液體，不洗。滴加一抗（兔抗人SET多克隆抗體，稀釋度為1:200），4℃孵育過夜。次日，將切片從冰箱中取出，恢復(fù)至室溫后，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核2分鐘，鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗10-15分鐘，使細(xì)胞核返藍(lán)。最后，切片依次經(jīng)過梯度酒精脫水（70%、80%、95%、100%乙醇各浸泡5分鐘）、二甲苯透明（兩次，每次10分鐘），中性樹膠封片。Westernblot檢測SET蛋白表達(dá)，首先進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。將凍存的組織塊取出，置于冰上，加入適量的RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑），用組織勻漿器充分勻漿，冰上裂解30分鐘，期間不時振蕩。然后在4℃條件下，12000rpm離心15分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為提取的總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白充分變性。根據(jù)目的蛋白分子量大小，配制合適濃度的SDS-PAGE凝膠（分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%）。將變性后的蛋白樣品上樣，同時加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳時，先在80V電壓下電泳30分鐘，待溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜條件為：恒流300mA，轉(zhuǎn)膜時間1.5小時。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉2小時，以減少非特異性結(jié)合。封閉后的PVDF膜加入一抗（兔抗人SET多克隆抗體，稀釋度為1:1000），4℃孵育過夜。次日，將膜從冰箱中取出，恢復(fù)至室溫后，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。加入二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，稀釋度為1:5000），室溫孵育1小時，TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，在暗室中曝光、顯影、定影，最后用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。3.1.3結(jié)果與分析免疫組化結(jié)果顯示，SET蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核，部分病例中也可見細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。在乳腺癌組織中，SET蛋白呈現(xiàn)出不同程度的陽性表達(dá)，陽性染色強(qiáng)度從淺黃色到棕褐色不等。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，將SET蛋白表達(dá)分為陰性（-）、弱陽性（+）、陽性（++）和強(qiáng)陽性（+++）四個等級。在[X]例乳腺癌組織標(biāo)本中，SET蛋白陰性表達(dá)[X]例（[X]%），弱陽性表達(dá)[X]例（[X]%），陽性表達(dá)[X]例（[X]%），強(qiáng)陽性表達(dá)[X]例（[X]%）；而在癌旁正常乳腺組織中，SET蛋白主要呈陰性或弱陽性表達(dá)，陰性表達(dá)[X]例（[X]%），弱陽性表達(dá)[X]例（[X]%），陽性表達(dá)[X]例（[X]%），強(qiáng)陽性表達(dá)0例（0%）。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，SET蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常乳腺組織（P<0.05）。進(jìn)一步分析SET蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SET蛋白的表達(dá)水平與腫瘤大小、組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在腫瘤直徑大于2cm的乳腺癌組織中，SET蛋白陽性表達(dá)率（[X]%）明顯高于腫瘤直徑小于等于2cm的組織（[X]%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；在組織學(xué)分級為Ⅲ級的乳腺癌組織中，SET蛋白陽性表達(dá)率（[X]%）顯著高于Ⅰ-Ⅱ級的組織（[X]%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中，SET蛋白陽性表達(dá)率（[X]%）明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織（[X]%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。然而，SET蛋白的表達(dá)水平與患者年齡、ER、PR和HER2的表達(dá)狀態(tài)之間未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性（P>0.05）。Westernblot結(jié)果表明，在乳腺癌組織中，SET蛋白的表達(dá)條帶明顯強(qiáng)于癌旁正常乳腺組織。通過ImageJ軟件對條帶灰度值進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參，計算SET蛋白相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，乳腺癌組織中SET蛋白的相對表達(dá)量為[X]±[X]，顯著高于癌旁正常乳腺組織的[X]±[X]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這一結(jié)果與免疫組化檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步證實了SET蛋白在乳腺癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)。綜上所述，基于臨床組織標(biāo)本的檢測結(jié)果表明，SET蛋白在乳腺癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤大小、組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，提示SET蛋白可能在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，有望成為乳腺癌診斷和預(yù)后評估的潛在生物標(biāo)志物。3.2利用公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)的SET表達(dá)分析3.2.1數(shù)據(jù)來源與獲取本研究主要從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫和基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GEO）獲取乳腺癌相關(guān)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。TCGA數(shù)據(jù)庫由美國國家癌癥研究所（NCI）和國家人類基因組研究所（NHGRI）共同發(fā)起，旨在通過大規(guī)模基因組測序和多種組學(xué)數(shù)據(jù)的整合，全面了解癌癥的分子基礎(chǔ)。該數(shù)據(jù)庫包含了來自33種不同類型癌癥的超過11,000個患者樣本的數(shù)據(jù)，其中乳腺癌數(shù)據(jù)涵蓋了基因表達(dá)、基因突變、拷貝數(shù)變異等多層次信息。本研究通過GDC(GenomicDataCommons)數(shù)據(jù)平臺訪問TCGA數(shù)據(jù)庫，GDC是一個集成了TCGA和其他多個癌癥基因組數(shù)據(jù)資源的平臺，提供了友好的用戶界面（GDCDataPortal）、編程訪問接口（GDCAPI）以及命令行工具（GDCDataTransferTool），以滿足不同用戶的數(shù)據(jù)獲取需求。在GDCDataPortal中，通過設(shè)置篩選條件，如疾病類型選擇“乳腺癌（BRCA）”，數(shù)據(jù)類型選擇“RNA測序（RNA-Seq）數(shù)據(jù)”，文件類型選擇“基因表達(dá)定量文件（GeneExpressionQuantification）”，從而精準(zhǔn)下載乳腺癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)及對應(yīng)的臨床信息。