細(xì)胞免疫組化VIP

細(xì)胞免疫組化

細(xì)胞爬片得免疫組化

1、細(xì)胞爬片,5天后進(jìn)行免疫細(xì)胞組織化學(xué)染色定。

2、PBS清洗標(biāo)本3次各1min。

3、冰丙酮固定1501皿或4%多聚甲醛固定30111畝）。

4、空氣干燥5mino

5、PBS清洗標(biāo)本3次各2min。

6、0、5%TritonX-100（DPBS配）孵育1次20mino

7、PBS清洗標(biāo)本3次各2min。

8、3%H2O2（試劑A）孵育15m3。

9、DPBS清洗標(biāo)本3次各2min。

10、封閉血清孵育（試劑B）20mino

11、一抗孵育（滴度1:200,濕盒）4℃過夜或37℃60min。陰

性對照最好用一抗來源血清，否則用PBS液

12、PBS清洗標(biāo)本3次各5mine

13、二抗工作液孵育（濕盒試劑C）37℃30min。

14、PBS清洗標(biāo)本3次各5mino

15、試劑D（濕盒）37℃30mine

16、PBS清洗標(biāo)本3次各5mino

17、DAB顯色（避光，鏡下觀察至棕色）約3?lOmin。

18、蒸儲水洗2次1mino

19＞蘇木素復(fù)染5?Imin。

20、自來水洗返藍(lán)。

21、梯度酒精脫水75,85,95,100%各3min。

22、二甲苯透明2次3min。

23、中性樹膠封片。

注意事項：

1、良好得細(xì)胞爬片就是進(jìn)行免疫組織細(xì)胞得基礎(chǔ)，要獲得良

好細(xì)胞爬片須注意以下：

a對于粘附分子較少得細(xì)胞爬片時間要達(dá)5天以上這樣細(xì)胞

爬片才較牢固沖洗時不易脫片；

b接種得細(xì)胞密度適中以2*104/ml為宜，若密度太高5天后細(xì)

胞連接成片沖洗時易脫片；

2、冰丙酮固定后玻片可密閉保存于4C冰箱，冰丙酮固定時會

使細(xì)胞收縮，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。

3、沖洗時只須輕輕振蕩培養(yǎng)皿,（不可用吸管太用力吹，易脫

片）

4、加一抗、二抗后沖洗時第一次須將玻片傾斜

5、TritonX-100表面活性齊脫去細(xì)胞膜中最主要得成分脂質(zhì),

對于抗原表達(dá)在胞漿或胞核者方使用,對于抗原表達(dá)在胞漿

者時間要控制好,使其破壞細(xì)胞膜而核膜破壞較少。

細(xì)胞爬片固定后在孔板里做免疫組化還就是粘到載玻片上

再做？

1、如果不瞧熒光，兩種都可以，感覺粘好了再做要快一些，但就

是做得時候要防止脫落。

如果瞧熒光，就不能用中性樹膠粘,直接在24孔，或6孔板里做

才可以。中性樹膠要折光,散射得光干擾，沒辦法瞧細(xì)胞本身

得熒光。

2、孔板里做免疫組化較方便,細(xì)胞比蓋玻片易貼壁，但染色后

不能用二甲苯透明、封片（可用甘油）。

細(xì)胞爬片固定后粘到載玻片上不太可能，只有開始就讓細(xì)胞

貼在玻片上爬片。

3、我沒有在多孔板里做過，其實把細(xì)胞爬在蓋玻片上也不就

是很麻煩,偶這樣做很少掉片。

先將消化好得細(xì)胞懸液滴幾滴在蓋玻片上，由于液體得表面

張力，細(xì)胞懸液一般不會流淌到蓋玻片外面，等細(xì)胞大概貼壁

后,不同細(xì)胞貼壁時間稍有不同，大概6、7個小時，差不多貼壁

再加生長液,開始滴得細(xì)胞得數(shù)量您要摸索一下，到固定時細(xì)

胞生長到80%左右比較合適。

偶就是在蓋玻片上做得，首先細(xì)胞要爬得勻一些，象dongwp

戰(zhàn)友得就很好。然后傾去生長液沖洗、固定之后，用小鏡子或

手指把玻片從六孔板拿出來。擦干蓋玻片得背面，在玻片背面

四周涂一點凡士林，粘貼于載玻片上,這一點很重要，在以后得

操作里會省去蓋玻片經(jīng)常脫落麻煩。

細(xì)胞爬片得保存與抗原修復(fù)問題總結(jié)

