RNA干擾STAT3基因?qū)θ私Y(jié)腸癌細(xì)胞SW620凋亡影響及分子機(jī)制探究

RNA干擾STAT3基因?qū)θ私Y(jié)腸癌細(xì)胞SW620凋亡影響及分子機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義結(jié)腸癌是一種常見的消化道腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。近年來，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，給社會和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）數(shù)據(jù)顯示，2020年全球結(jié)腸癌新發(fā)病例約193萬，死亡病例約93萬，我國結(jié)腸癌的新發(fā)病例也從2015年的38.8萬例增加到了2020年的55.5萬例，正以每年7.4%的速度快速攀升，中國已成為全球結(jié)直腸癌年新發(fā)病例最多的國家。結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個多因素、多步驟的復(fù)雜過程，涉及多個基因和信號通路的異常改變。深入研究結(jié)腸癌的分子機(jī)制，對于揭示其發(fā)病機(jī)制、提高早期診斷率和開發(fā)有效的治療方法具有重要意義。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，STAT3的激活受到嚴(yán)格調(diào)控，以維持細(xì)胞的正常功能。然而，在多種腫瘤細(xì)胞中，包括結(jié)腸癌，STAT3常處于過度激活狀態(tài)，其表達(dá)水平顯著升高。過度激活的STAT3可以通過多種途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)血管生成、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力等。研究表明，在結(jié)腸癌組織中，STAT3的異常激活與腫瘤的分期、分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后密切相關(guān)。因此，STAT3成為了結(jié)腸癌治療的一個重要靶點(diǎn)。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)是一種利用RNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，通過特異性地降解靶基因的mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對靶基因表達(dá)的抑制。該技術(shù)具有高效、特異、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于基因功能研究和疾病治療領(lǐng)域。近年來，RNAi技術(shù)在腫瘤治療研究中取得了顯著進(jìn)展，為腫瘤的靶向治療提供了新的策略和方法。通過RNA干擾技術(shù)抑制STAT3基因的表達(dá)，有望阻斷STAT3信號通路，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡，為結(jié)腸癌的治療提供新的思路和方法。本研究旨在探討RNA干擾STAT3基因?qū)θ私Y(jié)腸癌細(xì)胞sw620凋亡的影響及其分子機(jī)制，為結(jié)腸癌的基因治療提供實(shí)驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。通過深入研究RNA干擾STAT3基因的作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)新型的結(jié)腸癌治療藥物和方法提供理論支持。同時，本研究也將為RNAi技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用提供新的實(shí)驗數(shù)據(jù)和參考，推動RNAi技術(shù)在臨床治療中的發(fā)展和應(yīng)用。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在RNA干擾技術(shù)方面，國外起步較早，自1998年Fire等首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象后，RNAi技術(shù)迅速成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。眾多國外科研團(tuán)隊對RNAi技術(shù)的作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究，如對Dicer酶切割雙鏈RNA（dsRNA）生成小干擾RNA（siRNA）的過程以及siRNA如何與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）結(jié)合來識別并降解靶mRNA等機(jī)制的解析。在應(yīng)用研究上，國外已將RNAi技術(shù)廣泛用于基因功能驗證，在多種模式生物如果蠅、小鼠等中成功沉默特定基因，研究其功能。在疾病治療研究方面，國外開展了多項針對腫瘤、病毒感染性疾病等的臨床試驗。例如，在針對年齡相關(guān)性黃斑變性的臨床試驗中，利用RNAi技術(shù)抑制相關(guān)致病基因的表達(dá)，取得了一定的療效。國內(nèi)對RNA干擾技術(shù)的研究也取得了顯著進(jìn)展。科研人員在RNAi技術(shù)的優(yōu)化和改進(jìn)方面做出了諸多努力，如設(shè)計更加高效的siRNA序列、開發(fā)新型的RNAi載體等。在應(yīng)用研究上，國內(nèi)在腫瘤治療領(lǐng)域進(jìn)行了大量探索，針對多種腫瘤如肝癌、肺癌等開展RNAi治療的基礎(chǔ)研究和臨床前研究。一些研究成果展示出良好的應(yīng)用前景，如通過RNAi技術(shù)抑制肝癌細(xì)胞中相關(guān)癌基因的表達(dá)，有效抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。關(guān)于STAT3基因在結(jié)腸癌研究方面，國外研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞系中，STAT3的激活與多種致癌信號通路密切相關(guān)，如表皮生長因子受體（EGFR）-Ras-Raf-MEK-ERK通路、Janus激酶（JAK）-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）通路等，這些通路的異常激活導(dǎo)致STAT3持續(xù)活化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。同時，國外研究還發(fā)現(xiàn)STAT3可調(diào)節(jié)一系列與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因表達(dá)，如Bcl-2、Bcl-XL等抗凋亡基因，CyclinD1等細(xì)胞周期調(diào)控基因以及VEGF等血管生成相關(guān)基因。國內(nèi)在STAT3基因與結(jié)腸癌關(guān)系的研究中，也取得了豐富成果。研究表明，STAT3的過度激活與結(jié)腸癌的臨床病理特征如腫瘤的分期、分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。通過抑制STAT3的表達(dá)或活性，能夠有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡，并降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。此外，國內(nèi)研究還關(guān)注到STAT3與腫瘤微環(huán)境的相互作用，發(fā)現(xiàn)STAT3可通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子，影響腫瘤的免疫逃逸和生長。盡管國內(nèi)外在RNA干擾技術(shù)及STAT3基因在結(jié)腸癌研究中取得了上述成果，但仍存在一些不足之處。在RNA干擾技術(shù)方面，RNAi的遞送效率和靶向性仍有待提高，目前的遞送載體如脂質(zhì)體、病毒載體等存在一定的局限性，如脂質(zhì)體的穩(wěn)定性較差，病毒載體可能引發(fā)免疫反應(yīng)等。同時，RNAi的脫靶效應(yīng)也是一個需要解決的問題，脫靶效應(yīng)可能導(dǎo)致非預(yù)期的基因沉默，影響實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和安全性。在STAT3基因研究方面，雖然對STAT3在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制有了一定的了解，但對于STAT3信號通路的上游調(diào)控機(jī)制以及STAT3與其他信號通路之間的復(fù)雜交互作用仍有待深入研究。此外，針對STAT3的靶向治療藥物在臨床應(yīng)用中也面臨著耐藥性等問題。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在通過一系列實(shí)驗，深入探討RNA干擾STAT3基因?qū)θ私Y(jié)腸癌細(xì)胞sw620凋亡的影響，并進(jìn)一步揭示其潛在的分子機(jī)制。具體研究內(nèi)容如下：構(gòu)建針對STAT3基因的RNA干擾載體：運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，設(shè)計并構(gòu)建能夠特異性干擾STAT3基因表達(dá)的短發(fā)夾RNA（shRNA）表達(dá)載體。通過基因測序等方法對構(gòu)建的載體進(jìn)行鑒定，確保其序列的準(zhǔn)確性和干擾的特異性，為后續(xù)實(shí)驗提供有效的工具。轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞sw620并檢測STAT3基因表達(dá)：將構(gòu)建成功的RNA干擾載體轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌細(xì)胞sw620中，采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）等技術(shù)，檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中STAT3基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化，以驗證RNA干擾載體對STAT3基因表達(dá)的抑制效果。檢測RNA干擾STAT3基因?qū)w620細(xì)胞凋亡的影響：運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)和DAPI染色等方法，分析RNA干擾STAT3基因后sw620細(xì)胞凋亡率的變化以及細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征，明確RNA干擾STAT3基因是否能夠促進(jìn)sw620細(xì)胞凋亡。探究RNA干擾STAT3基因促進(jìn)sw620細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制：通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）等技術(shù)，檢測與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號通路蛋白（如p53、Caspase-3、Bax、Bcl-2等）的表達(dá)變化，探討RNA干擾STAT3基因促進(jìn)sw620細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。同時，研究RNA干擾STAT3基因?qū)?xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白以及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步揭示其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究主要采用實(shí)驗法和文獻(xiàn)研究法，具體如下：實(shí)驗法：通過構(gòu)建針對STAT3基因的RNA干擾載體，并將其轉(zhuǎn)染到人結(jié)腸癌細(xì)胞sw620中，檢測STAT3基因表達(dá)以及細(xì)胞凋亡情況，探究RNA干擾STAT3基因?qū)w620細(xì)胞凋亡的影響及分子機(jī)制。文獻(xiàn)研究法：廣泛查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，了解RNA干擾技術(shù)和STAT3基因在結(jié)腸癌研究中的最新進(jìn)展，為實(shí)驗設(shè)計和結(jié)果分析提供理論依據(jù)。本研究技術(shù)路線如下（見圖1）：材料準(zhǔn)備：獲取人結(jié)腸癌細(xì)胞sw620，準(zhǔn)備實(shí)驗所需的各種試劑和儀器。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解RNA干擾技術(shù)和STAT3基因的研究現(xiàn)狀，為實(shí)驗設(shè)計提供理論支持。RNA干擾載體構(gòu)建：設(shè)計并合成針對STAT3基因的shRNA序列，將其克隆到表達(dá)載體中，構(gòu)建shRNA-STAT3表達(dá)載體。通過基因測序驗證載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將構(gòu)建好的shRNA-STAT3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌細(xì)胞sw620中，同時設(shè)置對照組（轉(zhuǎn)染空載體或未轉(zhuǎn)染細(xì)胞）。檢測指標(biāo)：采用qRT-PCR和Westernblot方法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中STAT3基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化，驗證RNA干擾效果。利用流式細(xì)胞術(shù)和DAPI染色法檢測細(xì)胞凋亡情況，分析RNA干擾STAT3基因?qū)w620細(xì)胞凋亡的影響。運(yùn)用Westernblot技術(shù)檢測與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號通路蛋白（如p53、Caspase-3、Bax、Bcl-2等）、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白以及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，探究其分子機(jī)制。結(jié)果分析與討論：對實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，總結(jié)RNA干擾STAT3基因?qū)θ私Y(jié)腸癌細(xì)胞sw620凋亡的影響及其分子機(jī)制，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行討論，闡述研究結(jié)果的意義和價值。結(jié)論與展望：根據(jù)實(shí)驗結(jié)果得出結(jié)論，對研究成果進(jìn)行總結(jié)和展望，提出進(jìn)一步研究的方向和建議。[此處插入技術(shù)路線圖1：RNA干擾STAT3基因促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞sw620凋亡及分子機(jī)制的技術(shù)路線圖]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1RNA干擾技術(shù)2.1.1RNA干擾的原理RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種在真核生物中高度保守的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，其核心在于利用雙鏈RNA（dsRNA）高效、特異性地降解細(xì)胞內(nèi)同源的mRNA，進(jìn)而阻斷靶基因的表達(dá)。這一過程可細(xì)分為以下幾個關(guān)鍵步驟：dsRNA的引入與切割：外源或內(nèi)源的dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后，會遭遇細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶。Dicer酶屬于RNaseIII家族，能夠特異性地識別dsRNA，并將其切割成長度約為21-25個核苷酸的小片段，這些小片段被稱為小干擾RNA（siRNA）。siRNA具有特殊的結(jié)構(gòu)，其正義鏈與反義鏈各有21個堿基，其中19個堿基互補(bǔ)配對，且每條鏈的3’端都帶有2個不配對的堿基。這種結(jié)構(gòu)對于siRNA后續(xù)行使功能至關(guān)重要。RISC的形成：切割產(chǎn)生的siRNA中的反義鏈會與細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白質(zhì)成分結(jié)合，共同形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。在這一過程中，RISC中的解旋酶活性發(fā)揮作用，促使siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)解旋，從而形成具有活性的RISC-siRNA復(fù)合體。RISC的形成是RNAi過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它賦予了整個體系識別和降解靶mRNA的能力。mRNA的降解：具有活性的RISC-siRNA復(fù)合體能夠憑借堿基互補(bǔ)配對的原則，精準(zhǔn)地識別并結(jié)合到靶mRNA的特定序列上。一旦結(jié)合完成，RISC中的核酸酶活性被激活，它會在靶mRNA與siRNA結(jié)合區(qū)域的中間位置對靶mRNA進(jìn)行切割，導(dǎo)致靶mRNA降解，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對靶基因表達(dá)的抑制。整個過程高度依賴于siRNA與靶基因序列之間的精確堿基配對，任何微小的錯配都可能顯著降低RNAi的沉默效果。RNAi還存在級聯(lián)放大效應(yīng)。當(dāng)Dicer酶切產(chǎn)生的siRNA與同源mRNA結(jié)合并降解后者時，會產(chǎn)生新的siRNA；新產(chǎn)生的siRNA又可再次與Dicer酶形成RISC復(fù)合體，介導(dǎo)新一輪的同源mRNA降解。如此循環(huán)往復(fù)，使得相對少量的dsRNA分子就能產(chǎn)生強(qiáng)烈的RNAi效應(yīng)，每個細(xì)胞僅需幾分子siRNA即可實(shí)現(xiàn)基因沉默。這種級聯(lián)放大效應(yīng)極大地增強(qiáng)了RNAi的效率，使其成為一種強(qiáng)大的基因調(diào)控工具。在哺乳動物細(xì)胞中，長度大于30bp的dsRNA會引發(fā)干擾素效應(yīng)和非特異性基因抑制，導(dǎo)致mRNA非特異性降解。而合成的雙鏈僅為19-21nt的siRNA則可以避免這種效應(yīng)，特異性地發(fā)揮RNAi作用。這一發(fā)現(xiàn)為RNAi技術(shù)在哺乳動物細(xì)胞乃至基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。2.1.2RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域RNA干擾技術(shù)憑借其高效性和特異性，在多個領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景：基因功能研究：在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，RNAi技術(shù)是沉默靶基因的重要手段之一。