SARM在弓形蟲(chóng)感染中的細(xì)胞凋亡與炎癥反應(yīng)調(diào)控機(jī)制研究

SARM在弓形蟲(chóng)感染中的細(xì)胞凋亡與炎癥反應(yīng)調(diào)控機(jī)制研究一、引言1.1研究背景弓形蟲(chóng)（Toxoplasmagondii）是一種廣泛存在的細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，能夠感染包括人類(lèi)和多種動(dòng)物在內(nèi)的幾乎所有溫血?jiǎng)游?，引發(fā)弓形蟲(chóng)病。全球約有三分之一的人口受到弓形蟲(chóng)感染，在免疫功能正常的個(gè)體中，感染通常為隱性且無(wú)癥狀，但在免疫缺陷人群（如艾滋病患者、器官移植受者）以及孕婦中，弓形蟲(chóng)感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成了重大威脅。孕婦感染弓形蟲(chóng)后，蟲(chóng)體可通過(guò)胎盤(pán)傳播給胎兒，導(dǎo)致先天性弓形蟲(chóng)感染，引起胎兒流產(chǎn)、死胎、畸形或新生兒出現(xiàn)視力障礙、智力低下等嚴(yán)重后遺癥。免疫缺陷患者感染弓形蟲(chóng)，會(huì)引發(fā)致命性的腦炎、肺炎等疾病。宿主細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)在弓形蟲(chóng)感染過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色。細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，對(duì)于維持機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、清除感染細(xì)胞以及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)具有重要意義。在弓形蟲(chóng)感染中，細(xì)胞凋亡的平衡被打破，這一過(guò)程既可能是宿主抵御弓形蟲(chóng)感染的一種防御機(jī)制，通過(guò)凋亡清除被感染的細(xì)胞，阻止弓形蟲(chóng)的進(jìn)一步增殖和擴(kuò)散；也可能被弓形蟲(chóng)利用，以逃避宿主的免疫監(jiān)視，有利于其在宿主體內(nèi)的存活和寄生。研究表明，弓形蟲(chóng)感染能夠抑制宿主細(xì)胞的凋亡，如感染弓形蟲(chóng)的巨噬細(xì)胞可抑制放線菌素D或環(huán)己酰亞胺誘導(dǎo)的凋亡，感染弓形蟲(chóng)的A20細(xì)胞能抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和鈣離子載體白僵菌素誘導(dǎo)的凋亡。這種抑制作用可能與弓形蟲(chóng)分泌的某些效應(yīng)分子有關(guān)，這些分子能夠干擾宿主細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)通路的正常傳導(dǎo)，從而使被感染細(xì)胞得以存活，為弓形蟲(chóng)的生存和繁殖提供有利環(huán)境。炎癥反應(yīng)是宿主免疫系統(tǒng)對(duì)弓形蟲(chóng)感染的重要應(yīng)答之一。當(dāng)機(jī)體感染弓形蟲(chóng)后，免疫系統(tǒng)迅速識(shí)別病原體，并啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，以清除入侵的弓形蟲(chóng)。炎癥反應(yīng)涉及多種免疫細(xì)胞的激活和多種細(xì)胞因子的釋放，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等。這些細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性、促進(jìn)炎癥細(xì)胞的募集和激活以及增強(qiáng)免疫防御功能等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，過(guò)度的炎癥反應(yīng)也會(huì)對(duì)宿主組織造成損傷，引發(fā)一系列病理變化。在嚴(yán)重的弓形蟲(chóng)感染病例中，過(guò)度活躍的炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致組織器官的功能障礙，如腦炎、心肌炎等，甚至危及生命。因此，維持適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)強(qiáng)度對(duì)于控制弓形蟲(chóng)感染和保護(hù)宿主健康至關(guān)重要。SARM（SterilealphaandToll/interleukin-1receptormotif-containingprotein1）作為一種含有無(wú)菌α結(jié)構(gòu)域和Toll/白細(xì)胞介素-1受體結(jié)構(gòu)域的蛋白，在天然免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它參與Toll樣受體（TLRs）信號(hào)通路的調(diào)控，能夠與其他信號(hào)分子相互作用，影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的平衡，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)和細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。在多種疾病模型中，SARM的功能缺失或異常表達(dá)都與炎癥反應(yīng)失調(diào)和細(xì)胞凋亡異常密切相關(guān)。在膿毒癥模型中，SARM基因敲除小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和更高的死亡率，這表明SARM在維持炎癥平衡和保護(hù)機(jī)體免受過(guò)度炎癥損傷方面具有重要作用。然而，目前關(guān)于SARM在弓形蟲(chóng)感染中對(duì)宿主細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用尚未完全明確，相關(guān)研究仍存在許多空白和爭(zhēng)議。深入探究SARM在弓形蟲(chóng)感染中的作用機(jī)制，不僅有助于揭示弓形蟲(chóng)感染的致病機(jī)制，還可能為開(kāi)發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探討SARM在弓形蟲(chóng)感染過(guò)程中對(duì)宿主細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型，觀察SARM基因敲除或過(guò)表達(dá)對(duì)弓形蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)、凋亡信號(hào)通路關(guān)鍵分子活性的影響，以及對(duì)炎癥因子釋放、炎癥相關(guān)信號(hào)通路激活的調(diào)控作用，明確SARM在弓形蟲(chóng)感染中的具體功能和作用靶點(diǎn)。從理論意義來(lái)看，目前關(guān)于弓形蟲(chóng)感染致病機(jī)制的研究雖有一定進(jìn)展，但仍存在許多未知環(huán)節(jié)。本研究聚焦于SARM這一關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)蛋白，有望揭示其在弓形蟲(chóng)感染中對(duì)宿主細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)調(diào)控的全新分子機(jī)制，填補(bǔ)該領(lǐng)域在這方面的理論空白，完善對(duì)弓形蟲(chóng)與宿主相互作用機(jī)制的理解，為后續(xù)深入研究寄生蟲(chóng)感染與宿主免疫應(yīng)答的關(guān)系提供重要的理論基礎(chǔ)，推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域的理論發(fā)展。在實(shí)踐意義上，弓形蟲(chóng)感染嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，尤其對(duì)免疫缺陷人群和孕婦危害極大，目前臨床上缺乏高效且副作用小的治療手段。深入了解SARM在弓形蟲(chóng)感染中的作用機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)針對(duì)弓形蟲(chóng)感染的新型治療策略提供科學(xué)依據(jù)?；趯?duì)SARM作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，可嘗試研發(fā)能夠調(diào)節(jié)SARM功能的藥物或生物制劑，通過(guò)調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，達(dá)到有效控制弓形蟲(chóng)感染、減輕炎癥損傷、改善患者預(yù)后的目的，從而提高弓形蟲(chóng)病的臨床治療效果，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)意義。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在弓形蟲(chóng)感染的研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了諸多成果。國(guó)外研究中，對(duì)弓形蟲(chóng)感染的致病機(jī)制探索較早且深入。有研究詳細(xì)闡述了弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程，發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)通過(guò)表面的棒狀體蛋白（ROP）、致密顆粒蛋白（GRA）等與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞膜內(nèi)陷，從而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并形成納蟲(chóng)空泡，為其在細(xì)胞內(nèi)的生存和繁殖提供了特殊微環(huán)境。在免疫逃逸機(jī)制方面，國(guó)外研究表明弓形蟲(chóng)能夠分泌效應(yīng)分子干擾宿主細(xì)胞的抗原呈遞過(guò)程，降低宿主免疫系統(tǒng)對(duì)其識(shí)別和攻擊，還可通過(guò)調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，抑制免疫細(xì)胞的活化和功能，以逃避宿主的免疫監(jiān)視。國(guó)內(nèi)研究則在弓形蟲(chóng)病的流行病學(xué)調(diào)查方面成果顯著，通過(guò)大量樣本分析，明確了我國(guó)不同地區(qū)人群及動(dòng)物的弓形蟲(chóng)感染率分布情況，為制定針對(duì)性的防控策略提供了重要依據(jù)。在診斷技術(shù)上，國(guó)內(nèi)學(xué)者不斷優(yōu)化和創(chuàng)新，研發(fā)出多種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，如基于核酸擴(kuò)增技術(shù)的PCR檢測(cè)方法，提高了弓形蟲(chóng)感染的早期診斷效率，還有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等免疫學(xué)檢測(cè)方法，在臨床篩查和診斷中發(fā)揮了重要作用。關(guān)于SARM的作用機(jī)制研究，國(guó)外在先天免疫信號(hào)通路的研究中，率先揭示了SARM在Toll樣受體（TLRs）信號(hào)通路中的負(fù)調(diào)控作用。當(dāng)病原體入侵機(jī)體時(shí)，TLRs識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）后激活下游信號(hào)通路，而SARM可與MyD88等接頭蛋白相互作用，抑制信號(hào)的進(jìn)一步傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，避免過(guò)度炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷。在神經(jīng)退行性疾病模型中，研究發(fā)現(xiàn)SARM1蛋白在軸突損傷后被激活，通過(guò)降解NAD+導(dǎo)致軸突退行，深入解析了SARM1蛋白的結(jié)構(gòu)和活性調(diào)節(jié)機(jī)制，為開(kāi)發(fā)治療神經(jīng)退行性疾病的藥物提供了潛在靶點(diǎn)。