1、細(xì)胞爬片可以用含疊氮鈉PBS液保存、但不知道

具體濃度,請告知、多謝!！

加在液體中作為防腐劑得疊氮鈉濃度一般為0、04--0、

08%。但就是我建議對于細(xì)胞爬片，還就是盡量快得進(jìn)行處理,

以防不必要得問題！

2、louischenwrote:但我得細(xì)胞爬片經(jīng)過4%多聚甲醛固

定,PBS沖洗后直接就放在了?20度，還能用于免疫組化嗎?！

應(yīng)該沒有問題，但就是還就是現(xiàn)作先染好些，以防抗原

得丟失

3、mRNA原位雜交經(jīng)4%多聚甲醛固定，固定液需加

DEPC水。其它建議用甲醇固定。-20度保存

4、如果就是4%多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存，

在4度冰箱里保存兩周沒問題。時間再長就沒試過了。

5、丙酮中固定5-10分鐘，然后風(fēng)干，放置4度保存過夜

應(yīng)該就是沒有問題。不要固定過夜，蛋白質(zhì)固定過度,會影響

抗原得暴露,影響免疫組化結(jié)果。如果就是胞漿或胞核抗原出

現(xiàn)假陰性結(jié)果，可考慮應(yīng)用0、5%得triton-100孵育30分鐘，

滲透細(xì)胞膜。如果玻片沒有經(jīng)過特殊處理，不要用其她抗原修

復(fù)得方法，會造成掉片，我曾有過這方面得體會

6、丙酮固定后,PBS洗滌3次，即可保存至4度冰箱備

用。

7、⑴細(xì)胞爬片先用TBS洗3次，每次5分鐘

(2)4%多聚甲醛固定，室溫,20分鐘

(3)70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脫水，通風(fēng)櫥內(nèi)