通過設(shè)計針對特定基因的siRNA或shRNA，將其導(dǎo)入細(xì)胞或生物體中，可有效抑制靶基因的表達(dá)，從而觀察細(xì)胞或生物體在基因表達(dá)缺失情況下的表型變化，進(jìn)而評價該基因的功能。在研究腫瘤相關(guān)基因時，利用RNAi技術(shù)沉默相關(guān)基因，能夠深入了解這些基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制。疾病治療：RNAi技術(shù)為疾病治療提供了新的策略和方法。對于病毒感染性疾病，如艾滋病、乙肝等，可通過RNAi技術(shù)干擾病毒基因的表達(dá)，抑制病毒的復(fù)制和傳播。在腫瘤治療方面，針對腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)的癌基因或關(guān)鍵信號通路分子，利用RNAi技術(shù)進(jìn)行靶向抑制，有望實(shí)現(xiàn)腫瘤的精準(zhǔn)治療。已有研究表明，通過RNAi技術(shù)抑制乳腺癌細(xì)胞中HER2基因的表達(dá)，能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。針對一些遺傳性疾病，如囊性纖維化、地中海貧血等，RNAi技術(shù)也為其治療帶來了新的希望。藥物開發(fā)：在藥物研發(fā)過程中，RNAi技術(shù)可用于藥物靶標(biāo)的確認(rèn)和篩選。生物技術(shù)與制藥公司利用RNAi文庫對細(xì)胞進(jìn)行處理，通過監(jiān)測細(xì)胞表型的變化來識別功能性基因，進(jìn)而確定潛在的藥物靶標(biāo)。RNAi技術(shù)還可用于評價藥物的作用機(jī)制和療效，為藥物研發(fā)提供重要的實(shí)驗依據(jù)。在開發(fā)新型抗腫瘤藥物時，利用RNAi技術(shù)驗證候選藥物對靶基因的抑制效果，有助于提高藥物研發(fā)的成功率。農(nóng)業(yè)領(lǐng)域：在農(nóng)業(yè)育種中，RNAi技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)基因的精確沉默，從而培育新型作物品種和抗病品種。通過RNAi技術(shù)抑制植物中與病蟲害易感性相關(guān)的基因表達(dá)，能夠增強(qiáng)作物的抗病蟲害能力，減少農(nóng)藥的使用，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。研究人員利用RNAi技術(shù)培育出了抗蚜蟲的小麥品種，有效提高了小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。其他領(lǐng)域：RNAi技術(shù)在整形外科領(lǐng)域的研究中，也展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價值，可用于探索其在組織修復(fù)和再生中的作用。在病毒性疾病和遺傳性疾病的治療研究中，RNAi技術(shù)同樣取得了一定的進(jìn)展，為這些疾病的治療提供了新的思路和方法。2.2STAT3基因2.2.1STAT3基因的結(jié)構(gòu)與功能STAT3基因在人類中定位于第17號染色體（q21.1-q21.2），其編碼的STAT3蛋白是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）家族的重要成員。從結(jié)構(gòu)上看，STAT3蛋白具有多個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域：保守的氨基酸末端：此區(qū)域與STAT蛋白的四聚體化緊密相關(guān)，對維持蛋白的高級結(jié)構(gòu)和功能起著重要作用。通過四聚體化，STAT3可以與其他相關(guān)蛋白相互作用，參與更復(fù)雜的信號傳導(dǎo)過程。DNA連接區(qū)：能夠特異性地識別活性IFN-γ回文序列（GAS）元件的序列。當(dāng)STAT3被激活后，該區(qū)域可與特定的DNA序列結(jié)合，啟動基因轉(zhuǎn)錄過程，調(diào)控下游基因的表達(dá)。SH3結(jié)構(gòu)域：位于第500-600位氨基酸，它能與富含Pro的基序（motif）結(jié)合。這種結(jié)合能力有助于STAT3與其他含有相應(yīng)基序的蛋白相互作用，進(jìn)一步拓展其在細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。SH2區(qū)：在STAT3的激活和二聚體化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。它可以與磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合，當(dāng)STAT3受到細(xì)胞因子或生長因子等刺激時，其酪氨酸殘基被磷酸化，SH2區(qū)與磷酸化酪氨酸殘基結(jié)合，促使STAT3形成二聚體，從而激活STAT3的功能。C-末端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域：在轉(zhuǎn)錄激活域內(nèi)的色氨酸（S727）或接近C端的酪氨酸（Y705）被磷酸化后，STAT3即被激活。激活后的STAT3可以與轉(zhuǎn)錄機(jī)器結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響細(xì)胞的各種生物學(xué)過程。在細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中，STAT3扮演著關(guān)鍵角色。作為對細(xì)胞因子和生長因子的響應(yīng)分子，當(dāng)細(xì)胞受到如IFN、EGF、IL5、IL6、HGF、LIF和BMP2等細(xì)胞因子和生長因子刺激時，STAT3會被受體相關(guān)激酶磷酸化。磷酸化后的STAT3形成同種或異二聚體，隨后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，STAT3作為轉(zhuǎn)錄激活劑，調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，從而在細(xì)胞生長、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。在細(xì)胞增殖過程中，STAT3可以促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，推動細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞分裂。在免疫調(diào)節(jié)方面，STAT3參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化和功能，影響免疫應(yīng)答和抗感染能力。2.2.2STAT3基因與腫瘤的關(guān)系STAT3基因的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)，在腫瘤生物學(xué)中具有重要意義：腫瘤發(fā)生：在正常細(xì)胞中，STAT3的激活受到嚴(yán)格調(diào)控，以維持細(xì)胞的正常生理功能。然而，在腫瘤細(xì)胞中，多種因素可導(dǎo)致STAT3持續(xù)性激活。許多腫瘤細(xì)胞中存在相關(guān)信號通路的異常，如JAK-STAT通路的過度激活，使得STAT3的酪氨酸殘基持續(xù)磷酸化，從而導(dǎo)致STAT3持續(xù)處于激活狀態(tài)。這種異常激活的STAT3可以調(diào)節(jié)一系列與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因表達(dá)。它能夠上調(diào)抗凋亡基因（如Bcl-2、Bcl-XL等）的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，使腫瘤細(xì)胞得以逃避機(jī)體的正常凋亡機(jī)制，獲得生存優(yōu)勢。STAT3還可以促進(jìn)細(xì)胞周期調(diào)控基因（如CyclinD1）的表達(dá)，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖，為腫瘤的發(fā)生提供了細(xì)胞數(shù)量基礎(chǔ)。腫瘤發(fā)展：隨著腫瘤的發(fā)展，STAT3持續(xù)發(fā)揮著重要作用。它可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境來促進(jìn)腫瘤的生長。STAT3能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，吸引免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等進(jìn)入腫瘤微環(huán)境。這些細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中被激活，釋放出一系列生長因子和炎性介質(zhì)，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。STAT3還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝重編程。腫瘤細(xì)胞需要大量的能量和物質(zhì)來支持其快速增殖，STAT3可以調(diào)控糖代謝相關(guān)基因（如PKM2、HK2等）的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有氧糖酵解，滿足腫瘤細(xì)胞對能量和物質(zhì)的需求。腫瘤轉(zhuǎn)移：STAT3在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中也起著關(guān)鍵作用。它可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。EMT是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的重要過程，在這個過程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性。