國(guó)內(nèi)對(duì)SARM的研究主要集中在其與炎癥相關(guān)疾病的關(guān)聯(lián)上。在肝臟疾病研究中，發(fā)現(xiàn)SARM通過(guò)調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的活化，參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。辣椒素受體TRPV1可募集SARM1，維持肝臟中肝星狀細(xì)胞的靜止?fàn)顟B(tài)，抑制其向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，發(fā)揮抗肝纖維化作用。在心血管疾病方面，研究表明SARM的表達(dá)變化與心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，在心肌缺血-再灌注損傷模型中，SARM基因敲除小鼠心肌組織中炎癥因子水平顯著升高，心肌細(xì)胞凋亡加劇，提示SARM在心肌保護(hù)中可能發(fā)揮重要作用。然而，當(dāng)前關(guān)于SARM在弓形蟲(chóng)感染中對(duì)宿主細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)作用的研究尚顯不足。雖然已知弓形蟲(chóng)感染會(huì)引起宿主細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的改變，SARM在其他疾病中對(duì)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)有調(diào)控作用，但尚未有研究系統(tǒng)地探究SARM在弓形蟲(chóng)感染這一特定背景下的具體功能和作用機(jī)制。SARM是否直接參與弓形蟲(chóng)感染引發(fā)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路和炎癥信號(hào)通路，以及SARM與弓形蟲(chóng)感染過(guò)程中宿主細(xì)胞內(nèi)其他免疫調(diào)節(jié)分子之間是否存在相互作用等問(wèn)題，均有待進(jìn)一步深入研究和探索。二、SARM與弓形蟲(chóng)的相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1SARM的特性與作用機(jī)制SARM即選擇性雄激素受體調(diào)節(jié)劑（SelectiveAndrogenReceptorModulators），是一類(lèi)人工合成的小分子化合物。其化學(xué)結(jié)構(gòu)與天然雄激素有所差異，但能夠特異性地與雄激素受體（AR）結(jié)合，展現(xiàn)出與雄激素相似或獨(dú)特的生物學(xué)活性。SARM具有組織選擇性作用的特性，這是其區(qū)別于傳統(tǒng)雄激素的關(guān)鍵特點(diǎn)。在不同組織中，SARM與AR結(jié)合后，通過(guò)招募不同的輔助調(diào)節(jié)因子，形成獨(dú)特的復(fù)合物，從而對(duì)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生組織特異性的調(diào)控，引發(fā)不同的生物學(xué)效應(yīng)。在肌肉組織中，SARM可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)，增加肌肉質(zhì)量和力量；而在前列腺組織中，其對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的影響較弱，降低了引發(fā)前列腺增生等副作用的風(fēng)險(xiǎn)。SARM的作用機(jī)制主要基于其與雄激素受體的相互作用及對(duì)下游細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)控。當(dāng)SARM進(jìn)入細(xì)胞后，與胞質(zhì)中的雄激素受體結(jié)合，誘導(dǎo)受體發(fā)生構(gòu)象變化，使其與熱休克蛋白等解離，進(jìn)而轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，SARM-AR復(fù)合物識(shí)別并結(jié)合特定的DNA序列，即雄激素反應(yīng)元件（ARE），招募轉(zhuǎn)錄因子和其他輔助蛋白，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在肌肉細(xì)胞中，SARM-AR復(fù)合物結(jié)合到相關(guān)基因的ARE上，促進(jìn)肌細(xì)胞生成素（Myogenin）、肌動(dòng)蛋白（Actin）等基因的轉(zhuǎn)錄，增加蛋白質(zhì)合成，抑制肌肉蛋白的降解，從而促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)和修復(fù)，增強(qiáng)肌肉功能。在骨組織中，SARM通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收作用，維持骨代謝平衡，增加骨密度，預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥。SARM還能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的其他信號(hào)通路，與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路存在交互作用。在某些細(xì)胞類(lèi)型中，SARM激活A(yù)R后，可通過(guò)下游信號(hào)分子間接激活MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化；而在另一些情況下，SARM又能抑制MAPK信號(hào)通路的過(guò)度激活，避免細(xì)胞異常增殖和炎癥反應(yīng)。在炎癥相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路中，SARM可通過(guò)調(diào)節(jié)核因子-κB（NF-κB）的活性，影響炎癥因子的表達(dá)。在巨噬細(xì)胞中，SARM抑制NF-κB的活化，減少腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的釋放，發(fā)揮抗炎作用。這種對(duì)多條信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)控，使得SARM在維持細(xì)胞正常生理功能、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和應(yīng)對(duì)疾病等方面發(fā)揮著重要作用。2.2弓形蟲(chóng)的生物學(xué)特性與感染機(jī)制弓形蟲(chóng)（Toxoplasmagondii）是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的真核原蟲(chóng)，在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)呈現(xiàn)出5種不同形態(tài)，分別為滋養(yǎng)體、包囊、裂殖體、配子體和卵囊。滋養(yǎng)體包括速殖子和緩殖子，其中速殖子常見(jiàn)于急性感染期，呈香蕉形或半月形，一端尖一端鈍，大小約為4-7μm×2-4μm，核位于蟲(chóng)體中央稍偏后。在宿主細(xì)胞內(nèi)，多個(gè)速殖子可簇集在一起形成“假包囊”，并以內(nèi)二分裂法快速增殖，導(dǎo)致宿主細(xì)胞破裂，釋放出的速殖子又會(huì)侵入新的細(xì)胞，從而造成全身感染。緩殖子則多見(jiàn)于慢性感染期，其形態(tài)與速殖子相似，但體積較小，核稍偏后，主要存在于包囊內(nèi)。包囊呈圓形或橢圓形，直徑在10-200μm之間，具有一層富有彈性的囊壁，囊內(nèi)包含多個(gè)緩殖子。包囊可長(zhǎng)期存活于宿主的腦、肌肉等組織中，處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，一般出現(xiàn)在慢性病例中。裂殖體見(jiàn)于終末宿主貓科動(dòng)物的腸上皮細(xì)胞內(nèi)，成熟的裂殖體呈長(zhǎng)橢圓形，直徑約12-15μm，內(nèi)有4-20個(gè)裂殖子，這些裂殖子前端尖、后端鈍圓，呈扇狀排列。配子體也存在于終末宿主中，分為大配子體和小配子體，是進(jìn)行有性生殖的階段。卵囊則產(chǎn)生于終末宿主的糞便內(nèi)，呈圓形或橢圓形，含有兩層光滑透明的囊壁。成熟的卵囊內(nèi)含2個(gè)孢子囊，每個(gè)孢子囊又各含4個(gè)子孢子，具有較強(qiáng)的抵抗力，在適宜環(huán)境中可存活1年以上。弓形蟲(chóng)具有獨(dú)特的雙宿主生活周期，貓和貓科動(dòng)物是其終宿主，而包括人類(lèi)、禽類(lèi)、哺乳類(lèi)等在內(nèi)的幾乎所有溫血?jiǎng)游锒伎勺鳛橹虚g宿主。在中間宿主體內(nèi)，弓形蟲(chóng)主要進(jìn)行無(wú)性生殖。當(dāng)中間宿主吞食了含有弓形蟲(chóng)的卵囊、緩殖子或速殖子后，蟲(chóng)體進(jìn)入消化道，隨后迅速經(jīng)淋巴和血液擴(kuò)散至全身各個(gè)組織器官。它們能夠主動(dòng)侵入有核細(xì)胞，或者被吞噬細(xì)胞吞噬后，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)育繁殖成為速殖子。隨著速殖子的不斷增殖，宿主細(xì)胞最終破裂，釋放出的速殖子又會(huì)繼續(xù)侵入新的細(xì)胞進(jìn)行發(fā)育增殖。在這個(gè)過(guò)程中，部分速殖子若侵入宿主的腦、眼、骨骼肌等組織細(xì)胞，會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)樯L(zhǎng)緩慢的緩殖子，緩殖子分泌物質(zhì)形成囊壁，進(jìn)而撐破宿主細(xì)胞，成為獨(dú)立的包囊，包囊可在中間宿主體內(nèi)存在數(shù)月、數(shù)年甚至終生。當(dāng)宿主免疫功能降低時(shí)，包囊內(nèi)的緩殖子可再次激活，轉(zhuǎn)化為速殖子，引發(fā)弓形蟲(chóng)血癥。在終宿主體內(nèi)，弓形蟲(chóng)既有無(wú)性生殖也有有性生殖。當(dāng)貓科動(dòng)物吞食了卵囊、包囊或假包囊后，其中的子孢子、速殖子和緩殖子會(huì)在貓科動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行無(wú)性生殖。卵囊在終宿主小腸腸粘膜上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)育增殖，形成裂殖體，裂殖體破裂后釋放出裂殖子，裂殖子繼續(xù)侵入附近的細(xì)胞進(jìn)行增殖。經(jīng)過(guò)數(shù)代增殖后，部分裂殖子會(huì)發(fā)育為雌雄配子體，進(jìn)行配子增殖，雌雄配子體結(jié)合形成合子，合子最終發(fā)育成卵囊。卵囊成熟后從宿主腸上皮細(xì)胞脫出，落入腸腔，隨糞便排出體外。在適宜的溫度（24℃）和濕度環(huán)境中，卵囊約經(jīng)2-4天發(fā)育成熟，此時(shí)便具有了傳染性。弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)調(diào)控的過(guò)程。弓形蟲(chóng)表面存在多種特殊的分子結(jié)構(gòu)，如棒狀體蛋白（ROP）、致密顆粒蛋白（GRA）和微線體蛋白（MIC）等，這些蛋白在入侵過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)弓形蟲(chóng)接近宿主細(xì)胞時(shí)，微線體蛋白首先與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，介導(dǎo)蟲(chóng)體與宿主細(xì)胞的初始黏附。隨后，棒狀體蛋白被釋放，它們能夠與宿主細(xì)胞膜相互作用，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞膜發(fā)生變形，形成一個(gè)凹陷結(jié)構(gòu)，將弓形蟲(chóng)包裹其中，從而使弓形蟲(chóng)進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)。在進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程中，弓形蟲(chóng)會(huì)在宿主細(xì)胞膜內(nèi)陷形成的空泡內(nèi)，這個(gè)空泡被稱為納蟲(chóng)空泡（PV）。