干燥,-80度保存。2周沒有問題得，我保存過2個月都有信號,

不過還就是保存時間短一點得好

8、我得心肌細(xì)胞爬片用不同濃度得乙醇依次脫水后，

就放在室溫中，因為就是要拍電鏡，但就是學(xué)校電鏡壞了，呵呵,

所以放了一個月后去拍，還就是很好

9、細(xì)胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固定用PBS沖

洗后，晾干，放在-20度保存一個月沒有問題得。

10、細(xì)胞爬片，有機溶劑如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定

后，輕輕搖動玻片或培養(yǎng)皿等，靜置2min左右，棄去固定液，不

用PBS洗而就是采用空氣干燥，干燥后得標(biāo)本可于-70℃長期

保存。解凍時要小心抗原破壞，應(yīng)先將標(biāo)本轉(zhuǎn)移于干冰預(yù)冷得

固定液，然后再將混合液轉(zhuǎn)移至室溫下,固定液到達(dá)室溫時取

出標(biāo)本，再用PBS沖洗，在做以后得步邦

11、我也做過細(xì)胞爬片得組化染色，不過沒有遇到類似

得問題。細(xì)胞培養(yǎng)好后用PBS洗一遍，然后4%多聚甲醛4度

固定15分鐘，自然風(fēng)干。室溫保存幾周內(nèi)都可以用得。我想

這可能與抗原得類型有關(guān),有得對氧化等損傷比較敏感，有得

差一些。最好避光保存在4度,同時盡量隔絕空氣。免疫熒光

與普通DAB顯色差別只再二抗得標(biāo)記,樣品得保存應(yīng)該就是

沒有多大差別得。

12、細(xì)胞爬片丙酮固定后-20度保存，現(xiàn)在要再做免疫熒

光，將保存得爬片拿出37度復(fù)溫然后常規(guī)操作就可以了

13、爬片做免疫組化得優(yōu)勢在于抗原新鮮，細(xì)胞形態(tài)保

存較好。若爬片需長期保存并出現(xiàn)您這樣得問題，原因可能就

是:1）試驗步驟有誤，建議重復(fù)并加陽性對照片。2）加一抗前處

理同石蠟切片，可進(jìn)行抗原修復(fù)，如胰酶消化或熱修復(fù)。3）因為

抗原抗體反應(yīng)在液相中進(jìn)行，故對已極度干燥得爬片充分水

化很重要。建議試驗前用PBS浸泡過夜。如不能解決您得問

題請QQ聯(lián)系:81825645。本人在湖南省腫瘤醫(yī)院病理科（長

沙市）做免疫組化。

14、4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以，也有用無水酒精

得，固定好后放-20度,2-3個月就是沒有問題得。

15、對于一般得細(xì)胞免疫組化，我得做法就是:細(xì)胞爬片

用冰得純丙酮固定20MIN,再在通風(fēng)柜將丙酮吹干-20度

保存，用丙酮固定作用就是沉淀蛋白質(zhì)與糖，穿透性很強，保存

抗原得免疫活性好。所以丙酮常用做細(xì)胞細(xì)胞爬片得固定

劑。當(dāng)然還就是要根據(jù)您得實驗?zāi)康脹Q定用那種固定劑。

如:1、多聚甲醛（常用4%）:可用于免疫電鏡;也可用于

免疫熒光染色。主要檢測組織內(nèi)一些性能嬌弱得抗原特別

就是細(xì)胞表面抗原，例如各類淋巴細(xì)胸分化決定簇（CD）、主要

組織相容性抗原等

2、乙醇。優(yōu)點:穿透性強、抗原性保存較好。缺點：

但醇類對低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差,

使蛋白變性得作用輕，固定后可再溶解;染色過程中，溫育時間

長,抗原可流失而減弱反應(yīng)強度

3、甲醛（福爾馬林）應(yīng)用最廣優(yōu)點:形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，

且穿透性強，缺點：甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH

降低，影響染色；分子間交聯(lián)形成得網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完

全掩蓋某些抗原決定簇,使之不能充分暴露?？稍斐杉訇幮缘?/p>

染色結(jié)果。

16、4度就是不能保存這么長時間（1個月）得，如果抗原

已被分解，再修復(fù)也沒用！

17、棄去固定液，不用PBS洗而就是采用空氣干燥，干燥

后得標(biāo)本可于-70C長期保存。

18、爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒鐘，然

后在4%多聚甲醛中固定15分鐘，然后再用37度去離子水將

甲醛沖干凈，注意手法輕柔,要不然掉片很厲害。同時操作過

程中注意玻片得正反面,要不然真得就是前功盡棄。

將做好得爬片置于濾紙上晾干,然后用中性樹膠粘在

載玻片上。注意一定要等中性樹膠徹底干了之后才能做后續(xù)

實驗，要不然玻片會掉下來得,就又就是前功盡棄了做好得

細(xì)胞爬片可以放在?20保存?zhèn)溆?具體能保存多長時間不太清

楚，當(dāng)然盡量早用。

19、固定后放點PBS,然后放在4度冰箱中保存，我最長

保存兩個月得，然后再做免疫組化，應(yīng)該沒有太大得問題得。

20、固定后4度可以存放一周,?2。度存放半年,我現(xiàn)在

也要做這個，實驗室老師教得。

21、四度放1周應(yīng)該沒問題得，您最好放在-2。度，我在

?20度放一個月都還出結(jié)果得、很多人作得片子很多，不可能

一次作完，一個月沒問題、

22、最佳得固定及保存方法：

(1)中性緩沖福爾馬林(不必調(diào)pH):

福爾馬林(40%甲醛,用時加入過量堿式MgCO3中與)

10^0ml

Na2HPO4、12H2ok9653g

NaH2PO4、2H200、5460g

加。、85%NaCl溶液溶解,定容至lOOmlo

(2)細(xì)胞固定:待細(xì)胞接近長成單層時，用鐐子取出蓋玻

片,迅速于37℃PBS中漂洗2次海次3-5秒,以清除血清。

(3)將蓋玻片投入中性緩沖福爾馬林溶液中室溫固定

30mino

(4)用鑲子取出蓋玻片,PBS漂洗2次，每次3-5秒，晾干

保存于-20C備用。可長期保存，做實驗時，取出片子，入PBS

濕潤后即可進(jìn)行您得實驗。

可以用于做免疫細(xì)胞化學(xué)(H、E、)或免疫熒光。(本帖

沒有加分)

23、細(xì)胞爬片固定以后要放在-20度得冰箱、1個月內(nèi)