GEO數(shù)據(jù)庫是由美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）維護(hù)的一個公共的功能基因組數(shù)據(jù)倉庫，存儲了大量的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和其他類型的高通量基因組數(shù)據(jù)。在GEO數(shù)據(jù)庫中，通過在搜索欄輸入關(guān)鍵詞“breastcancerANDgeneexpression”，并結(jié)合使用過濾器，如限定物種為“人類（Homosapiens）”，數(shù)據(jù)類型為“基因芯片（Microarray）”或“RNA測序（RNA-Seq）”，篩選出符合研究需求的數(shù)據(jù)集。例如，選擇GSE2109數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集的芯片平臺為Affymetrix133plus2.0，包含了乳腺癌組織和正常乳腺組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，可用于后續(xù)分析。在下載數(shù)據(jù)時，根據(jù)數(shù)據(jù)集提供的下載鏈接和說明，獲取原始數(shù)據(jù)文件及相關(guān)的樣本注釋文件，確保數(shù)據(jù)的完整性和準(zhǔn)確性。3.2.2生物信息學(xué)分析方法數(shù)據(jù)預(yù)處理是生物信息學(xué)分析的關(guān)鍵步驟，其目的是提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可靠性。對于從TCGA數(shù)據(jù)庫下載的RNA-Seq數(shù)據(jù)，首先使用FastQC軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估，檢查數(shù)據(jù)的堿基質(zhì)量分布、測序深度、GC含量等指標(biāo)，以判斷數(shù)據(jù)是否存在質(zhì)量問題。對于低質(zhì)量的reads，使用Trimmomatic軟件進(jìn)行修剪，去除接頭序列和低質(zhì)量的堿基，提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。然后，使用STAR軟件將處理后的reads比對到人類參考基因組（如GRCh38）上，生成比對結(jié)果文件（BAM格式）。最后，使用HTSeq軟件對BAM文件進(jìn)行計數(shù)，統(tǒng)計每個基因的表達(dá)量，得到基因表達(dá)矩陣。對于從GEO數(shù)據(jù)庫下載的基因芯片數(shù)據(jù)，根據(jù)不同的芯片平臺，使用相應(yīng)的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理。例如，對于Affymetrix芯片數(shù)據(jù)，使用AffymetrixExpressionConsole軟件進(jìn)行背景校正、歸一化處理，常用的歸一化方法有RMA（RobustMulti-arrayAverage）和MAS5（MicroarraySuite5）等，以消除實驗誤差和批次效應(yīng)，使不同樣本的數(shù)據(jù)具有可比性。差異表達(dá)分析用于識別在乳腺癌組織和正常乳腺組織中表達(dá)存在顯著差異的基因。使用DESeq2軟件對預(yù)處理后的基因表達(dá)矩陣進(jìn)行差異表達(dá)分析，該軟件基于負(fù)二項分布模型，通過對基因表達(dá)計數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計檢驗，計算每個基因的差異表達(dá)倍數(shù)（foldchange）和校正后的P值（adjustedP-value）。將|log2(foldchange)|≥1且adjustedP-value<0.05作為篩選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)，滿足該條件的基因被認(rèn)為在乳腺癌組織和正常乳腺組織中存在顯著差異表達(dá)。功能富集分析用于探究差異表達(dá)基因在生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能等方面的富集情況，以揭示這些基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的潛在作用機(jī)制。使用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）在線工具對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析，該工具整合了多個數(shù)據(jù)庫的注釋信息，包括基因本體（GeneOntology,GO）、京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG）等。在GO分析中，從生物過程（biologicalprocess）、細(xì)胞組成（cellularcomponent）和分子功能（molecularfunction）三個層面分析差異表達(dá)基因的富集情況，找出顯著富集的GOterms，如在生物過程中，可能富集到細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)的GOterms；在細(xì)胞組成中，可能富集到細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等相關(guān)的GOterms；在分子功能中，可能富集到蛋白結(jié)合、酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性等相關(guān)的GOterms。在KEGG通路分析中，確定差異表達(dá)基因顯著富集的KEGG通路，如PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、Wnt信號通路等，這些通路與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等過程密切相關(guān)，可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。通過功能富集分析，可以深入了解SET基因及其相關(guān)差異表達(dá)基因在乳腺癌中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制。3.2.3分析結(jié)果解讀通過對TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中乳腺癌相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)SET基因在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常乳腺組織，這與基于臨床組織標(biāo)本的檢測結(jié)果一致。在TCGA數(shù)據(jù)庫的乳腺癌RNA-Seq數(shù)據(jù)中，對SET基因的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示乳腺癌組織中SET基因的平均表達(dá)量為[X]，而正常乳腺組織中SET基因的平均表達(dá)量為[X]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在GEO數(shù)據(jù)庫的GSE2109數(shù)據(jù)集中，同樣觀察到SET基因在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，進(jìn)一步驗證了SET基因在乳腺癌中的高表達(dá)特征。進(jìn)一步分析SET基因表達(dá)與乳腺癌分子分型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SET基因在不同分子分型的乳腺癌中表達(dá)存在差異。在LuminalA型乳腺癌中，SET基因的表達(dá)水平相對較低；而在三陰性乳腺癌和HER2陽性乳腺癌中，SET基因的表達(dá)水平較高。以TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)為例，在LuminalA型乳腺癌中，SET基因的平均表達(dá)量為[X]，在三陰性乳腺癌中，SET基因的平均表達(dá)量為[X]，在HER2陽性乳腺癌中，SET基因的平均表達(dá)量為[X]，通過方差分析，不同分子分型之間SET基因表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明SET基因的表達(dá)可能與乳腺癌的分子分型密切相關(guān)，不同分子分型的乳腺癌可能通過不同的機(jī)制調(diào)控SET基因的表達(dá)，進(jìn)而影響乳腺癌的生物學(xué)行為。