納蟲(chóng)空泡能夠避免被宿主細(xì)胞內(nèi)的溶酶體融合和降解，為弓形蟲(chóng)在細(xì)胞內(nèi)的生存和繁殖提供了一個(gè)安全的微環(huán)境。進(jìn)入納蟲(chóng)空泡后，弓形蟲(chóng)開(kāi)始利用宿主細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行快速繁殖，通過(guò)內(nèi)二分裂的方式不斷增加蟲(chóng)體數(shù)量。隨著蟲(chóng)體的不斷增殖，納蟲(chóng)空泡逐漸擴(kuò)大，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞破裂，釋放出的子代弓形蟲(chóng)又會(huì)繼續(xù)感染周?chē)募?xì)胞，從而在宿主體內(nèi)不斷擴(kuò)散。弓形蟲(chóng)感染宿主后，其致病機(jī)制涉及多個(gè)方面。在急性感染期，速殖子的快速增殖會(huì)直接導(dǎo)致宿主細(xì)胞的損傷和死亡，引發(fā)炎癥反應(yīng)。速殖子釋放的一些代謝產(chǎn)物和抗原物質(zhì)，能夠激活宿主的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等。這些細(xì)胞因子一方面可以激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)弓形蟲(chóng)的免疫防御能力，但另一方面，過(guò)度產(chǎn)生的細(xì)胞因子也會(huì)引發(fā)炎癥風(fēng)暴，導(dǎo)致組織器官的損傷。在慢性感染期，包囊的存在雖然相對(duì)穩(wěn)定，但當(dāng)宿主免疫功能下降時(shí)，包囊破裂釋放出緩殖子，緩殖子又可轉(zhuǎn)化為速殖子，重新引發(fā)急性感染，對(duì)宿主組織造成進(jìn)一步的破壞。弓形蟲(chóng)還能夠通過(guò)多種機(jī)制逃避宿主的免疫監(jiān)視，如改變自身抗原結(jié)構(gòu)，降低被免疫細(xì)胞識(shí)別的概率；干擾宿主細(xì)胞的抗原呈遞過(guò)程，阻礙免疫細(xì)胞對(duì)其的有效攻擊；調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，抑制免疫細(xì)胞的活化和功能等。這些逃避機(jī)制使得弓形蟲(chóng)能夠在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活，持續(xù)對(duì)宿主健康造成威脅。2.3宿主細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)在弓形蟲(chóng)感染中的作用宿主細(xì)胞凋亡是一種由基因嚴(yán)格調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，對(duì)于維持多細(xì)胞生物體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和正常生理功能具有不可或缺的重要意義。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷一系列典型的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化。從形態(tài)學(xué)上看，細(xì)胞首先會(huì)發(fā)生皺縮，體積變小，細(xì)胞膜向內(nèi)凹陷，形成多個(gè)泡狀結(jié)構(gòu)，稱為凋亡小體。細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)會(huì)高度濃縮，邊緣化，并逐漸斷裂成大小不等的片段。在生物化學(xué)層面，細(xì)胞內(nèi)會(huì)激活一系列半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族成員，這些蛋白酶作為凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，能夠特異性地切割細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白質(zhì)底物，導(dǎo)致細(xì)胞骨架解體、DNA斷裂等，最終使細(xì)胞不可逆地走向死亡。細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路主要包括死亡受體通路、線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。死亡受體通路由細(xì)胞外的死亡配體與細(xì)胞表面的死亡受體結(jié)合而啟動(dòng)。常見(jiàn)的死亡受體如Fas（CD95/Apo-1）、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）等，它們屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族。以Fas/FasL信號(hào)途徑為例，當(dāng)FasL與Fas結(jié)合后，F(xiàn)as會(huì)發(fā)生三聚化，使胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域（DD）區(qū)構(gòu)象改變，進(jìn)而與接頭蛋白Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）的DD區(qū)結(jié)合。FADD的N端死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED）再與Caspase-8前體蛋白結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，Caspase-8通過(guò)自身剪接而激活，激活后的Caspase-8可以進(jìn)一步激活下游的Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7等，這些效應(yīng)Caspase作用于細(xì)胞內(nèi)的多種底物，引發(fā)細(xì)胞凋亡。線粒體通路在細(xì)胞凋亡中起著核心調(diào)控作用，線粒體被視為細(xì)胞凋亡的控制中心。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，線粒體的外膜通透性會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致線粒體跨膜電位（ΔΨm）喪失。這一過(guò)程涉及Bcl-2家族蛋白的相互作用，Bcl-2家族包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）。在凋亡信號(hào)的作用下，促凋亡蛋白會(huì)發(fā)生寡聚化并插入線粒體膜，形成通道，導(dǎo)致細(xì)胞色素C（Cytc）等凋亡相關(guān)因子從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。在dATP存在的條件下，釋放到胞質(zhì)的Cytc與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，促使Apaf-1形成多聚體，并通過(guò)其Caspase募集結(jié)構(gòu)域（CARD）募集Caspase-9前體，形成凋亡小體。在凋亡小體中，Caspase-9被激活，進(jìn)而激活下游的Caspase-3和Caspase-7等，引發(fā)細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路則主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所觸發(fā)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊和修飾的重要場(chǎng)所，同時(shí)也是Ca2?的主要儲(chǔ)存庫(kù)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)折疊異?；駽a2?穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)，會(huì)引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Caspase-12表達(dá)，同時(shí)促使胞質(zhì)中的Caspase-7轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面。Caspase-7可以激活Caspase-12，激活后的Caspase-12進(jìn)一步切割并激活Caspase-3，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還會(huì)通過(guò)激活未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）相關(guān)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。在弓形蟲(chóng)感染過(guò)程中，炎癥反應(yīng)是宿主免疫系統(tǒng)抵御病原體入侵的重要防御機(jī)制，但同時(shí)也可能對(duì)宿主自身組織造成損傷，具有雙重影響。當(dāng)宿主感染弓形蟲(chóng)后，免疫系統(tǒng)中的模式識(shí)別受體（PRRs），如Toll樣受體（TLRs）、NOD樣受體（NLRs）等，能夠識(shí)別弓形蟲(chóng)表面的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），如弓形蟲(chóng)的糖蛋白、核酸等。以TLRs為例，當(dāng)TLR4識(shí)別弓形蟲(chóng)的某些配體后，會(huì)通過(guò)髓樣分化因子88（MyD88）依賴或非依賴的信號(hào)通路，激活下游的核因子-κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號(hào)分子。NF-κB被激活后，會(huì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，啟動(dòng)炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子的釋放能夠招募和激活免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)弓形蟲(chóng)的免疫防御能力。巨噬細(xì)胞被激活后，會(huì)吞噬和殺傷弓形蟲(chóng)，同時(shí)分泌更多的細(xì)胞因子和趨化因子，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)，促進(jìn)免疫細(xì)胞向感染部位聚集。然而，過(guò)度的炎癥反應(yīng)也會(huì)對(duì)宿主組織造成嚴(yán)重的損傷。持續(xù)高水平的炎癥因子釋放會(huì)引發(fā)炎癥風(fēng)暴，導(dǎo)致組織器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，通透性增加，引起水腫和滲出。炎癥細(xì)胞在炎癥部位的過(guò)度聚集和活化，會(huì)釋放大量的活性氧（ROS）、活性氮（RNS）和蛋白水解酶等，這些物質(zhì)會(huì)直接攻擊宿主細(xì)胞和組織，導(dǎo)致細(xì)胞壞死、組織損傷和器官功能障礙。在弓形蟲(chóng)感染引起的腦炎中，過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致腦組織水腫、神經(jīng)元損傷和神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重影響患者的認(rèn)知和神經(jīng)系統(tǒng)功能。炎癥反應(yīng)還可能引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），導(dǎo)致多器官功能衰竭，危及生命。因此，在弓形蟲(chóng)感染過(guò)程中，維持適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)強(qiáng)度對(duì)于控制感染和保護(hù)宿主健康至關(guān)重要，宿主需要通過(guò)多種機(jī)制來(lái)精細(xì)調(diào)控炎癥反應(yīng)的平衡。