可以用、

24、skywalkerzzwrote:過氧化氫處理這一步，用三蒸水

稀釋商品濃度為30%得過氧化氫，然后室溫下玻片放在其中

浸泡lOmin,就是不就是過氧化氫導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重脫片？

爬片應(yīng)該用甲醇/雙氧水,您得細(xì)胞極可能就是過氧

化氫導(dǎo)致嚴(yán)重脫片

25、本人比較喜歡用4%得多聚甲醛,20分鐘很好用得。

保存得時候注意片子最好晾干，不要擠壓，防止粘片與碎裂。

26、細(xì)胞爬片固定好以后，如果耍保存，我們得做法就是

倒掉固定液,PBS漂洗后干片保存在4度，最長半年沒問題。

27、1、用新鮮配制得預(yù)冷得4%多聚甲醛緩沖液室溫

固定15min,PBS(0、01mol/1,pH7>4)洗滌3遍后就是否就

可以進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色了

2、爬片PBS(0、01mol/1,pH7.4)洗滌3遍后就是否

能保存，怎樣保存？

1、洗過就可以做免疫組化了。

2、固定過后自然干燥,不要洗,-20度保存。做之前再

洗。

28、細(xì)胞固定最好用丙酮或酒精，不要用4%多聚甲醛，

以免抗原交聯(lián)，這樣組化時不用再抗原修復(fù)。細(xì)胞固定后可室

溫保存在丙酮中,不使之干燥。

29、如果就是檢測膜上得物質(zhì)，好象不能用酒精，

30、適當(dāng)密度后取出固定（丙酮.20固定10?20min）,再

進(jìn)行免疫染色。

31、一批細(xì)胞爬片，如果細(xì)胞爬片就是在玻璃上,冷丙酮

固定15-20分鐘,然后放-20度，沒有問題。

如果細(xì)胞爬片就是在24孔板或6孔板里進(jìn)行,冷丙酮

會腐蝕板子，最好4%多聚甲醛。

32、細(xì)胞爬片用純丙酮固定10分鐘，取出干燥后用錫紙

包裹,-70度保存。

33、4%多聚甲醛固定后PBS水洗,自然干燥后用錫紙包

裹,-20度凍存不超過1月。

34、如果細(xì)胞貼壁困難,可將片子先用純血清掛一層，涼

干后再養(yǎng)細(xì)胞。

35、可以買NUNC公司得專用細(xì)胞培養(yǎng)用蓋玻片商品

名ThermanoxCoverslipso高分子材料,耐高溫滅菌，

經(jīng)過特殊表面處理，細(xì)胞容易貼附?？梢杂眉舻度我獠眉?，使

用效果好。

上海生工有現(xiàn)貨，不用國外定貨。我使用后，覺得效果

比玻璃蓋玻片效果好很多。

36、我們通常就是把細(xì)胞玻片固定好后用PBS沖洗干

凈燃后用酒精脫水（80%,90%,100%」00%酒精各一次，每次

10分鐘左右）,然后放在烘箱里烘干，這就是就相當(dāng)于石蠟切

片了，可以保存一定得時間。

這個方法我們試過得，保持一段時間后做，效果還就是

可以得。

免疫細(xì)胞化學(xué)染色操作規(guī)程

一、材料與

1、玻片:須用免疫組化專用玻片，或用2%多聚賴氨酸包被處

理玻片。

2、5/0%正常山羊血清封閉液，用PBS配。

3、3%牛血清白蛋白(BSA),用PBS配。

4、0、01MPH7、4PBS

5、1%BSA-PBS(含0、05%Tween20)

6、AEC底物

⑴底物緩沖液(20X)PH4、6

醋酸(分子量60、6)30、6ml

Triton-100

醋酸鈉3H20(分子量136、1)66、68克

加蒸儲水到960mL調(diào)PH到4、6,最后加蒸儲水到總體積

1000ml

(2)AEC(20X)

AEC15mg/ml,溶在DMF(二甲基甲酰胺,分子式

HCOH(CH3)2分子量73、10中)

(3)0、6%H2O2(20X)

臨用時,(1)(2)(3)各503,在1ml雙蒸像水中混勻30分鐘內(nèi)有

效。

7、DAB(即DAB-4HCL)

(1)1、5克DAB在100ml水溶液中(20X)

(2)1MTris(20X),用HCL調(diào)PH到7、4

⑴⑵⑶各滴加入1ml二蒸水中,新鮮配，避光,30分鐘內(nèi)有效。

溶解后(可加熱到500C),加水合氯醛50克(水合氯醛Chloral

Hydrate,分子量165、4),枸椽酸1克，充分溶解,于棕色瓶中，

室溫或40C保存。

8、蘇木素復(fù)染液

蘇木素1克

碘酸鈉0、2克

鉀磯50克

水1000ml

9、含10%及2%小牛血清得DMEM培養(yǎng)液。

10、3%H2O2:30%H2O21份，加9份雙蒸水，臨用時配。

11、細(xì)胞抗原玻片及96孔細(xì)胞抗原板(見ICCprotocol04)