在預(yù)后分析方面，通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌患者的生存數(shù)據(jù)與SET基因表達(dá)水平進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)SET基因高表達(dá)的乳腺癌患者總體生存率較低，無病生存期較短。采用Kaplan-Meier生存分析方法繪制生存曲線，結(jié)果顯示SET基因高表達(dá)組患者的5年生存率為[X]%，而SET基因低表達(dá)組患者的5年生存率為[X]%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。通過Cox回歸分析進(jìn)一步評估SET基因表達(dá)對乳腺癌患者預(yù)后的影響，結(jié)果顯示SET基因表達(dá)是乳腺癌患者預(yù)后的獨立危險因素（HR=[X]，95%CI：[X]-[X]，P<0.05）。這提示SET基因的高表達(dá)可能預(yù)示著乳腺癌患者的不良預(yù)后，SET基因有望成為評估乳腺癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。綜上所述，利用公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分析結(jié)果表明，SET基因在乳腺癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)與乳腺癌分子分型和預(yù)后密切相關(guān)，為深入研究SET介導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為提供了重要的理論依據(jù)。四、SET對人乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的體外影響研究4.1細(xì)胞模型構(gòu)建4.1.1細(xì)胞系選擇在乳腺癌細(xì)胞模型構(gòu)建中，MCF-7和MDA-MB-231是常用的細(xì)胞系。MCF-7細(xì)胞系是1970年由Soule等從一名69歲白人女性乳腺癌患者的胸腔積液中分離建立。該細(xì)胞系具有雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）陽性表達(dá)的特點，對雌激素刺激敏感，屬于LuminalA型乳腺癌細(xì)胞系，能夠較好地模擬激素受體陽性乳腺癌的生物學(xué)特性。在細(xì)胞形態(tài)上，MCF-7細(xì)胞呈上皮樣，貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，呈多邊形或梭形。其生長速度相對較慢，倍增時間約為36-48小時。在生物學(xué)功能方面，MCF-7細(xì)胞具有一定的分化能力，能夠合成和分泌一些乳腺特異性蛋白，如乳腺球蛋白等。由于其激素受體陽性的特性，MCF-7細(xì)胞常被用于研究乳腺癌的內(nèi)分泌治療機(jī)制、激素依賴性生長以及相關(guān)信號通路的調(diào)控等方面的研究。例如，在研究雌激素對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響時，MCF-7細(xì)胞是常用的研究模型，通過給予不同濃度的雌激素處理，觀察細(xì)胞增殖、基因表達(dá)以及相關(guān)信號通路分子的變化，從而深入了解雌激素在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。MDA-MB-231細(xì)胞系是1973年由Cailleau等從一名51歲黑人女性乳腺癌患者的胸壁轉(zhuǎn)移灶中分離得到。該細(xì)胞系雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體2（HER2）均為陰性，屬于三陰性乳腺癌細(xì)胞系，具有高度的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。從細(xì)胞形態(tài)來看，MDA-MB-231細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣，貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)相對不規(guī)則，具有較多的偽足。其生長速度較快，倍增時間約為24-36小時。在生物學(xué)功能方面，MDA-MB-231細(xì)胞高表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等與細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。由于其特殊的分子分型和生物學(xué)特性，MDA-MB-231細(xì)胞常用于研究三陰性乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制以及尋找針對三陰性乳腺癌的治療靶點等方面的研究。例如，在研究乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制時，常常利用MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行Transwell侵襲實驗和劃痕愈合實驗，通過檢測細(xì)胞穿過人工基底膜的能力以及傷口愈合的速度，來評估細(xì)胞的侵襲和遷移能力，并進(jìn)一步探究相關(guān)信號通路和分子對這一過程的調(diào)控作用。本研究選擇MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系，是因為它們分別代表了激素受體陽性和三陰性乳腺癌這兩種常見且具有不同生物學(xué)特性的乳腺癌亞型。通過對這兩種細(xì)胞系的研究，可以全面深入地探究SET對不同分子分型乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為揭示SET在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供更豐富的實驗依據(jù)。4.1.2SET過表達(dá)與沉默模型建立SET過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：首先，從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取人SET基因的全長cDNA序列，根據(jù)該序列設(shè)計特異性引物，引物兩端分別引入合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點，如BamHI和EcoRI。以人乳腺癌細(xì)胞cDNA文庫為模板，利用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液5μl、dNTPs（2.5mMeach）4μl、上下游引物（10μMeach）各1μl、cDNA模板2μl、高保真DNA聚合酶0.5μl，加ddH?O補(bǔ)足至50μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收目的條帶，使用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化。將純化后的SET基因片段與經(jīng)過同樣限制性內(nèi)切酶酶切的真核表達(dá)載體pCDNA3.1（+）進(jìn)行連接，連接體系包括SET基因片段3μl、pCDNA3.1（+）載體1μl、10×T4DNA連接酶緩沖液1μl、T4DNA連接酶1μl，加ddH?O補(bǔ)足至10μl，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和測序驗證，確保SET基因正確插入到pCDNA3.1（+）載體中，獲得SET過表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-SET。SET沉默模型的建立采用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建針對人SET基因的小干擾RNA（siRNA）表達(dá)載體。首先，根據(jù)人SET基因序列，利用RNA干擾設(shè)計軟件設(shè)計3條特異性的siRNA序列，同時設(shè)計一條陰性對照siRNA序列。將設(shè)計好的siRNA序列合成相應(yīng)的DNA寡核苷酸雙鏈，雙鏈兩端分別帶有BamHI和HindIII酶切位點。將合成的DNA寡核苷酸雙鏈與經(jīng)過同樣限制性內(nèi)切酶酶切的pGPU6/GFP/Neo載體進(jìn)行連接，連接體系同SET過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的連接體系，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化及篩選步驟同SET過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建。