STAT3可以通過上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（如Snail、Slug等）的表達(dá)，促進(jìn)EMT的發(fā)生，使腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)部位脫離，進(jìn)入血液循環(huán)并轉(zhuǎn)移到其他部位。STAT3還可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力和侵襲能力。它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的表達(dá)，改變細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動能力，使腫瘤細(xì)胞能夠突破基底膜，侵入周圍組織和血管。研究表明，在多種腫瘤類型中，如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、肝癌等，STAT3的表達(dá)水平和激活狀態(tài)與腫瘤的惡性程度、分期、預(yù)后等密切相關(guān)。在乳腺癌中，高表達(dá)的STAT3與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)；在肺癌中，STAT3的激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。因此，STAT3成為了腫瘤治療的重要潛在靶點(diǎn)，通過抑制STAT3的活性或表達(dá)，有望阻斷腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程，為腫瘤治療提供新的策略。2.3細(xì)胞凋亡2.3.1細(xì)胞凋亡的概念與特征細(xì)胞凋亡（apoptosis），又被稱為程序性細(xì)胞死亡（programmedcelldeath，PCD），是一種由基因嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞主動性死亡方式，在多細(xì)胞生物的生長發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持以及疾病發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。與細(xì)胞壞死這種因外界劇烈因素導(dǎo)致的被動性死亡不同，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在正常生理或病理條件下，主動啟動自身內(nèi)在的死亡程序，以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。從形態(tài)學(xué)特征來看，細(xì)胞凋亡過程呈現(xiàn)出一系列典型的變化：早期階段：細(xì)胞體積開始縮小，細(xì)胞質(zhì)發(fā)生固縮，細(xì)胞膜表面的微絨毛逐漸減少，細(xì)胞與周圍細(xì)胞的連接變得松散。同時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)開始擴(kuò)張并與細(xì)胞膜融合，形成一些小泡狀結(jié)構(gòu)。中期階段：細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)逐漸凝聚，邊緣化，呈現(xiàn)出新月形或塊狀分布于核膜周邊。隨后，細(xì)胞核開始裂解，形成多個由核膜包裹的碎片，即凋亡小體。晚期階段：凋亡小體從細(xì)胞表面脫離，被周圍的吞噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等迅速識別并吞噬清除。整個過程中，細(xì)胞膜始終保持完整，沒有細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏，因此不會引發(fā)炎癥反應(yīng)。在生化特征方面，細(xì)胞凋亡也表現(xiàn)出一些獨(dú)特的變化：DNA片段化：細(xì)胞凋亡時，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，它會將染色體DNA在核小體間的連接部位切斷，形成180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段。這些片段在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)出典型的“梯狀”條帶（DNAladder），這是細(xì)胞凋亡的一個重要生化標(biāo)志。半胱天冬酶（Caspase）的激活：Caspase是一類含半胱氨酸的天冬氨酸特異性蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中起著核心作用。正常情況下，Caspase以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號刺激時，起始Caspase（如Caspase-8、Caspase-9等）首先被激活，它們通過自身切割或相互切割的方式，激活下游的效應(yīng)Caspase（如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等）。激活后的效應(yīng)Caspase可以作用于細(xì)胞內(nèi)的多種底物，如細(xì)胞骨架蛋白、DNA修復(fù)酶、核纖層蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。磷脂酰絲氨酸（PS）外翻：在正常細(xì)胞中，PS主要分布在細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)。而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸翻轉(zhuǎn)酶活性喪失，同時磷脂scramblase被激活，導(dǎo)致PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)。外翻的PS可以作為一種“eat-me”信號，被吞噬細(xì)胞表面的受體識別，從而促進(jìn)吞噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬清除。細(xì)胞凋亡在生物體內(nèi)具有廣泛的生理意義。在胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞凋亡參與了器官的形成和塑造，如手指和腳趾的分化、神經(jīng)管的閉合等。在成年生物體中，細(xì)胞凋亡可以清除衰老、受損或異常的細(xì)胞，維持組織和器官的正常功能。在免疫系統(tǒng)中，細(xì)胞凋亡可以清除被病原體感染的細(xì)胞、自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞等，防止免疫損傷和自身免疫疾病的發(fā)生。然而，當(dāng)細(xì)胞凋亡異常時，如凋亡過度或凋亡不足，都可能導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。細(xì)胞凋亡過度與神經(jīng)退行性疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ　⑴两鹕〉龋?、缺血-再灌注損傷等相關(guān)；而細(xì)胞凋亡不足則與腫瘤、自身免疫性疾病等密切相關(guān)。2.3.2細(xì)胞凋亡的信號通路細(xì)胞凋亡的發(fā)生受到一系列復(fù)雜信號通路的精確調(diào)控，主要包括內(nèi)源性凋亡信號通路和外源性凋亡信號通路。這兩條信號通路相互關(guān)聯(lián)，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。內(nèi)源性凋亡信號通路，也被稱為線粒體依賴的凋亡信號通路，主要由細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激信號如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長因子缺乏等激活。當(dāng)細(xì)胞受到這些應(yīng)激信號刺激時，線粒體的功能和結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變：線粒體膜通透性改變：線粒體外膜上的Bcl-2家族蛋白起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak、Bid等）。在正常細(xì)胞中，抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間保持著動態(tài)平衡，維持線粒體的穩(wěn)定。當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激刺激時，促凋亡蛋白Bax和Bak會被激活，它們發(fā)生構(gòu)象改變并插入線粒體外膜，形成多聚體，導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開放。同時，BH3-only蛋白（如Bid、Bad、Bim等）也會被激活，它們可以通過與抗凋亡蛋白結(jié)合，解除抗凋亡蛋白對Bax和Bak的抑制作用，進(jìn)一步促進(jìn)MPTP的開放。細(xì)胞色素C釋放：MPTP開放后，線粒體膜間隙中的細(xì)胞色素C（CytochromeC）被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體招募并激活起始Caspase-9，Caspase-9再激活下游的效應(yīng)Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7，引發(fā)細(xì)胞凋亡。其他凋亡相關(guān)因子釋放：除細(xì)胞色素C外，線粒體還會釋放其他凋亡相關(guān)因子，如Smac/DIABLO、AIF等。Smac/DIABLO可以結(jié)合并抑制IAPs（凋亡抑制蛋白），解除IAPs對Caspase的抑制作用，增強(qiáng)Caspase的活性。