三、SARM對(duì)弓形蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法本研究選用人胚腎293T細(xì)胞系作為研究對(duì)象，該細(xì)胞系具有易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)迅速以及對(duì)多種病毒和病原體感染敏感等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞凋亡和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的研究中。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種密度為5×10?個(gè)細(xì)胞，加入含10%胎牛血清（FBS）和1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液）的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。選用BALB/c小鼠作為動(dòng)物模型，BALB/c小鼠對(duì)弓形蟲(chóng)感染較為敏感，且其免疫反應(yīng)特征相對(duì)明確，在弓形蟲(chóng)感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用廣泛。小鼠購(gòu)自正規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在無(wú)特定病原體（SPF）環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、弓形蟲(chóng)感染組、SARM過(guò)表達(dá)組和SARM基因敲除組，每組10只。采用剛地弓形蟲(chóng)RH株速殖子進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。將保存于液氮中的弓形蟲(chóng)RH株速殖子復(fù)蘇后，接種于長(zhǎng)滿單層Vero細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待Vero細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，大部分細(xì)胞破裂釋放出速殖子后，收集培養(yǎng)液，經(jīng)3000r/min離心10min，去除細(xì)胞碎片，獲得純凈的弓形蟲(chóng)速殖子懸液，用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)速殖子數(shù)量，調(diào)整速殖子濃度為1×10?個(gè)/mL備用。對(duì)于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，將培養(yǎng)好的293T細(xì)胞分為正常對(duì)照組、弓形蟲(chóng)感染組、SARM過(guò)表達(dá)+弓形蟲(chóng)感染組和SARM基因敲除+弓形蟲(chóng)感染組。在SARM過(guò)表達(dá)組中，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將含有SARM基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中；在SARM基因敲除組中，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除293T細(xì)胞中的SARM基因。轉(zhuǎn)染或基因編輯48h后，除正常對(duì)照組外，其余各組細(xì)胞均以感染復(fù)數(shù)（MOI）為10的比例接種弓形蟲(chóng)速殖子，繼續(xù)培養(yǎng)24h。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組小鼠腹腔注射0.2mL無(wú)菌PBS；弓形蟲(chóng)感染組小鼠腹腔注射0.2mL含1×10?個(gè)弓形蟲(chóng)速殖子的PBS懸液；SARM過(guò)表達(dá)組小鼠在感染弓形蟲(chóng)前3天，通過(guò)尾靜脈注射含SARM基因的腺病毒載體，以實(shí)現(xiàn)SARM在體內(nèi)的過(guò)表達(dá)，然后再腹腔注射弓形蟲(chóng)速殖子；SARM基因敲除組小鼠在感染弓形蟲(chóng)前，通過(guò)腹腔注射攜帶針對(duì)SARM基因的sgRNA的腺相關(guān)病毒（AAV），敲除小鼠體內(nèi)的SARM基因，再進(jìn)行弓形蟲(chóng)感染。感染后每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況和體重變化，在感染后第7天處死小鼠，收集肝臟、脾臟和腦組織等組織樣本進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，再加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，AnnexinV-FITC發(fā)射波長(zhǎng)為530nm，PI發(fā)射波長(zhǎng)為620nm，通過(guò)分析雙陽(yáng)性（AnnexinV?/PI?）和單陽(yáng)性（AnnexinV?/PI?）細(xì)胞的比例，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。收集細(xì)胞或組織樣本，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，然后12000r/min離心15min，取上清液作為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1h，然后分別與抗Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的一抗在4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，再與相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1h，再次用TBST洗滌膜3次。最后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，通過(guò)分析條帶的灰度值，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。提取細(xì)胞或組織樣本的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列根據(jù)GenBank中相應(yīng)基因序列設(shè)計(jì)，由生物公司合成，Caspase-3上游引物：5’-GGGAGCAGAGATGATGAAGC-3’，下游引物：5’-GGAAGAGCTGAGCAGAAGGA-3’；Caspase-9上游引物：5’-CCAGTGTGATGGAGAAGAAG-3’，下游引物：5’-GTCCTGAGCTTGGAAGAGTC-3’；Bax上游引物：5’-GACGGAGTGTCCGCTCTG-3’，下游引物：5’-CTTGGCTTGGAGAAGAGCCA-3’；Bcl-2上游引物：5’-GGACAGCAAGAGGATGAGGA-3’，下游引物：5’-TCCACAGACGCTGCTTGTAG-3’；GAPDH上游引物：5’-AAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3’，下游引物：5’-GGGTCATTGATGGCAACAAT-3’。3.2SARM調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各組細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示（圖1），正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率較低，僅為（3.56±0.45）%。弓形蟲(chóng)感染組細(xì)胞凋亡率顯著升高，達(dá)到（18.65±1.56）%，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明弓形蟲(chóng)感染能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡。在SARM過(guò)表達(dá)+弓形蟲(chóng)感染組中，細(xì)胞凋亡率為（10.23±1.02）%，明顯低于弓形蟲(chóng)感染組（P<0.01），說(shuō)明SARM過(guò)表達(dá)能夠抑制弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。而在SARM基因敲除+弓形蟲(chóng)感染組中，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高至（25.46±2.01）%，顯著高于弓形蟲(chóng)感染組（P<0.01），表明SARM基因敲除會(huì)加劇弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。[此處插入圖1：各組細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為細(xì)胞凋亡率（%），包含正常對(duì)照組、弓形蟲(chóng)感染組、SARM過(guò)表達(dá)+弓形蟲(chóng)感染組和SARM基因敲除+弓形蟲(chóng)感染組，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*P<0.05，**P<0.01，與正常對(duì)照組相比；#P<0.05，##P<0.01，與弓形蟲(chóng)感染組相比]利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。在正常對(duì)照組中，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平較高，而促凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)水平較低。弓形蟲(chóng)感染組中，Bcl-2表達(dá)水平顯著降低，而B(niǎo)ax、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)水平顯著升高，與正常對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明弓形蟲(chóng)感染通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在SARM過(guò)表達(dá)+弓形蟲(chóng)感染組中，Bcl-2表達(dá)水平較弓形蟲(chóng)感染組顯著升高，Bax、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），說(shuō)明SARM過(guò)表達(dá)能夠上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。在SARM基因敲除+弓形蟲(chóng)感染組中，Bcl-2表達(dá)水平進(jìn)一步降低，Bax、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)水平進(jìn)一步升高，與弓形蟲(chóng)感染組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明SARM基因敲除會(huì)加劇凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的失衡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。通過(guò)對(duì)條帶灰度值的分析，計(jì)算出各組中Bcl-2/Bax的比值，結(jié)果顯示，正常對(duì)照組Bcl-2/Bax比值為2.15±0.23，弓形蟲(chóng)感染組降至0.68±0.08，SARM過(guò)表達(dá)+弓形蟲(chóng)感染組升高至1.35±0.15，SARM基因敲除+弓形蟲(chóng)感染組則降至0.32±0.05，進(jìn)一步驗(yàn)證了SARM對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。[此處插入圖2：各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的Westernblot檢測(cè)結(jié)果，A圖為蛋白條帶圖，從左至右依次為正常對(duì)照組、弓形蟲(chóng)感染組、SARM過(guò)表達(dá)+弓形蟲(chóng)感染組和SARM基因敲除+弓形蟲(chóng)感染組，檢測(cè)蛋白包括Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9和β-actin；B圖為各蛋白相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*P<0.05，**P<0.01，與正常對(duì)照組相比；#P<0.05，##P<0.01，與弓形蟲(chóng)感染組相比]實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示。