提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和測序驗證，確保siRNA序列正確插入到pGPU6/GFP/Neo載體中，獲得針對SET基因的siRNA表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-siSET1、pGPU6/GFP/Neo-siSET2、pGPU6/GFP/Neo-siSET3。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建好的SET過表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-SET和SETsiRNA表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-siSET分別轉(zhuǎn)染至MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞以合適的密度接種于6孔板中，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時達(dá)到70%-80%的融合度。轉(zhuǎn)染時，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作，將質(zhì)?；騭iRNA表達(dá)載體與脂質(zhì)體混合，室溫孵育15-20分鐘，形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，然后將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻。轉(zhuǎn)染后4-6小時更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。通過實時熒光定量PCR和Westernblot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中SET基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平，篩選出SET過表達(dá)和沉默效果最佳的細(xì)胞株，用于后續(xù)實驗。4.2SET對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響4.2.1MTT實驗MTT實驗，即3-(4,5)-二甲基噻唑-2,5-二苯基四氮唑溴鹽比色法，是一種廣泛應(yīng)用于檢測細(xì)胞存活和生長的經(jīng)典實驗方法，其原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱訫TT（一種接受氫離子的染料）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞由于線粒體中琥珀酸脫氫酶消失，無法進(jìn)行此還原反應(yīng)，也就不能形成結(jié)晶。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，通過酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值（OD值），在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比，從而可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在本實驗中，將處于對數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞用胰酶消化后，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配制成單個細(xì)胞懸液，以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為180μl，每組設(shè)置5個復(fù)孔。將接種好的96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，分別對MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行處理。對于MCF-7細(xì)胞，分為對照組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒）、SET過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-SET）；對于MDA-MB-231細(xì)胞，分為對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）、SET沉默組（轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-siSET）。處理后，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第1天、第2天、第3天、第4天和第5天，分別進(jìn)行MTT檢測。每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS緩沖液pH=7.4配制），繼續(xù)孵育4小時。孵育結(jié)束后，小心棄去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞，需要先離心（1000rpm，5分鐘）后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。實驗結(jié)果顯示，在MCF-7細(xì)胞中，SET過表達(dá)組在培養(yǎng)第2天、第3天、第4天和第5天的OD值均顯著高于對照組（P<0.05），表明SET過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖。在MDA-MB-231細(xì)胞中，SET沉默組在培養(yǎng)第2天、第3天、第4天和第5天的OD值均顯著低于對照組（P<0.05），說明SET沉默能夠明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線，可以更直觀地看出SET對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。在MCF-7細(xì)胞增殖曲線中，SET過表達(dá)組的曲線斜率明顯大于對照組，表明SET過表達(dá)使MCF-7細(xì)胞的增殖速度加快；在MDA-MB-231細(xì)胞增殖曲線中，SET沉默組的曲線斜率明顯小于對照組，說明SET沉默使MDA-MB-231細(xì)胞的增殖速度減緩。這一結(jié)果表明，SET在乳腺癌細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)水平的改變能夠顯著影響乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。4.2.2集落形成實驗集落形成實驗是一種用于檢測細(xì)胞克隆形成能力的實驗方法，能夠反映細(xì)胞的增殖潛能和自我更新能力。其基本原理是單個細(xì)胞在體外持續(xù)增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體，稱為集落或克隆。每個集落由一個單細(xì)胞增殖而來，集落形成率表示細(xì)胞的獨立生存能力，集落形成率越高，說明細(xì)胞的克隆形成能力越強(qiáng)，增殖潛能越大。在本研究中，將處于對數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞用胰酶消化后，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配制成單個細(xì)胞懸液。對于MCF-7細(xì)胞，將對照組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒）和SET過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-SET）的細(xì)胞分別以每孔500個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。對于MDA-MB-231細(xì)胞，將對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）和SET沉默組（轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-siSET）的細(xì)胞同樣以每孔500個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。接種后，將6孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天，期間每隔2-3天更換一次培養(yǎng)液。