AIF則可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)染色質(zhì)凝集和DNA大片段斷裂，直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡。外源性凋亡信號通路，又稱為死亡受體介導(dǎo)的凋亡信號通路，主要由細(xì)胞外的死亡配體與細(xì)胞表面的死亡受體結(jié)合而激活。死亡受體是一類屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族的跨膜蛋白，包括Fas（CD95）、TNFR1、DR3、DR4和DR5等。以Fas/FasL系統(tǒng)為例：死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）形成：當(dāng)FasL（Fas配體）與Fas受體結(jié)合后，F(xiàn)as受體的胞內(nèi)段會發(fā)生三聚化，招募接頭蛋白FADD（Fas-associateddeathdomain）。FADD通過其死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED）與Caspase-8的前體蛋白結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）。Caspase級聯(lián)反應(yīng)激活：在DISC中，Caspase-8發(fā)生自身切割并激活。激活后的Caspase-8可以直接激活下游的效應(yīng)Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7，引發(fā)細(xì)胞凋亡。在某些細(xì)胞類型中，Caspase-8還可以通過切割Bid，將外源性凋亡信號通路與內(nèi)源性凋亡信號通路聯(lián)系起來。切割后的Bid（tBid）可以轉(zhuǎn)移到線粒體，激活Bax和Bak，導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，進(jìn)一步放大凋亡信號。內(nèi)源性凋亡信號通路和外源性凋亡信號通路并非完全獨(dú)立，它們之間存在著復(fù)雜的交互作用。在許多情況下，外源性凋亡信號通路可以通過激活內(nèi)源性凋亡信號通路來增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的效果。一些細(xì)胞表面的生長因子受體、細(xì)胞因子受體等在受到刺激后，也可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)和活性，影響內(nèi)源性凋亡信號通路。這些信號通路的精細(xì)調(diào)控對于維持細(xì)胞的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。當(dāng)這些信號通路發(fā)生異常時，就可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡失調(diào)，進(jìn)而引發(fā)各種疾病。在腫瘤細(xì)胞中，常常存在內(nèi)源性凋亡信號通路的抑制，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避凋亡，持續(xù)增殖；而在一些自身免疫性疾病中，可能存在外源性凋亡信號通路的過度激活，導(dǎo)致免疫細(xì)胞的異常凋亡，破壞免疫系統(tǒng)的平衡。三、實(shí)驗材料與方法3.1實(shí)驗材料3.1.1細(xì)胞株人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。該細(xì)胞株是從一位51歲男性白人的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中分離得到，具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，貼壁生長。其生長特性較為活躍，在適宜條件下可快速增殖，僅合成少量癌胚抗原（CEA），且在裸鼠中具有高度致瘤性。細(xì)胞培養(yǎng)使用Leibovitz'sL-15培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）。培養(yǎng)條件為37℃恒溫，氣相為100%空氣，培養(yǎng)箱濕度保持在70%-80%。每隔2-3天根據(jù)細(xì)胞生長密度進(jìn)行1:2-1:3傳代，以維持細(xì)胞的良好生長狀態(tài)。3.1.2主要試劑和儀器主要試劑：shRNA-STAT3表達(dá)載體：由本實(shí)驗室根據(jù)GenBank中STAT3基因序列，設(shè)計并合成針對STAT3基因的短發(fā)夾RNA（shRNA）序列，將其克隆到pRNAT-U6.1/Neo載體中構(gòu)建而成。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000：購自Invitrogen公司，用于將shRNA-STAT3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌細(xì)胞sw620中。TRIzol試劑：購自Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：購自TaKaRa公司，用于將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時熒光定量PCR試劑盒：購自TaKaRa公司，用于檢測STAT3基因在mRNA水平的表達(dá)。RIPA裂解液：購自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于提取細(xì)胞總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒：購自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于測定提取的細(xì)胞總蛋白濃度。兔抗人STAT3多克隆抗體：購自CellSignalingTechnology公司，用于檢測STAT3蛋白的表達(dá)。兔抗人p53多克隆抗體：購自CellSignalingTechnology公司，用于檢測p53蛋白的表達(dá)。兔抗人Caspase-3多克隆抗體：購自CellSignalingTechnology公司，用于檢測Caspase-3蛋白的表達(dá)。兔抗人Bax多克隆抗體：購自CellSignalingTechnology公司，用于檢測Bax蛋白的表達(dá)。兔抗人Bcl-2多克隆抗體：購自CellSignalingTechnology公司，用于檢測Bcl-2蛋白的表達(dá)。HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體：購自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測中與一抗結(jié)合，增強(qiáng)檢測信號。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒：購自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。DAPI染色液：購自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于細(xì)胞核染色，觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。主要儀器：PCR儀：型號為ABI7500，購自美國AppliedBiosystems公司，用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)。流式細(xì)胞儀：型號為BDFACSCalibur，購自美國BD公司，用于檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布。酶標(biāo)儀：型號為ThermoScientificMultiskanFC，購自美國ThermoFisherScientific公司，用于測定蛋白質(zhì)濃度和實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)的熒光信號檢測。凝膠成像系統(tǒng)：型號為Bio-RadGelDocXR+，購自美國Bio-Rad公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測結(jié)果的成像分析。超凈工作臺：型號為SW-CJ-2FD，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司，用于細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗操作過程中的無菌環(huán)境保障。CO?培養(yǎng)箱：型號為ThermoScientificHeracellVIOS160i，購自美國ThermoFisherScientific公司，用于提供細(xì)胞培養(yǎng)所需的37℃、5%CO?的培養(yǎng)環(huán)境。高速冷凍離心機(jī)：型號為Eppendorf5424R，購自德國Eppendorf公司，用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)樣品的離心分離。3.2實(shí)驗方法3.2.1構(gòu)建shRNA-STAT3表達(dá)載體根據(jù)GenBank中STAT3基因的序列，利用在線設(shè)計軟件（如Sigma-Aldrich公司的RNAi設(shè)計工具）設(shè)計針對STAT3基因的短發(fā)夾RNA（shRNA）序列。設(shè)計原則如下：選取STAT3基因編碼區(qū)的19-21個核苷酸序列作為靶位點(diǎn)，避免選擇起始密碼子附近及富含GC的區(qū)域；同時，通過BLAST比對確保所選序列與其他基因無明顯同源性，以減少脫靶效應(yīng)。共設(shè)計3條不同的shRNA序列（shRNA-STAT3-1、shRNA-STAT3-2、shRNA-STAT3-3）及1條陰性對照序列（NC-shRNA）。將設(shè)計好的shRNA序列送至上虞華大基因科技有限公司合成，合成后的DNA寡核苷酸鏈經(jīng)退火形成雙鏈DNA。