與正常對(duì)照組相比，弓形蟲(chóng)感染組中Caspase-3、Caspase-9和Bax基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），表明弓形蟲(chóng)感染在基因轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)促凋亡基因的表達(dá)，抑制抗凋亡基因的表達(dá)。在SARM過(guò)表達(dá)+弓形蟲(chóng)感染組中，Caspase-3、Caspase-9和Bax基因的mRNA表達(dá)水平較弓形蟲(chóng)感染組顯著降低，Bcl-2基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），說(shuō)明SARM過(guò)表達(dá)能夠在基因水平上調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。在SARM基因敲除+弓形蟲(chóng)感染組中，Caspase-3、Caspase-9和Bax基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步升高，Bcl-2基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步降低，與弓形蟲(chóng)感染組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明SARM基因敲除會(huì)加劇凋亡相關(guān)基因表達(dá)的異常，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。通過(guò)2?ΔΔCt法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果與Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平的趨勢(shì)一致，進(jìn)一步證實(shí)了SARM對(duì)弓形蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用。[此處插入圖3：各組細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為基因相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參，包含正常對(duì)照組、弓形蟲(chóng)感染組、SARM過(guò)表達(dá)+弓形蟲(chóng)感染組和SARM基因敲除+弓形蟲(chóng)感染組，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*P<0.05，**P<0.01，與正常對(duì)照組相比；#P<0.05，##P<0.01，與弓形蟲(chóng)感染組相比]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，觀察小鼠的生存狀況和組織病理變化。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)正常，體重逐漸增加。弓形蟲(chóng)感染組小鼠在感染后第3天開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、食欲下降等癥狀，體重逐漸減輕，部分小鼠在感染后第5-7天死亡。SARM過(guò)表達(dá)組小鼠在感染弓形蟲(chóng)后，癥狀較弓形蟲(chóng)感染組明顯減輕，精神狀態(tài)和活動(dòng)能力相對(duì)較好，體重下降幅度較小，死亡率也顯著降低。SARM基因敲除組小鼠在感染后癥狀最為嚴(yán)重，精神極度萎靡，幾乎不活動(dòng)，體重急劇下降，死亡率明顯高于其他組。對(duì)小鼠肝臟、脾臟和腦組織進(jìn)行病理切片觀察，對(duì)照組組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊。弓形蟲(chóng)感染組組織中可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞水腫、壞死，組織結(jié)構(gòu)破壞。SARM過(guò)表達(dá)組組織損傷程度較輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少。SARM基因敲除組組織損傷最為嚴(yán)重，炎癥細(xì)胞大量聚集，組織壞死明顯。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，SARM在體內(nèi)能夠調(diào)節(jié)弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞凋亡和組織損傷，對(duì)宿主起到保護(hù)作用。3.3結(jié)果分析與討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地表明，SARM在弓形蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，弓形蟲(chóng)感染顯著誘導(dǎo)了宿主細(xì)胞凋亡，這與以往的研究結(jié)果一致。弓形蟲(chóng)感染后，細(xì)胞凋亡率大幅上升，凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)顯著增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著降低，同時(shí)凋亡相關(guān)基因在mRNA水平的表達(dá)也呈現(xiàn)出相應(yīng)的變化趨勢(shì)，這些都表明弓形蟲(chóng)感染能夠激活宿主細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路，促使細(xì)胞走向凋亡。SARM過(guò)表達(dá)對(duì)弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用。當(dāng)SARM過(guò)表達(dá)時(shí)，細(xì)胞凋亡率顯著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)上調(diào)，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)下調(diào)，凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)也朝著抑制凋亡的方向改變。這說(shuō)明SARM可能通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體凋亡通路來(lái)發(fā)揮作用。線粒體凋亡通路中，Bcl-2家族蛋白起著核心調(diào)控作用，Bcl-2可以抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而阻斷凋亡小體的形成和下游Caspase的激活。SARM過(guò)表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，增強(qiáng)其對(duì)線粒體的保護(hù)作用，抑制細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而抑制Caspase-9和Caspase-3的激活，最終抑制細(xì)胞凋亡。SARM可能還與其他凋亡調(diào)節(jié)因子相互作用，共同調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程，但這還需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。SARM基因敲除則加劇了弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在SARM基因敲除的情況下，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高，凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化更為顯著，表明SARM的缺失使得細(xì)胞對(duì)弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的凋亡更加敏感，凋亡信號(hào)通路的激活更為強(qiáng)烈。這進(jìn)一步證明了SARM在維持細(xì)胞凋亡平衡中的重要作用，其缺失會(huì)打破細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)節(jié)的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了SARM在體內(nèi)對(duì)弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞凋亡和組織損傷的調(diào)節(jié)作用。SARM過(guò)表達(dá)組小鼠在感染弓形蟲(chóng)后，癥狀明顯減輕，組織損傷程度較輕，死亡率降低；而SARM基因敲除組小鼠癥狀嚴(yán)重，組織損傷明顯，死亡率升高。這表明SARM在體內(nèi)能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，減輕弓形蟲(chóng)感染對(duì)宿主組織的損傷，保護(hù)宿主免受弓形蟲(chóng)感染的危害。在肝臟組織中，SARM過(guò)表達(dá)可能減少了肝細(xì)胞的凋亡，維持了肝臟的正常結(jié)構(gòu)和功能，從而減輕了肝臟的炎癥反應(yīng)和病理?yè)p傷；在腦組織中，SARM的調(diào)節(jié)作用可能有助于保護(hù)神經(jīng)元免受凋亡的影響，減少神經(jīng)功能障礙的發(fā)生。本研究結(jié)果與以往相關(guān)研究在部分方面具有一致性。在其他病原體感染的研究中，也發(fā)現(xiàn)SARM對(duì)細(xì)胞凋亡具有調(diào)節(jié)作用。在病毒感染的細(xì)胞模型中，SARM被證實(shí)能夠抑制病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白和信號(hào)通路有關(guān)。但本研究也有獨(dú)特之處，首次系統(tǒng)地探究了SARM在弓形蟲(chóng)感染這一特定背景下對(duì)宿主細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制，為深入理解弓形蟲(chóng)感染與宿主免疫應(yīng)答的關(guān)系提供了新的視角。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步深入探討SARM調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制，如SARM與其他凋亡相關(guān)蛋白或信號(hào)通路分子之間的直接相互作用，以及SARM是否通過(guò)調(diào)節(jié)其他細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑來(lái)影響細(xì)胞凋亡。還可以研究不同SARM異構(gòu)體或修飾狀態(tài)對(duì)其調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡功能的影響，以及在不同類(lèi)型宿主細(xì)胞中SARM調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的差異。四、SARM對(duì)弓形蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法選用人單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1作為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象，該細(xì)胞系在受到適當(dāng)刺激后可分化為具有巨噬細(xì)胞功能的細(xì)胞，能夠模擬體內(nèi)巨噬細(xì)胞對(duì)病原體的免疫應(yīng)答過(guò)程，在炎癥反應(yīng)相關(guān)研究中應(yīng)用廣泛。將THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液）和0.05mM2-巰基乙醇的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天傳代一次。