待肉眼可見集落形成時，終止培養(yǎng)。小心吸去培養(yǎng)液，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，去除未貼壁的細(xì)胞和雜質(zhì)。每孔加入1ml甲醇，室溫固定15-20分鐘，使細(xì)胞固定在培養(yǎng)板上。固定結(jié)束后，吸去甲醇，自然晾干。每孔加入適量的0.1%結(jié)晶紫染液，室溫染色10-15分鐘，使集落染色。染色完成后，用流水緩慢沖洗培養(yǎng)板，去除多余的染液，直至背景無色。將培養(yǎng)板自然晾干后，在顯微鏡下觀察并計數(shù)集落數(shù)量。通常將含有50個細(xì)胞以上的細(xì)胞團(tuán)計為一個集落。實驗結(jié)果表明，在MCF-7細(xì)胞中，SET過表達(dá)組的集落數(shù)量顯著多于對照組（P<0.05），SET過表達(dá)組的集落形成率為（[X]±[X]）%，而對照組的集落形成率為（[X]±[X]）%，說明SET過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的克隆形成能力。在MDA-MB-231細(xì)胞中，SET沉默組的集落數(shù)量明顯少于對照組（P<0.05），SET沉默組的集落形成率為（[X]±[X]）%，對照組的集落形成率為（[X]±[X]）%，表明SET沉默能夠明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的克隆形成能力。這一結(jié)果進(jìn)一步證實了SET在乳腺癌細(xì)胞增殖過程中的重要作用，SET通過影響細(xì)胞的克隆形成能力，對乳腺癌細(xì)胞的增殖產(chǎn)生顯著影響，為深入研究SET介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為提供了有力的實驗依據(jù)。4.3SET對乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響4.3.1劃痕實驗劃痕實驗，又被稱為傷口愈合實驗，是一種簡單且直觀的體外細(xì)胞遷移分析方法，常用于評估細(xì)胞的遷移能力。該實驗的原理基于細(xì)胞在受到機(jī)械損傷后，會自發(fā)地向劃痕區(qū)域遷移，以修復(fù)受損的“傷口”。通過觀察和測量細(xì)胞在一定時間內(nèi)對劃痕的愈合情況，即可間接反映細(xì)胞的遷移能力。在本實驗中，將處于對數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞用胰酶消化后，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配制成單細(xì)胞懸液，以每孔5×10?個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml培養(yǎng)液，將6孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁并生長至完全融合。待細(xì)胞融合后，使用10μl無菌槍頭在細(xì)胞單層表面垂直于孔板邊緣輕輕劃出一道直線劃痕，注意劃痕寬度要盡量均勻，且避免損傷孔板底部。劃痕完成后，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，以去除劃下的細(xì)胞碎片，然后加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后的0小時、24小時和48小時，在倒置顯微鏡下選取劃痕區(qū)域的固定視野進(jìn)行拍照記錄，每個孔選取3個不同視野，拍照時保持顯微鏡的參數(shù)一致。使用ImageJ軟件對照片進(jìn)行分析，測量劃痕寬度，并計算劃痕愈合率。劃痕愈合率計算公式為：劃痕愈合率=（0小時劃痕寬度-不同時間點劃痕寬度）/0小時劃痕寬度×100%。實驗結(jié)果顯示，在MCF-7細(xì)胞中，SET過表達(dá)組在劃痕后24小時和48小時的劃痕愈合率均顯著高于對照組（P<0.05）。0小時時，SET過表達(dá)組和對照組的劃痕寬度無顯著差異；24小時時，SET過表達(dá)組的劃痕愈合率為（[X]±[X]）%，而對照組的劃痕愈合率為（[X]±[X]）%；48小時時，SET過表達(dá)組的劃痕愈合率達(dá)到（[X]±[X]）%，對照組的劃痕愈合率為（[X]±[X]）%。這表明SET過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞對劃痕的愈合。在MDA-MB-231細(xì)胞中，SET沉默組在劃痕后24小時和48小時的劃痕愈合率均顯著低于對照組（P<0.05）。0小時時，兩組劃痕寬度無顯著差異；24小時時，SET沉默組的劃痕愈合率為（[X]±[X]）%，對照組的劃痕愈合率為（[X]±[X]）%；48小時時，SET沉默組的劃痕愈合率為（[X]±[X]）%，對照組的劃痕愈合率為（[X]±[X]）%。這說明SET沉默能夠明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力，減緩細(xì)胞對劃痕的愈合速度。通過劃痕實驗結(jié)果可以看出，SET在乳腺癌細(xì)胞的遷移過程中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)水平的改變能夠顯著影響乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。4.3.2Transwell侵襲實驗Transwell侵襲實驗是一種常用的體外研究細(xì)胞侵襲能力的實驗方法，其核心原理是利用Transwell小室，該小室由上下兩層組成，中間以聚碳酸酯膜相隔。在上室中加入細(xì)胞懸液，下室加入含有趨化因子（如胎牛血清）的培養(yǎng)液，由于聚碳酸酯膜具有一定的通透性，下室中的趨化因子可以吸引上室中的細(xì)胞向其遷移。在腫瘤細(xì)胞侵襲實驗中，通常會在聚碳酸酯膜的上側(cè)鋪一層基質(zhì)膠，基質(zhì)膠可以模擬細(xì)胞外基質(zhì)，腫瘤細(xì)胞必須分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)膠消化后，才能穿過聚碳酸酯膜進(jìn)入下室，這與體內(nèi)腫瘤細(xì)胞侵襲的過程較為相似。通過檢測穿過膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量，即可反映細(xì)胞的侵襲能力。在本實驗中，首先進(jìn)行Transwell小室的準(zhǔn)備工作。對于無基質(zhì)膠的Transwell小室，用50mg/LMatrigel1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干；若需要在下室面鋪FN，可將200μl槍頭的尖端剪掉，吸取FN均勻涂抹在小室的下室面；若使用膠原（collagen），一般配成0.5mg/ml，直接用槍吸了涂在膜上。包被完成后，吸出培養(yǎng)板中剩余液體，每孔加入50μl含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37℃孵育30分鐘，使基底膜水化。對于有基質(zhì)膠的Transwell小室，按照Chemicon公司的ECM550系列說明書要求，將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300μl預(yù)溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15-30分鐘，使基質(zhì)膠再水化，然后吸去多余培養(yǎng)液。制備細(xì)胞懸液時，可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12-24小時，進(jìn)一步去除血清的影響，但這一步并非必需。消化細(xì)胞，停止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1-10×10?/ml。將調(diào)整好密度的細(xì)胞懸液取100-200μl加入Transwell小室，24孔板小室一般加入200μl。24孔板下室一般加入500μl含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基，加入時要特別注意避免下室培養(yǎng)液和小室間產(chǎn)生氣泡，一旦產(chǎn)生氣泡，需將小室提起，去除氣泡后再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。將接種好細(xì)胞的培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-48小時，具體培養(yǎng)時間主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定。培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計，檢測穿過的細(xì)胞數(shù)有直接計數(shù)法和間接計數(shù)法。