12、封片液:1克明膠，溶于30ml350C水中，加入35ml

甘油(或用甘油封片)與650mg石碳酸(先溶于0、6ml水中)。

二、細(xì)胞內(nèi)源過氧化物酶阻斷(使用HRP標(biāo)記二抗或SP法時

必須阻斷)

1、從冰箱取出細(xì)胞片或細(xì)胞板，置室溫或370C10-15分鐘，

使恢復(fù)溫度。

2、加3%H2O2,細(xì)胞片20ul/孔,培養(yǎng)板lOOul/孔,使充分覆蓋住

細(xì)胞。

3、室溫10分鐘后，甩掉H2O2,用PBS輕輕淋洗2分鐘。用

濾紙吸干細(xì)胞周圍水份,96孔在濾水紙上扣干,但注意保持細(xì)

胞濕潤。三、封閉

細(xì)胞片用5-10%正常山羊血清（20ml/孔），細(xì)胞板用

2-5%BSA（PBS配制）100ul/孔，置370C孵育30分鐘后甩掉封

閉液,不洗。四、免疫化學(xué)染色

1、分別加一抗與所有對照一抗，細(xì)胞法10-20ul/孔,細(xì)胞板

50山/孔，使充分覆蓋細(xì)胞。37℃1小時或4c冰箱過夜；

2、棄去一抗，如為細(xì)胞涂片用PBST輕輕簡單淋洗1次后，浸

于100mL含PBST洗杯，漂洗（最好在慢速搖床上）3-5分鐘，轉(zhuǎn)

入第二杯PBS（1000ml）,如上法漂洗3-5分鐘。擦干細(xì)胞片周

圍水分,96孔板則倒掉一抗后，每孔加滿PBST在搖床上搖洗

3-5分鐘后倒掉,在濾紙上扣干，但保持細(xì)胞濕潤，反復(fù)3-4次；

3、加S、P（S、P法，即放大法）

⑴加已優(yōu)選好得濃度得Biotin標(biāo)記二抗,細(xì)胞片103/孔，細(xì)胞

板50ul/孔，使充分復(fù)蓋細(xì)胞。37℃溫與孵育30分鐘；

⑵按免疫化學(xué)染色2所述方法洗滌與擦干；

（3）加1已優(yōu)選好濃度得S、P,用量同（1）,37℃孵

育30分鐘后按免疫化學(xué)染色2法洗滌及擦

干；

4、間接法加二抗（不放大法）

方法同S、P法,但不用Biotin標(biāo)記二抗,而改用HRP直接標(biāo)

記二抗。并省略⑶步驟；

5、加底物顯色

（1）、加足量得AEC顯色液，充分覆蓋細(xì)胞層，細(xì)胞玻片20ul/

孔，板50ul/孔，置于37℃恒溫箱孵育5-10分鐘,一般在顯微鏡

卜根據(jù)結(jié)果顏色得呈現(xiàn)情況掌握染色時間，以得到滿意得結(jié)

果（陽性對照顯色程度為+++;）,用自來水即

可終止反應(yīng)；

（2）、復(fù)染:蘇木素染液（使用時間最好不超過兩個月）加蘇木素

復(fù)染液1-2<1分鐘左右，在自來水龍頭下輕輕沖洗掉蘇木素,

再浸于PBS中約30秒鐘返藍(lán)色，最后在蒸儲水中漂洗。

6、封片

洗后細(xì)胞片擦去周圍水分，滴加1滴甘油一明膠封片液，加蓋

玻片，除去氣泡,用指甲油或樹膠封固玻片。五、結(jié)果判斷

KSHV陽性——誘導(dǎo)后BCBL-1細(xì)胞有10%-30%顯紅

色，強度不一,未誘導(dǎo)BCBL-1陽性細(xì)胞（1-30%）

陰性——誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)BCBL-1細(xì)胞完全不顯

色（排除邊緣效應(yīng)）

MCMV/HVMV陽性——感染病毒得細(xì)胞有病灶反應(yīng)，

顯紅色，強度不一,未感染細(xì)胞不顯紅色（排除非特異性染色）