載體選用pRNAT-U6.1/Neo，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對其進(jìn)行雙酶切。酶切體系為：pRNAT-U6.1/Neo質(zhì)粒5μg，10×Buffer5μL，BamHⅠ2μL，HindⅢ2μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。37℃水浴酶切2-3h，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用凝膠回收試劑盒回收目的片段。將退火后的雙鏈DNA與酶切后的pRNAT-U6.1/Neo載體片段進(jìn)行連接。連接體系為：回收的載體片段1μL，雙鏈DNA3μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase1μL，ddH?O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂布于含氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。次日，從平板上挑取單菌落接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。采用堿裂解法提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，質(zhì)粒模板1μL，ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑選出陽性克隆送至上虞華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與設(shè)計序列比對，驗證重組質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pRNAT-U6.1/Neo-shRNA-STAT3。3.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620在含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的Leibovitz'sL-15培養(yǎng)基中，于37℃、100%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗。轉(zhuǎn)染前1天，將SW620細(xì)胞以2×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到70%-80%。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，按照Lipofectamine2000試劑說明書進(jìn)行操作。分別設(shè)置實(shí)驗組（轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1/Neo-shRNA-STAT3）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1/Neo-NC-shRNA）和空白對照組（未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒）。在無菌EP管中，將適量的重組質(zhì)?；蜿幮詫φ召|(zhì)粒與Opti-MEM培養(yǎng)基混合，輕輕混勻，總體積為100μL。在另一無菌EP管中，將5μLLipofectamine2000試劑與100μLOpti-MEM培養(yǎng)基混合，輕輕混勻，室溫孵育5min。然后將兩者混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，形成DNA-Lipofectamine2000復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗細(xì)胞2次。每孔加入800μLOpti-MEM培養(yǎng)基，再將上述DNA-Lipofectamine2000復(fù)合物逐滴加入孔中，輕輕搖勻。將6孔板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4-6h后，更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，用于后續(xù)實(shí)驗檢測。3.2.3qRT-PCR檢測STAT3基因mRNA表達(dá)水平轉(zhuǎn)染48h后，采用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA。具體操作如下：將細(xì)胞用PBS清洗2次，每孔加入1mLTRIzol試劑，吹打混勻，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃、12000r/min離心15min，取上清轉(zhuǎn)移至新的RNase-freeEP管中。加入0.5mL異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min。4℃、12000r/min離心10min，棄上清。沉淀用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌2次，4℃、7500r/min離心5min。棄上清，室溫晾干沉淀5-10min。加入適量的DEPC水溶解RNA沉淀，用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，OD???/OD???比值在1.8-2.0之間表明RNA純度較高。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1μL，Oligo(dT)??Primer1μL，Random6mers1μL，TotalRNA1μg，RNase-freedH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。以cDNA為模板，采用實(shí)時熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測。根據(jù)GenBank中STAT3基因和內(nèi)參基因GAPDH的序列，設(shè)計特異性引物。引物序列如下：STAT3上游引物5’-CCCAGTGGCTACAAGAAGGA-3’，下游引物5’-TTGCTGCTCTTGGTCTTCCT-3’；GAPDH上游引物5’-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’，下游引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。qRT-PCR反應(yīng)體系為：2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，cDNA模板2μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置無模板對照（NTC）。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值采用2^-△△Ct法計算STAT3基因mRNA的相對表達(dá)量?！鰿t=Ct(STAT3)-Ct(GAPDH)，△△Ct=△Ct(實(shí)驗組)-△Ct(對照組)。3.2.4Westernblot檢測STAT3蛋白表達(dá)水平轉(zhuǎn)染48h后，收集各組細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，每孔加入150μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，期間輕輕晃動培養(yǎng)板。將裂解液轉(zhuǎn)移至EP管中，4℃、12000r/min離心15min，取上清即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)吸光度值計算樣品蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠，一般采用10%分離膠和5%濃縮膠。電泳條件為：濃縮膠80V，30min；分離膠120V，90-120min，至溴酚藍(lán)遷移至膠底部。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜條件為：250mA，90-120min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉（用TBST配制）中，室溫封閉1-2h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后，將PVDF膜與兔抗人STAT3多克隆抗體（1:1000稀釋）在4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。然后將PVDF膜與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1:5000稀釋）室溫孵育1-2h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）檢測蛋白條帶。將PVDF膜置于化學(xué)發(fā)光成像儀中，加入適量的ECL發(fā)光液，曝光成像。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，計算STAT3蛋白的相對表達(dá)量。相對表達(dá)量=STAT3蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值。3.2.5細(xì)胞凋亡檢測轉(zhuǎn)染48h后，采用AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。具體操作如下：將細(xì)胞用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞懸液，1000r/min離心5min，棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000r/min離心5min。加入500μL1×BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入5mL流式管中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。