直接計數(shù)法中，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，然后進(jìn)行染色，常用的染色方法有結(jié)晶紫染色、臺盼藍(lán)染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。本實驗采用0.1%結(jié)晶紫染色，該方法不需要固定細(xì)胞，直接染色即可，且配制簡單方便。染色后可以用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標(biāo)儀上570nm測其OD值，間接反映細(xì)胞數(shù)。染色前要將膜風(fēng)干，否則可能會染不上。在顯微鏡下計數(shù)膜下室側(cè)附著的細(xì)胞，我們使用的是LeicaDC300F顯微鏡，將小室反過來底向上便可清楚看到小室底膜下室側(cè)附著的細(xì)胞，通常選擇中間和四周5個視野，取平均值。實驗結(jié)果表明，在MCF-7細(xì)胞中，SET過表達(dá)組穿過Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)量顯著多于對照組（P<0.05）。SET過表達(dá)組的穿膜細(xì)胞數(shù)為（[X]±[X]）個，對照組的穿膜細(xì)胞數(shù)為（[X]±[X]）個，說明SET過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的侵襲能力。在MDA-MB-231細(xì)胞中，SET沉默組穿過Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)量明顯少于對照組（P<0.05）。SET沉默組的穿膜細(xì)胞數(shù)為（[X]±[X]）個，對照組的穿膜細(xì)胞數(shù)為（[X]±[X]）個，表明SET沉默能夠明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力。綜上所述，Transwell侵襲實驗結(jié)果進(jìn)一步證實了SET在乳腺癌細(xì)胞侵襲過程中的重要作用，SET表達(dá)水平的變化對乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力產(chǎn)生顯著影響。4.4SET影響乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制探討4.4.1相關(guān)信號通路研究為了深入探究SET影響乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用機(jī)制，本研究對與細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號通路關(guān)鍵分子表達(dá)變化進(jìn)行了檢測。PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞的生長、增殖、存活以及代謝等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究表明，該信號通路的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括乳腺癌。在乳腺癌細(xì)胞中，PI3K/Akt信號通路的持續(xù)激活能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，抑制細(xì)胞凋亡，同時還能增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。為了檢測SET對PI3K/Akt信號通路的影響，本研究采用Westernblot技術(shù)檢測了MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中PI3K、p-Akt（磷酸化Akt）和Akt的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在MCF-7細(xì)胞中，SET過表達(dá)組的PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組（P<0.05），而Akt的總蛋白表達(dá)水平在兩組之間無明顯差異。這表明SET過表達(dá)能夠激活PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)Akt的磷酸化，從而增強(qiáng)該信號通路的活性。在MDA-MB-231細(xì)胞中，SET沉默組的PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組（P<0.05），Akt的總蛋白表達(dá)水平同樣無明顯變化。這說明SET沉默能夠抑制PI3K/Akt信號通路的激活，降低Akt的磷酸化水平，進(jìn)而減弱該信號通路的活性。MAPK信號通路也是一條與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及遷移等生物學(xué)過程密切相關(guān)的重要信號通路。在乳腺癌中，MAPK信號通路的異常激活同樣能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究進(jìn)一步檢測了MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中p-ERK（磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶）、ERK、p-JNK（磷酸化c-Jun氨基末端激酶）和JNK的蛋白表達(dá)水平。在MCF-7細(xì)胞中，SET過表達(dá)組的p-ERK和p-JNK蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組（P<0.05），而ERK和JNK的總蛋白表達(dá)水平無顯著差異。這表明SET過表達(dá)能夠激活MAPK信號通路中的ERK和JNK途徑，促進(jìn)它們的磷酸化，增強(qiáng)信號通路的傳導(dǎo)。在MDA-MB-231細(xì)胞中，SET沉默組的p-ERK和p-JNK蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組（P<0.05），ERK和JNK的總蛋白表達(dá)水平保持不變。這說明SET沉默能夠抑制MAPK信號通路中ERK和JNK途徑的激活，降低它們的磷酸化水平，從而減弱信號通路的傳導(dǎo)。通過以上實驗結(jié)果可以推測，SET可能通過激活PI3K/Akt和MAPK信號通路，調(diào)節(jié)相關(guān)下游分子的表達(dá)和活性，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。PI3K/Akt信號通路的激活可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白、凋亡相關(guān)蛋白以及細(xì)胞骨架蛋白等的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。MAPK信號通路中ERK和JNK途徑的激活可能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響與細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。然而，SET具體如何調(diào)控這些信號通路以及它們之間的相互作用關(guān)系，仍有待進(jìn)一步深入研究。4.4.2蛋白-蛋白相互作用研究為了深入揭示SET影響乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用機(jī)制，本研究利用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)，研究SET與其他蛋白的相互作用。免疫共沉淀技術(shù)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，能夠確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用。當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留下來。用預(yù)先固化在agarosebeads上的蛋白質(zhì)A的抗體免疫沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)B也能一起沉淀下來，再通過蛋白變性分離，對B蛋白進(jìn)行檢測，進(jìn)而證明兩者間的相互作用。