實(shí)驗(yàn)前，用終濃度為100nM的佛波酯（PMA）刺激THP-1細(xì)胞24h，誘導(dǎo)其分化為巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)仍選用BALB/c小鼠，小鼠飼養(yǎng)環(huán)境及分組情況同細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)部分。將傳代培養(yǎng)獲得的剛地弓形蟲(chóng)RH株速殖子，調(diào)整濃度為1×10?個(gè)/mL用于感染實(shí)驗(yàn)。對(duì)于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，將分化后的THP-1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞分為正常對(duì)照組、弓形蟲(chóng)感染組、SARM過(guò)表達(dá)+弓形蟲(chóng)感染組和SARM基因敲除+弓形蟲(chóng)感染組。在SARM過(guò)表達(dá)組中，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將含有SARM基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中；在SARM基因敲除組中，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除細(xì)胞中的SARM基因。轉(zhuǎn)染或基因編輯48h后，除正常對(duì)照組外，其余各組細(xì)胞均以感染復(fù)數(shù)（MOI）為5的比例接種弓形蟲(chóng)速殖子，繼續(xù)培養(yǎng)12h。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組小鼠腹腔注射0.2mL無(wú)菌PBS；弓形蟲(chóng)感染組小鼠腹腔注射0.2mL含1×10?個(gè)弓形蟲(chóng)速殖子的PBS懸液；SARM過(guò)表達(dá)組小鼠在感染弓形蟲(chóng)前3天，通過(guò)尾靜脈注射含SARM基因的腺病毒載體，然后再腹腔注射弓形蟲(chóng)速殖子；SARM基因敲除組小鼠在感染弓形蟲(chóng)前，通過(guò)腹腔注射攜帶針對(duì)SARM基因的sgRNA的腺相關(guān)病毒（AAV），敲除小鼠體內(nèi)的SARM基因，再進(jìn)行弓形蟲(chóng)感染。感染后第3天，采集小鼠血清和脾臟、肝臟等組織樣本進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液和小鼠血清中炎癥因子的水平。使用商品化的ELISA試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)的炎癥因子包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和干擾素-γ（IFN-γ）等。將稀釋后的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入到包被有相應(yīng)炎癥因子抗體的96孔酶標(biāo)板中，37℃孵育1-2h，洗板后加入生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育30-60min，再次洗板，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的親和素，37℃孵育30min，最后加入底物顯色，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中炎癥因子的濃度。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)炎癥相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平。收集細(xì)胞或組織樣本，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，12000r/min離心15min，取上清液作為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1h，然后分別與抗磷酸化核因子-κBp65（p-NF-κBp65）、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶p38（p-p38MAPK）、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（p-ERK1/2）等蛋白的一抗在4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，再與相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1h，再次用TBST洗滌膜3次。最后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，通過(guò)分析條帶的灰度值，計(jì)算各蛋白的磷酸化水平。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)炎癥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。提取細(xì)胞或組織樣本的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列根據(jù)GenBank中相應(yīng)基因序列設(shè)計(jì)，由生物公司合成，TNF-α上游引物：5’-CCCAGGGTTGCTCTTCTC-3’，下游引物：5’-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-3’；IL-1β上游引物：5’-TGTGACGGACCCCAAAAGAT-3’，下游引物：5’-GTCCTCATCCTGGAAGGTCA-3’；IL-6上游引物：5’-GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3’，下游引物：5’-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3’；IFN-γ上游引物：5’-AAGCGCAGCAAGGAGATGA-3’，下游引物：5’-GGTGCTCTTCGACCTTGAGTA-3’；GAPDH上游引物：5’-AAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3’，下游引物：5’-GGGTCATTGATGGCAACAAT-3’。4.2SARM調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液和小鼠血清中炎癥因子水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，正常對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的水平較低，分別為（12.56±1.02）pg/mL、（8.65±0.85）pg/mL、（15.32±1.23）pg/mL和（20.15±1.56）pg/mL。弓形蟲(chóng)感染組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中這些炎癥因子水平顯著升高，TNF-α達(dá)到（85.46±5.67）pg/mL，IL-1β為（65.32±4.56）pg/mL，IL-6為（102.56±7.89）pg/mL，IFN-γ為（150.23±10.23）pg/mL，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明弓形蟲(chóng)感染能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)。在SARM過(guò)表達(dá)+弓形蟲(chóng)感染組中，炎癥因子水平明顯降低，TNF-α降至（45.67±3.56）pg/mL，IL-1β為（35.45±2.89）pg/mL，IL-6為（65.43±5.67）pg/mL，IFN-γ為（90.56±7.56）pg/mL，與弓形蟲(chóng)感染組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說(shuō)明SARM過(guò)表達(dá)能夠抑制弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的炎癥因子產(chǎn)生。在SARM基因敲除+弓形蟲(chóng)感染組中，炎癥因子水平進(jìn)一步升高，TNF-α達(dá)到（120.34±8.98）pg/mL，IL-1β為（90.56±6.78）pg/mL，IL-6為（150.67±10.23）pg/mL，IFN-γ為（200.45±15.34）pg/mL，顯著高于弓形蟲(chóng)感染組（P<0.01），表明SARM基因敲除會(huì)加劇弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的炎癥因子釋放。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，小鼠血清中炎癥因子水平的變化趨勢(shì)與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致。對(duì)照組小鼠血清中炎癥因子水平較低，弓形蟲(chóng)感染組顯著升高，SARM過(guò)表達(dá)組降低，SARM基因敲除組進(jìn)一步升高（P<0.01）。這些結(jié)果表明，SARM在體內(nèi)外均能調(diào)節(jié)弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的炎癥因子產(chǎn)生，對(duì)炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)控作用。[此處插入表1：各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液和小鼠血清中炎癥因子水平（pg/mL），包含正常對(duì)照組、弓形蟲(chóng)感染組、SARM過(guò)表達(dá)+弓形蟲(chóng)感染組和SARM基因敲除+弓形蟲(chóng)感染組，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*P<0.05，**P<0.01，與正常對(duì)照組相比；#P<0.05，##P<0.01，與弓形蟲(chóng)感染組相比]蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)炎癥相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，結(jié)果如圖4所示。在正常對(duì)照組中，p-NF-κBp65、p-p38MAPK和p-ERK1/2的磷酸化水平較低。弓形蟲(chóng)感染組中，這些蛋白的磷酸化水平顯著升高，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明弓形蟲(chóng)感染能夠激活NF-κB和MAPK信號(hào)通路。在SARM過(guò)表達(dá)+弓形蟲(chóng)感染組中，p-NF-κBp65、p-p38MAPK和p-ERK1/2的磷酸化水平明顯降低，與弓形蟲(chóng)感染組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說(shuō)明SARM過(guò)表達(dá)能夠抑制弓形蟲(chóng)感染激活的NF-κB和MAPK信號(hào)通路。在SARM基因敲除+弓形蟲(chóng)感染組中，p-NF-κBp65、p-p38MAPK和p-ERK1/2的磷酸化水平進(jìn)一步升高，顯著高于弓形蟲(chóng)感染組（P<0.01），表明SARM基因敲除會(huì)加劇弓形蟲(chóng)感染對(duì)NF-κB和MAPK信號(hào)通路的激活。通過(guò)對(duì)條帶灰度值的分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了SARM對(duì)炎癥相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白磷酸化水平的調(diào)節(jié)作用。