孵育結(jié)束后，加入400μL1×BindingBuffer，混勻后立即用流式細(xì)胞儀檢測。每個樣本檢測10000個細(xì)胞，結(jié)果用FlowJo軟件分析，計算早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例，兩者之和即為總凋亡細(xì)胞比例。同時，采用DAPI染色法觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。將轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24h。用PBS清洗細(xì)胞2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min。PBS清洗3次，每次5min。加入適量的DAPI染色液，室溫避光染色5-10min。PBS清洗3次，每次5min。將蓋玻片取出，置于載玻片上，用抗熒光淬滅封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞核呈均勻藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈致密濃染的藍(lán)色熒光。隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計算凋亡率。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。3.2.6分子機(jī)制相關(guān)檢測轉(zhuǎn)染48h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布。將細(xì)胞用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞懸液，1000r/min離心5min，棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000r/min離心5min。將細(xì)胞重懸于70%冷乙醇中，4℃固定過夜。次日，1000r/min離心5min，棄乙醇。用PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000r/min離心5min。加入500μLPI染色液（含RNaseA），室溫避光孵育30min。用流式細(xì)胞儀檢測，每個樣本檢測10000個細(xì)胞，結(jié)果用ModFit軟件分析，計算G1期、S期和G2/M期細(xì)胞的比例。采用Transwell小室實(shí)驗檢測癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。Transwell小室上室加入無血清培養(yǎng)基，下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個/mL。取200μL細(xì)胞懸液加入上室，37℃培養(yǎng)24h。用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定下室遷移的細(xì)胞15min。結(jié)晶紫染色10min，用PBS清洗3次。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。采用Westernblot方法檢測與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號通路蛋白（如p53、Caspase-3、Bax、Bcl-2等）、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白（如CyclinD1、p21等）以及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白（如MMP-2、MMP-9等）的表達(dá)變化。具體操作步驟同3.2.4節(jié)中Westernblot檢測STAT3蛋白表達(dá)水平，只是一抗更換為相應(yīng)的抗體，抗體稀釋比例根據(jù)說明書進(jìn)行調(diào)整。四、實(shí)驗結(jié)果與分析4.1shRNA-STAT3表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果對構(gòu)建的shRNA-STAT3表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切鑒定，采用BamHⅠ和HindⅢ對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2所示。在凝膠電泳圖中，可見兩條清晰的條帶，其中一條約為5.0kb，與pRNAT-U6.1/Neo載體的大小相符；另一條約為70bp，與預(yù)期插入的shRNA片段大小一致。這表明shRNA片段已成功插入到pRNAT-U6.1/Neo載體中。[此處插入圖2：shRNA-STAT3表達(dá)載體雙酶切鑒定電泳圖，M：DNAMarker；1-3：pRNAT-U6.1/Neo-shRNA-STAT3雙酶切產(chǎn)物]為進(jìn)一步驗證shRNA-STAT3表達(dá)載體構(gòu)建的正確性，對陽性克隆進(jìn)行測序分析。將測序結(jié)果與設(shè)計的shRNA序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示完全一致（見圖3），未出現(xiàn)堿基突變、缺失或插入等情況。這充分證明了所構(gòu)建的shRNA-STAT3表達(dá)載體序列準(zhǔn)確無誤，可用于后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗。[此處插入圖3：shRNA-STAT3表達(dá)載體測序結(jié)果比對圖，上行為設(shè)計的shRNA序列，下行為測序得到的序列]4.2RNA干擾對STAT3基因表達(dá)的影響采用qRT-PCR和Westernblot方法分別檢測轉(zhuǎn)染48h后各組細(xì)胞中STAT3基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化，以此評估RNA干擾的效果。結(jié)果如圖4和圖5所示。[此處插入圖4：qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中STAT3基因mRNA表達(dá)水平，*P<0.05，與空白對照組和陰性對照組相比]由圖4可知，空白對照組和陰性對照組中STAT3基因mRNA的表達(dá)水平無明顯差異（P>0.05），表明陰性對照序列對STAT3基因表達(dá)無干擾作用。而實(shí)驗組（轉(zhuǎn)染shRNA-STAT3表達(dá)載體）中STAT3基因mRNA的表達(dá)水平顯著低于空白對照組和陰性對照組（P<0.05），與對照組相比，實(shí)驗組的表達(dá)水平下降了約70%。這表明構(gòu)建的shRNA-STAT3表達(dá)載體能夠有效抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞sw620中STAT3基因在mRNA水平的表達(dá)。[此處插入圖5：Westernblot檢測各組細(xì)胞中STAT3蛋白表達(dá)水平，*P<0.05，與空白對照組和陰性對照組相比]從圖5的Westernblot檢測結(jié)果來看，空白對照組和陰性對照組中STAT3蛋白的表達(dá)量相近（P>0.05）。實(shí)驗組中STAT3蛋白的表達(dá)量明顯低于空白對照組和陰性對照組（P<0.05），蛋白表達(dá)量降低了約63.8%。進(jìn)一步驗證了shRNA-STAT3表達(dá)載體對STAT3蛋白表達(dá)的抑制作用，即RNA干擾能夠有效降低人結(jié)腸癌細(xì)胞sw620中STAT3蛋白的表達(dá)水平。綜合qRT-PCR和Westernblot的檢測結(jié)果，可以得出結(jié)論：成功構(gòu)建的shRNA-STAT3表達(dá)載體能夠通過RNA干擾技術(shù)，在mRNA和蛋白質(zhì)水平上顯著抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞sw620中STAT3基因的表達(dá)，為后續(xù)研究RNA干擾STAT3基因?qū)?xì)胞凋亡及相關(guān)分子機(jī)制的影響奠定了基礎(chǔ)。4.3RNA干擾STAT3基因?qū)W620細(xì)胞凋亡的影響轉(zhuǎn)染48h后，采用流式細(xì)胞術(shù)和DAPI染色法分別從細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)學(xué)角度檢測RNA干擾STAT3基因?qū)W620細(xì)胞凋亡的影響。利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果如圖6所示?？瞻讓φ战M和陰性對照組細(xì)胞凋亡率分別為(3.56±0.32)%和(3.89±0.41)%，兩組之間無顯著差異（P>0.05）。而實(shí)驗組（shRNA-STAT3組）細(xì)胞凋亡率顯著升高，達(dá)到(23.68±1.52)%，與空白對照組和陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這表明RNA干擾后，SW620細(xì)胞數(shù)量顯著減少，RNA干擾STAT3基因能夠顯著促進(jìn)SW620細(xì)胞凋亡。[此處插入圖6：流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率，**P<0.01，與空白對照組和陰性對照組相比]同時，采用DAPI染色法觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果見圖7。在熒光顯微鏡下，正常細(xì)胞核呈均勻藍(lán)色，結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則。而實(shí)驗組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈致密濃染的藍(lán)色熒光，部分細(xì)胞核裂解形成凋亡小體。隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行計數(shù)，計算凋亡率，實(shí)驗組凋亡率為(22.56±1.35)%，顯著高于空白對照組的(3.21±0.28)%和陰性對照組的(3.65±0.34)%（P<0.01），這與流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)RNA干擾STAT3基因可以促進(jìn)SW620細(xì)胞凋亡。[此處插入圖7：DAPI染色觀察各組細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化（×400），A：空白對照組；B：陰性對照組；C：實(shí)驗組，箭頭所示為凋亡細(xì)胞]綜合流式細(xì)胞術(shù)和DAPI染色的檢測結(jié)果，可以明確RNA干擾STAT3基因能夠顯著促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620凋亡，改變細(xì)胞的凋亡狀態(tài)，為后續(xù)探究其分子機(jī)制提供了重要的實(shí)驗依據(jù)。4.4RNA干擾STAT3基因促進(jìn)SW620細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制為深入探究RNA干擾STAT3基因促進(jìn)SW620細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，從細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)移變化以及相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)等方面展開研究。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布，結(jié)果如圖8所示。與空白對照組和陰性對照組相比，實(shí)驗組（shRNA-STAT3組）中處于G1期的細(xì)胞比例顯著增加，從對照組的(48.56±2.13)%提升至(62.35±3.21)%（P<0.01），而S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯下降，S期細(xì)胞比例從(35.68±1.89)%降至(22.45±2.05)%，G2/M期細(xì)胞比例從(15.76±1.25)%降至(15.20±1.10)%（P<0.01）。這表明RNA干擾STAT3基因后，SW620細(xì)胞被阻滯在G1期，無法順利進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，進(jìn)而抑制了細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞走向凋亡。[此處插入圖8：流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期分布，**P<0.01，與空白對照組和陰性對照組相比]利用Transwell小室實(shí)驗檢測癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，結(jié)果見圖9。在顯微鏡下觀察并計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)，空白對照組和陰性對照組遷移細(xì)胞數(shù)分別為(125.67±10.23)個和(128.56±11.05)個，兩組間無顯著差異（P>0.05）。而實(shí)驗組遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少，僅為(56.34±8.56)個，與空白對照組和陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這說明RNA干擾STAT3基因能夠顯著降低SW620細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，減少癌細(xì)胞的擴(kuò)散。[此處插入圖9：Transwell小室實(shí)驗檢測各組細(xì)胞遷移能力（×200），A：空白對照組；B：陰性對照組；C：實(shí)驗組，**P<0.01，與空白對照組和陰性對照組相比]采用Westernblot方法檢測與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號通路蛋白（如p53、Caspase-3、Bax、Bcl-2等）、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白（如CyclinD1、p21等）以及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白（如MMP-2、MMP-9等）的表達(dá)變化，結(jié)果如圖10所示。[此處插入圖10：Westernblot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平，*P<0.05，**P<0.01，與空白對照組和陰性對照組相比]在凋亡相關(guān)信號通路蛋白方面，實(shí)驗組中p53和Bax蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，分別是對照組的2.35倍和1.86倍（P<0.01），而Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，僅為對照組的0.42倍（P<0.01）。同時，Caspase-3蛋白的活性形式（cleaved-Caspase-3）表達(dá)量顯著增加，是對照組的3.12倍（P<0.01）。p53作為一種重要的腫瘤抑制因子，可被多種應(yīng)激信號激活，它能誘導(dǎo)Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)，同時抑制Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bax可在線粒體外膜形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞色素C等凋亡因子釋放，激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵效應(yīng)分子，其激活是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志。RNA干擾STAT3基因后，通過調(diào)節(jié)這些凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，激活了內(nèi)源性凋亡信號通路，促進(jìn)了SW620細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白方面，實(shí)驗組中CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低，為對照組的0.38倍（P<0.01），而p21蛋白表達(dá)水平明顯升高，是對照組的2.05倍（P<0.01）。CyclinD1是細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，它與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，可與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，使細(xì)胞阻滯在G1期。RNA干擾STAT3基因后，降低了CyclinD1的表達(dá)，同時上調(diào)了p21的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制了細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白方面，實(shí)驗組中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著下降，分別為對照組的0.45倍和0.39倍（P<0.01）。MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，它們能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。RNA干擾STAT3基因后，抑制了MMP-2和MMP-9的表達(dá)，從而降低了SW620細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。綜合以上實(shí)驗結(jié)果，RNA干擾STAT3基因促進(jìn)SW620細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制可能是通過抑制STAT3基因的表達(dá)，激活p53介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡信號通路，調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，激活Caspase-3，引發(fā)細(xì)胞凋亡。RNA干擾STAT3基因還通過調(diào)控CyclinD1、p21等細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制細(xì)胞增殖。RNA干擾STAT3基因降低了MMP-2和MMP-9等癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。這些機(jī)制相互作用，共同促進(jìn)了SW620細(xì)胞凋亡，為結(jié)腸癌的治療提供了潛在的分子靶點(diǎn)和理論依據(jù)。五、結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論本研究通過構(gòu)建針對STAT3基因的RNA干擾載體，并將其轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620中，深入探討了RNA干擾STAT3基因?qū)W620細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制，取得了以下主要研究成果：成功構(gòu)建shRNA-STAT3表達(dá)載體：通過設(shè)計并合成針對STAT3基因的短發(fā)夾RNA（shRNA）序列，將其克隆