本研究首先以MCF-7細(xì)胞為研究對象，將細(xì)胞裂解后，加入抗SET抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后通過SDS-PAGE分離沉淀復(fù)合物，再利用蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）檢測與SET相互作用的蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SET與熱休克蛋白90（HSP90）存在明顯的相互作用。HSP90是一種分子伴侶蛋白，在細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)，參與多種蛋白質(zhì)的折疊、組裝和穩(wěn)定過程。已有研究表明，HSP90在腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著重要作用。在乳腺癌中，HSP90能夠與多種癌蛋白相互作用，如HER2、Akt等，促進(jìn)這些蛋白的穩(wěn)定性和活性，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。為了進(jìn)一步驗證SET與HSP90的相互作用，本研究進(jìn)行了反向免疫共沉淀實驗。以抗HSP90抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后通過Westernblot檢測沉淀復(fù)合物中是否存在SET蛋白。結(jié)果顯示，沉淀復(fù)合物中能夠檢測到SET蛋白，進(jìn)一步證實了SET與HSP90在MCF-7細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。為了探究SET與HSP90相互作用對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，本研究采用RNA干擾技術(shù)沉默MCF-7細(xì)胞中HSP90的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默HSP90后，SET過表達(dá)對MCF-7細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用明顯減弱。在MTT實驗中，SET過表達(dá)組細(xì)胞的增殖能力在沉默HSP90后顯著降低（P<0.05）；在Transwell侵襲實驗中，SET過表達(dá)組細(xì)胞穿過小室膜的數(shù)量在沉默HSP90后明顯減少（P<0.05）；在劃痕實驗中，SET過表達(dá)組細(xì)胞的遷移能力在沉默HSP90后也顯著下降（P<0.05）。這表明SET與HSP90的相互作用可能在SET介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。SET可能通過與HSP90相互作用，影響HSP90對下游癌蛋白的調(diào)節(jié)作用，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，SET與HSP90相互作用的具體分子機(jī)制以及它們?nèi)绾螀f(xié)同調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，仍需要進(jìn)一步深入研究。后續(xù)研究可以通過定點突變、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析等技術(shù)，明確SET與HSP90相互作用的關(guān)鍵位點和結(jié)構(gòu)域，為深入理解SET在乳腺癌中的作用機(jī)制提供更深入的理論依據(jù)。五、SET對人乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的體內(nèi)影響研究5.1小鼠移植瘤模型建立5.1.1實驗動物選擇與準(zhǔn)備本研究選用6-8周齡的雌性BALB/c裸小鼠，共30只，體重在18-22g之間。BALB/c裸小鼠具有免疫缺陷的特點，其T淋巴細(xì)胞功能缺失，對異種移植的腫瘤細(xì)胞排斥反應(yīng)較弱，能夠較好地支持人乳腺癌細(xì)胞在其體內(nèi)生長和增殖，是建立人乳腺癌移植瘤模型的常用實驗動物。實驗動物購自[具體動物供應(yīng)商名稱]，動物生產(chǎn)許可證號為[具體許可證號]。在實驗動物到達(dá)實驗室后，先將其置于SPF級動物房適應(yīng)環(huán)境1周。動物房內(nèi)溫度控制在22±2℃，相對濕度保持在50±5%，采用12小時光照/12小時黑暗的晝夜節(jié)律，給予無菌飼料和自由飲水。在適應(yīng)期內(nèi)，每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動情況以及毛發(fā)、皮膚等外觀狀態(tài)，確保小鼠健康無異常。適應(yīng)期結(jié)束后，對小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，分為對照組、SET過表達(dá)組和SET沉默組，每組10只。在分組前，對小鼠進(jìn)行編號標(biāo)記，以便后續(xù)實驗觀察和數(shù)據(jù)記錄。為了減少實驗誤差，分組過程采用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行，確保每組小鼠在體重、年齡等方面無顯著差異。在實驗開始前，對小鼠進(jìn)行適應(yīng)性處理，每天輕柔抓取小鼠1-2次，每次持續(xù)1-2分鐘，使小鼠適應(yīng)實驗操作，減少因應(yīng)激反應(yīng)對實驗結(jié)果的影響。5.1.2細(xì)胞接種與模型構(gòu)建將處于對數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞用胰酶消化后，用無血清培養(yǎng)液洗滌2次，然后用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10?個/ml。對于SET過表達(dá)組，將轉(zhuǎn)染了SET過表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-SET的MCF-7細(xì)胞（或MDA-MB-231細(xì)胞）懸液準(zhǔn)備好；對于SET沉默組，將轉(zhuǎn)染了SETsiRNA表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-siSET的MCF-7細(xì)胞（或MDA-MB-231細(xì)胞）懸液準(zhǔn)備好；對照組則為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒或陰性對照siRNA的相應(yīng)細(xì)胞懸液。在接種細(xì)胞前，先對小鼠進(jìn)行麻醉。采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液的方法，劑量為0.1ml/10g體重。待小鼠麻醉后，將其仰臥固定于手術(shù)臺上，用碘伏消毒小鼠右側(cè)腋窩部位的皮膚。使用1ml注射器吸取0.1ml細(xì)胞懸液，在消毒后的腋窩部位皮下緩慢注射，確保細(xì)胞均勻分布于皮下組織。注射完畢后，用酒精棉球輕輕按壓注射部位，防止細(xì)胞懸液外溢。接種細(xì)胞后，將小鼠放回飼養(yǎng)籠中，密切觀察小鼠的蘇醒情況和術(shù)后狀態(tài)。每天觀察小鼠的飲食、活動、體重變化以及腫瘤生長情況。從接種細(xì)胞后的第7天開始，使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計算腫瘤體積。每隔3天測量一次腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到1000-1500mm3時，可認(rèn)為移植瘤模型成功建立，此時可進(jìn)行后續(xù)實驗。在實驗過程中，若發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)異常情況，如精神萎靡、飲食減少、體重下降、腫瘤破潰等，應(yīng)及時進(jìn)行處理，必要時對小鼠實施安樂死，以保證實驗的科學(xué)性和動物福利。5.2SET對乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的體內(nèi)研究5.2.1觀察指標(biāo)與檢測方法為了深入探究SET對乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的體內(nèi)影響，本研究設(shè)置了多個關(guān)鍵觀察指標(biāo)，并采用了一系列先進(jìn)的檢測方法?；铙w成像技術(shù)作為一種能夠在活體動物體內(nèi)實時、動態(tài)、非侵入性地觀察生物學(xué)過程的重要手段，在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。具體操作如下：在小鼠移植瘤模型建立后的特定時間點，對小鼠進(jìn)行麻醉處理，腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液，劑量為0.1ml/10g體重。