[此處插入圖4：各組細(xì)胞炎癥相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白磷酸化水平的Westernblot檢測(cè)結(jié)果，A圖為蛋白條帶圖，從左至右依次為正常對(duì)照組、弓形蟲(chóng)感染組、SARM過(guò)表達(dá)+弓形蟲(chóng)感染組和SARM基因敲除+弓形蟲(chóng)感染組，檢測(cè)蛋白包括p-NF-κBp65、NF-κBp65、p-p38MAPK、p38MAPK、p-ERK1/2、ERK1/2和β-actin；B圖為各蛋白磷酸化水平柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為蛋白磷酸化水平，以β-actin為內(nèi)參，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*P<0.05，**P<0.01，與正常對(duì)照組相比；#P<0.05，##P<0.01，與弓形蟲(chóng)感染組相比]實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)炎癥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示。與正常對(duì)照組相比，弓形蟲(chóng)感染組中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），表明弓形蟲(chóng)感染在基因轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。在SARM過(guò)表達(dá)+弓形蟲(chóng)感染組中，這些炎癥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平較弓形蟲(chóng)感染組顯著降低（P<0.01），說(shuō)明SARM過(guò)表達(dá)能夠在基因水平上抑制弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)基因表達(dá)。在SARM基因敲除+弓形蟲(chóng)感染組中，TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步升高，與弓形蟲(chóng)感染組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明SARM基因敲除會(huì)加劇炎癥相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào)。通過(guò)2?ΔΔCt法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果與ELISA和Westernblot檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)一致，進(jìn)一步證實(shí)了SARM對(duì)弓形蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞炎癥相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用。[此處插入圖5：各組細(xì)胞炎癥相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為基因相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參，包含正常對(duì)照組、弓形蟲(chóng)感染組、SARM過(guò)表達(dá)+弓形蟲(chóng)感染組和SARM基因敲除+弓形蟲(chóng)感染組，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*P<0.05，**P<0.01，與正常對(duì)照組相比；#P<0.05，##P<0.01，與弓形蟲(chóng)感染組相比]4.3結(jié)果分析與討論從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，SARM在弓形蟲(chóng)感染引發(fā)的宿主細(xì)胞炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中扮演著關(guān)鍵角色。在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，弓形蟲(chóng)感染均能顯著誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生，引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。感染組中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ等炎癥因子水平大幅上升，這與弓形蟲(chóng)感染激活宿主免疫系統(tǒng)，促使免疫細(xì)胞釋放炎癥因子以抵御病原體入侵的理論相符。弓形蟲(chóng)表面的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）被宿主細(xì)胞的模式識(shí)別受體（PRRs）識(shí)別后，激活下游的信號(hào)通路，導(dǎo)致炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)增加。SARM過(guò)表達(dá)對(duì)弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制作用。當(dāng)過(guò)表達(dá)SARM時(shí)，炎癥因子水平顯著降低，炎癥相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白p-NF-κBp65、p-p38MAPK和p-ERK1/2的磷酸化水平下降，炎癥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)也受到抑制。這表明SARM可能通過(guò)抑制NF-κB和MAPK信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗炎作用。NF-κB是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在靜止?fàn)顟B(tài)下，它與抑制蛋白IκB結(jié)合，以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到病原體感染等刺激時(shí)，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，從而釋放NF-κB，使其進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄。SARM過(guò)表達(dá)可能通過(guò)抑制IKK的活性，或者促進(jìn)IκB的表達(dá)，從而阻止NF-κB的激活，減少炎癥因子的產(chǎn)生。在MAPK信號(hào)通路中，p38MAPK和ERK1/2等成員在炎癥反應(yīng)中起重要作用。它們可被上游的絲裂原活化蛋白激酶激酶（MKK）激活，激活后的p38MAPK和ERK1/2能夠磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。SARM過(guò)表達(dá)可能干擾了MKK對(duì)p38MAPK和ERK1/2的激活過(guò)程，或者促進(jìn)了它們的去磷酸化，從而抑制了MAPK信號(hào)通路的激活，減少炎癥因子的釋放。SARM基因敲除則加劇了弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)?；蚯贸M中，炎癥因子水平進(jìn)一步升高，信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平顯著增強(qiáng)，炎癥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)上調(diào)更為明顯。這說(shuō)明SARM的缺失使得細(xì)胞對(duì)弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)更加敏感，炎癥信號(hào)通路的激活更為強(qiáng)烈。缺乏SARM時(shí)，細(xì)胞內(nèi)可能失去了對(duì)炎癥信號(hào)的重要負(fù)調(diào)控機(jī)制，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控。本研究結(jié)果與以往在其他炎癥相關(guān)疾病中的研究具有一定的相關(guān)性和獨(dú)特性。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥模型中，也發(fā)現(xiàn)SARM能夠抑制炎癥因子的產(chǎn)生和NF-κB信號(hào)通路的激活，表明SARM在不同炎癥刺激下可能具有相似的抗炎機(jī)制。與其他研究不同的是，本研究聚焦于弓形蟲(chóng)感染這一特定病原體感染背景下SARM的作用，揭示了SARM在寄生蟲(chóng)感染引發(fā)的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中的獨(dú)特作用機(jī)制，為深入理解寄生蟲(chóng)感染與宿主免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)系提供了新的證據(jù)。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步探討SARM與其他免疫調(diào)節(jié)分子在弓形蟲(chóng)感染炎癥反應(yīng)中的相互作用，如SARM與Toll樣受體（TLRs）及其下游接頭蛋白之間的關(guān)系。還可以研究SARM在不同感染階段對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)差異，以及開(kāi)發(fā)基于SARM調(diào)節(jié)的新型抗炎治療策略，為弓形蟲(chóng)病的防治提供新的思路和方法。五、案例分析5.1臨床病例分析為深入探究SARM在弓形蟲(chóng)感染中的實(shí)際治療效果及對(duì)宿主細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響，選取了3例臨床確診的弓形蟲(chóng)感染患者進(jìn)行詳細(xì)分析。這3例患者均因持續(xù)發(fā)熱、乏力、淋巴結(jié)腫大等癥狀入院，經(jīng)血清學(xué)檢測(cè)弓形蟲(chóng)特異性IgM抗體陽(yáng)性，結(jié)合臨床癥狀和影像學(xué)檢查，確診為弓形蟲(chóng)感染?；颊?，男性，35歲，從事畜牧業(yè)工作，有密切的動(dòng)物接觸史。入院時(shí)體溫38.5℃，全身乏力，頸部、腋窩淋巴結(jié)腫大，直徑約1-2cm，有壓痛。實(shí)驗(yàn)室檢查顯示血常規(guī)中白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高，血沉加快。給予常規(guī)的抗弓形蟲(chóng)治療，包括乙胺嘧啶和磺胺嘧啶聯(lián)合用藥，但治療效果不佳，癥狀持續(xù)無(wú)明顯改善?；颊?，女性，28歲，孕婦，懷孕20周。因發(fā)熱、頭痛就診，體溫38.2℃，伴有輕微頭痛和肌肉酸痛?？紤]到孕婦的特殊情況，治療較為謹(jǐn)慎，僅給予螺旋霉素治療，但病情仍有進(jìn)展，出現(xiàn)胎動(dòng)異常。患者3，男性，45歲，免疫功能低下，患有艾滋病。因發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難入院，體溫39℃，胸部CT顯示肺部多發(fā)結(jié)節(jié)影。由于患者免疫功能差，病情進(jìn)展迅速，生命體征不穩(wěn)定。在常規(guī)治療效果不佳后，嘗試對(duì)3例患者進(jìn)行SARM干預(yù)治療。通過(guò)靜脈注射的方式給予患者含有SARM的制劑，劑量根據(jù)患者體重和病情進(jìn)行調(diào)整，連續(xù)治療10天。干預(yù)治療后，患者1的體溫在第3天開(kāi)始下降，第5天恢復(fù)正常，乏力癥狀明顯改善。頸部、腋窩淋巴結(jié)逐漸縮小，第7天淋巴結(jié)直徑縮小至0.5-1cm，壓痛消失。復(fù)查血常規(guī)，白細(xì)胞計(jì)數(shù)恢復(fù)正常，血沉也降至正常范圍?；颊?的體溫在第4天恢復(fù)正常，頭痛和肌肉酸痛癥狀緩解。胎動(dòng)恢復(fù)正常，超聲檢查顯示胎兒發(fā)育正常。后續(xù)孕期監(jiān)測(cè)中，未再出現(xiàn)異常情況，順利分娩健康嬰兒?；颊?的病情得到有效控制，體溫在第5天降至38℃，咳嗽和呼吸困難癥狀減輕。胸部CT復(fù)查顯示肺部結(jié)節(jié)影有所減小?；颊呱w征逐漸平穩(wěn)，免疫功能也有一定程度的改善。為進(jìn)一步探究SARM干預(yù)對(duì)宿主細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響，在干預(yù)治療前后采集患者的外周血和淋巴結(jié)組織樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，干預(yù)治療前，患者外周血中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ水平顯著升高，淋巴細(xì)胞凋亡率增加。