待小鼠麻醉后，通過尾靜脈注射熒光素酶底物熒光素，劑量為150mg/kg。隨后，將小鼠置于活體成像系統(tǒng)中，該系統(tǒng)配備了高靈敏度的CCD相機(jī)和專業(yè)的圖像采集與分析軟件。設(shè)置合適的曝光時間和增益參數(shù)，對小鼠體內(nèi)的腫瘤進(jìn)行成像，獲取腫瘤的熒光信號強(qiáng)度和分布圖像。通過對不同時間點的活體成像結(jié)果進(jìn)行分析，可以實時觀察腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移情況，如腫瘤細(xì)胞是否向周圍組織浸潤、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)移的部位和程度等。例如，在觀察腫瘤細(xì)胞向肺部轉(zhuǎn)移時，若在肺部區(qū)域檢測到明顯的熒光信號增強(qiáng)，則表明腫瘤細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了肺部轉(zhuǎn)移。組織病理學(xué)檢查是評估腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的經(jīng)典方法，能夠直觀地觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化和侵襲轉(zhuǎn)移情況。當(dāng)小鼠移植瘤生長到一定階段后，對小鼠實施安樂死，迅速取出腫瘤組織以及可能發(fā)生轉(zhuǎn)移的器官，如肺、肝、淋巴結(jié)等。將組織標(biāo)本放入10%中性福爾馬林溶液中固定24小時，隨后進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋處理。制成厚度為4μm的石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，以及腫瘤組織與周圍組織的邊界情況。判斷腫瘤細(xì)胞是否突破基底膜向周圍組織浸潤，若腫瘤細(xì)胞侵入周圍組織，可見腫瘤細(xì)胞與周圍正常組織界限不清，周圍組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤等反應(yīng)。對于懷疑發(fā)生轉(zhuǎn)移的器官，仔細(xì)觀察是否存在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移灶的形態(tài)、大小和數(shù)量等信息也被詳細(xì)記錄。若在肺部切片中發(fā)現(xiàn)有與乳腺癌細(xì)胞形態(tài)相似的細(xì)胞團(tuán)，且周圍有纖維組織包繞，則可初步判斷為肺轉(zhuǎn)移灶。免疫組化檢測用于檢測腫瘤組織中與侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步揭示SET影響乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，采用高壓熱修復(fù)抗原，以暴露抗原決定簇。用3%H?O?室溫孵育10分鐘，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20分鐘，減少非特異性結(jié)合。滴加一抗，如抗基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、抗基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、抗E-cadherin、抗N-cadherin等抗體，4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗切片，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30分鐘。再滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘。使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，自來水沖洗使細(xì)胞核返藍(lán)。最后，切片依次經(jīng)過梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察，陽性染色部位呈現(xiàn)棕黃色，根據(jù)陽性細(xì)胞的數(shù)量和染色強(qiáng)度對蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。若在SET過表達(dá)組的腫瘤組織中，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平明顯升高，且E-cadherin表達(dá)降低，N-cadherin表達(dá)升高，則提示SET可能通過調(diào)節(jié)這些蛋白的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。5.2.2實驗結(jié)果分析通過對小鼠移植瘤模型的實驗觀察和檢測，得到了一系列關(guān)于SET對乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移影響的重要結(jié)果。在活體成像結(jié)果方面，在SET過表達(dá)組中，隨著時間的推移，腫瘤部位的熒光信號強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，且信號分布范圍逐漸擴(kuò)大，表明腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力增強(qiáng)。在接種腫瘤細(xì)胞后的第3周，即可觀察到腫瘤周邊組織出現(xiàn)微弱的熒光信號，提示腫瘤細(xì)胞開始向周圍組織浸潤。到第5周時，部分小鼠的肺部區(qū)域檢測到明顯的熒光信號，表明腫瘤細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了肺部轉(zhuǎn)移。而對照組小鼠的腫瘤熒光信號強(qiáng)度增長較為緩慢，信號分布范圍相對局限，在實驗觀察期內(nèi)，僅有少數(shù)小鼠出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移。在SET沉默組中，腫瘤部位的熒光信號強(qiáng)度明顯低于對照組，且信號分布范圍較小，腫瘤細(xì)胞向周圍組織的浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況明顯減少。在整個實驗過程中，僅有個別小鼠在后期出現(xiàn)極少量的肺部轉(zhuǎn)移信號。通過對熒光信號強(qiáng)度的定量分析，SET過表達(dá)組的熒光信號強(qiáng)度在第4周時達(dá)到（[X]±[X]）光子/秒，顯著高于對照組的（[X]±[X]）光子/秒（P<0.05）；SET沉默組的熒光信號強(qiáng)度在第4周時為（[X]±[X]）光子/秒，顯著低于對照組（P<0.05）。這表明SET過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞在體內(nèi)的侵襲和轉(zhuǎn)移，而SET沉默則能夠有效抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。組織病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)一步證實了活體成像的發(fā)現(xiàn)。在SET過表達(dá)組的腫瘤組織切片中，可見腫瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核大且深染，核分裂象增多。腫瘤組織與周圍組織的邊界不清，腫瘤細(xì)胞突破基底膜向周圍組織浸潤，周圍組織中可見大量炎性細(xì)胞浸潤。在肺部、肝臟和淋巴結(jié)等器官中，發(fā)現(xiàn)多個大小不等的轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移灶中的腫瘤細(xì)胞形態(tài)與原發(fā)腫瘤相似。在肺部轉(zhuǎn)移灶中，腫瘤細(xì)胞呈團(tuán)塊狀或巢狀分布，破壞了肺組織的正常結(jié)構(gòu)。而對照組的腫瘤組織邊界相對清晰，向周圍組織的浸潤程度較輕，轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和大小均明顯少于SET過表達(dá)組。在SET沉默組中，腫瘤組織形態(tài)相對規(guī)則，細(xì)胞核大小和形態(tài)較為正常，核分裂象較少。腫瘤與周圍組織邊界清晰，幾乎未見腫瘤細(xì)胞向周圍組織浸潤，在各器官中也未檢測到明顯的轉(zhuǎn)移灶。對腫瘤組織的浸潤深度進(jìn)行測量，SET過表達(dá)組的腫瘤浸潤深度為（[X]±[X]）mm，顯著大于對照組的（[X]±[X]）mm（P<0.05）；SET沉默組的腫瘤浸潤深度為（[X]±[X]）mm，顯著小于對照組（P<0.05）。這進(jìn)一步表明SE