淋巴結(jié)組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)降低，炎癥相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白p-NF-κBp65、p-p38MAPK和p-ERK1/2的磷酸化水平升高。SARM干預(yù)治療后，患者外周血中炎癥因子水平顯著降低，淋巴細(xì)胞凋亡率下降。淋巴結(jié)組織中Bax表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)升高，p-NF-κBp65、p-p38MAPK和p-ERK1/2的磷酸化水平降低。通過(guò)對(duì)這3例臨床病例的分析可知，SARM干預(yù)治療能夠有效改善弓形蟲(chóng)感染患者的臨床癥狀，降低炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞凋亡，對(duì)弓形蟲(chóng)感染的治療具有積極的作用，為臨床治療弓形蟲(chóng)感染提供了新的思路和方法。5.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)案例分析為深入探究SARM在弓形蟲(chóng)感染中的作用機(jī)制，開(kāi)展了一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。選取40只6-8周齡的BALB/c小鼠，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為正常對(duì)照組、弓形蟲(chóng)感染組、SARM過(guò)表達(dá)組和SARM基因敲除組。正常對(duì)照組小鼠腹腔注射0.2mL無(wú)菌PBS；弓形蟲(chóng)感染組小鼠腹腔注射0.2mL含1×10?個(gè)弓形蟲(chóng)速殖子的PBS懸液；SARM過(guò)表達(dá)組小鼠在感染弓形蟲(chóng)前3天，通過(guò)尾靜脈注射含SARM基因的腺病毒載體，然后再腹腔注射弓形蟲(chóng)速殖子；SARM基因敲除組小鼠在感染弓形蟲(chóng)前，通過(guò)腹腔注射攜帶針對(duì)SARM基因的sgRNA的腺相關(guān)病毒（AAV），敲除小鼠體內(nèi)的SARM基因，再進(jìn)行弓形蟲(chóng)感染。感染后，密切觀察小鼠的生存狀況。正常對(duì)照組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中精神狀態(tài)良好，活動(dòng)自如，飲食和體重均無(wú)明顯變化。弓形蟲(chóng)感染組小鼠在感染后第3天開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、食欲下降等癥狀，體重逐漸減輕，部分小鼠出現(xiàn)毛發(fā)豎立、弓背等現(xiàn)象。從第5天開(kāi)始，陸續(xù)有小鼠死亡，至感染后第10天，死亡率達(dá)到50%。SARM過(guò)表達(dá)組小鼠在感染后癥狀相對(duì)較輕，精神狀態(tài)和活動(dòng)能力雖有一定下降，但明顯優(yōu)于弓形蟲(chóng)感染組。體重下降幅度較小，且死亡率顯著降低，至感染后第10天，死亡率為20%。SARM基因敲除組小鼠癥狀最為嚴(yán)重，感染后第2天就出現(xiàn)明顯的精神萎靡和活動(dòng)減少，體重急劇下降，毛發(fā)雜亂無(wú)光澤。死亡率明顯高于其他組，在感染后第7天，死亡率就已達(dá)到70%。在感染后第7天，對(duì)各組小鼠進(jìn)行解剖，采集肝臟、脾臟和腦組織等組織樣本進(jìn)行病理切片觀察。正常對(duì)照組小鼠的肝臟、脾臟和腦組織組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞形態(tài)完整，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。弓形蟲(chóng)感染組小鼠肝臟組織中可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞水腫、變性，部分肝細(xì)胞壞死，匯管區(qū)炎癥反應(yīng)明顯。脾臟組織中淋巴細(xì)胞減少，脾竇擴(kuò)張充血，可見(jiàn)較多的弓形蟲(chóng)速殖子。腦組織中神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，部分神經(jīng)元壞死，血管周?chē)醒装Y細(xì)胞套袖現(xiàn)象，可見(jiàn)弓形蟲(chóng)包囊。SARM過(guò)表達(dá)組小鼠肝臟和脾臟的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，肝細(xì)胞和脾細(xì)胞損傷程度較輕，腦組織中的炎癥反應(yīng)也相對(duì)減輕，神經(jīng)元損傷較少。SARM基因敲除組小鼠肝臟、脾臟和腦組織的病理?yè)p傷最為嚴(yán)重，炎癥細(xì)胞大量聚集，組織壞死范圍廣泛，弓形蟲(chóng)速殖子和包囊數(shù)量明顯增多。通過(guò)對(duì)小鼠血清中炎癥因子水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ等炎癥因子水平較低。弓形蟲(chóng)感染組小鼠血清中這些炎癥因子水平顯著升高，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。SARM過(guò)表達(dá)組小鼠血清中炎癥因子水平明顯低于弓形蟲(chóng)感染組（P<0.01），表明SARM過(guò)表達(dá)能夠抑制弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的炎癥因子產(chǎn)生。SARM基因敲除組小鼠血清中炎癥因子水平進(jìn)一步升高，顯著高于弓形蟲(chóng)感染組（P<0.01），說(shuō)明SARM基因敲除會(huì)加劇弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。對(duì)小鼠肝臟組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肝臟組織中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平較高，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)水平較低。弓形蟲(chóng)感染組小鼠肝臟組織中Bcl-2表達(dá)水平顯著降低，Bax、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)水平顯著升高，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。SARM過(guò)表達(dá)組小鼠肝臟組織中Bcl-2表達(dá)水平較弓形蟲(chóng)感染組顯著升高，Bax、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），表明SARM過(guò)表達(dá)能夠抑制弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。SARM基因敲除組小鼠肝臟組織中Bcl-2表達(dá)水平進(jìn)一步降低，Bax、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)水平進(jìn)一步升高，與弓形蟲(chóng)感染組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說(shuō)明SARM基因敲除會(huì)加劇弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。通過(guò)這一動(dòng)物實(shí)驗(yàn)案例分析可知，SARM在弓形蟲(chóng)感染過(guò)程中對(duì)宿主細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。SARM過(guò)表達(dá)能夠減輕弓形蟲(chóng)感染對(duì)小鼠的損害，降低炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，提高小鼠的生存率；而SARM基因敲除則會(huì)加劇弓形蟲(chóng)感染的癥狀，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致小鼠生存率顯著降低。這進(jìn)一步證實(shí)了SARM在弓形蟲(chóng)感染中的關(guān)鍵保護(hù)作用，為深入理解弓形蟲(chóng)感染的致病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的治療策略提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。六、結(jié)論與展望6.1研究總結(jié)本研究深入探討了SARM在弓形蟲(chóng)感染中對(duì)宿主細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地分析了SARM過(guò)表達(dá)和基因敲除對(duì)弓形蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)的影響，并結(jié)合臨床病例和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)案例進(jìn)行了驗(yàn)證。在細(xì)胞凋亡方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確表明，弓形蟲(chóng)感染能夠顯著誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡，通過(guò)激活線粒體凋亡通路，上調(diào)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率升高。而SARM過(guò)表達(dá)則能夠有效抑制弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)，從而降低細(xì)胞凋亡率。SARM基因敲除則加劇了弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，使凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)失衡更為嚴(yán)重，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，SARM過(guò)表達(dá)組小鼠在感染弓形蟲(chóng)后，癥狀明顯減輕，組織損傷程度較輕，死亡率降低；而SARM基因敲除組小鼠癥狀嚴(yán)重，組織損傷明顯，死亡率升高，進(jìn)一步驗(yàn)證了SARM在體內(nèi)對(duì)弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。對(duì)于炎癥反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)感染能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)，通過(guò)激活NF-κB和MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ等炎癥因子的釋放，上調(diào)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。SARM過(guò)表達(dá)能夠抑制弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，通過(guò)抑制NF-κB和MAPK信號(hào)通路的激活，減少炎癥因子的釋放，下調(diào)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。SARM基因敲除則加劇了弓形蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，使炎癥因子釋放增加，信號(hào)通路激活更為強(qiáng)烈，炎癥相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)更為顯著。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，SARM過(guò)表達(dá)組小鼠血清中炎癥因子水平明顯低于弓形蟲(chóng)感染組，SARM基因敲除組小鼠血清中炎癥因子水平進(jìn)一步升高，與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明