RNAi沉默STAT3基因?qū)EL-7402肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)機(jī)制探究

RNAi沉默STAT3基因?qū)EL-7402肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義肝癌，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率長(zhǎng)期居高不下，已然成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待攻克的難題。據(jù)權(quán)威統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在2018年，中國(guó)新發(fā)肝癌病例高達(dá)39萬(wàn)余人，在新發(fā)惡性腫瘤中位居第三位；同年，因肝癌離世的人數(shù)約為36萬(wàn)，死亡人數(shù)亦居惡性腫瘤第三位，且全世界約47%的肝癌病例發(fā)生在中國(guó)。中國(guó)肝癌的高發(fā)與乙型肝炎的大面積流行密切相關(guān)，盡管目前乙肝陽(yáng)性率有所下降，但龐大的人口基數(shù)致使中國(guó)肝癌患者數(shù)量在全球范圍內(nèi)遙遙領(lǐng)先。肝癌的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，涉及多基因、多信號(hào)通路的異常改變。其中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）在肝癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中扮演著至關(guān)重要的角色。STAT3屬于STATs家族成員，正常生理狀態(tài)下，其處于非激活狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，STAT3被激活，發(fā)生磷酸化，進(jìn)而轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過(guò)程。在肝癌細(xì)胞中，STAT3常呈現(xiàn)組成型激活狀態(tài)，持續(xù)激活的STAT3可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，同時(shí)還能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供有利條件。諸多研究表明，STAT3的高表達(dá)與肝癌患者的不良預(yù)后緊密相關(guān)，因此，靶向STAT3有望成為肝癌治療的關(guān)鍵策略。隨著基因治療技術(shù)的迅猛發(fā)展，RNA干擾（RNAi）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，為肝癌的治療帶來(lái)了新的曙光。RNAi是一種由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入與靶基因同源的dsRNA時(shí)，dsRNA被核酸酶切割為小干擾RNA（siRNA），siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）結(jié)合，識(shí)別并降解同源的mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的特異性抑制。RNAi技術(shù)具有高效性、特異性、可設(shè)計(jì)性強(qiáng)等顯著優(yōu)勢(shì)，能夠精準(zhǔn)地靶向特定基因，抑制其表達(dá)，為肝癌的基因治療提供了有力的工具。通過(guò)RNAi技術(shù)沉默STAT3基因，阻斷STAT3信號(hào)通路，有望從分子水平上抑制肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，為肝癌的治療開辟新的路徑。本研究旨在深入探討RNAi沉默STAT3基因?qū)EL-7402肝癌細(xì)胞凋亡的影響及其潛在機(jī)制。通過(guò)該研究，一方面能夠進(jìn)一步揭示STAT3基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，豐富肝癌的分子生物學(xué)理論；另一方面，為基于RNAi技術(shù)的肝癌基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持，推動(dòng)肝癌治療技術(shù)的創(chuàng)新與發(fā)展，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在肝癌研究領(lǐng)域，STAT3與肝癌的關(guān)聯(lián)一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。國(guó)外方面，諸多研究深入揭示了STAT3在肝癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用機(jī)制。例如，有研究表明STAT3的持續(xù)激活可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等基因的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而加速細(xì)胞增殖。在抑制細(xì)胞凋亡方面，STAT3被發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的水平，同時(shí)下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的凋亡。此外，在肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移方面，STAT3可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）如MMP-2和MMP-9的表達(dá)，這些酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。國(guó)內(nèi)研究也在這一領(lǐng)域取得了豐碩成果。有團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)臨床肝癌組織樣本的檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)STAT3的磷酸化水平與肝癌的病理分級(jí)、腫瘤大小以及患者的預(yù)后密切相關(guān)，磷酸化STAT3高表達(dá)的患者往往預(yù)后較差。在機(jī)制研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)STAT3還可以通過(guò)調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug和Twist的表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。隨著RNAi技術(shù)的興起，其在肝癌研究中的應(yīng)用也日益廣泛。國(guó)外率先開展了一系列將RNAi技術(shù)應(yīng)用于肝癌治療的探索性研究。有研究將針對(duì)STAT3基因的siRNA轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞系中，成功沉默了STAT3基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的增殖能力顯著下降，細(xì)胞凋亡明顯增加，并且在裸鼠移植瘤模型中，注射siRNA-STAT3的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減緩。此外，為了提高RNAi治療的靶向性和穩(wěn)定性，國(guó)外科研人員還致力于研發(fā)新型的遞送系統(tǒng)，如脂質(zhì)納米粒（LNP）、聚合物納米粒等，這些納米載體能夠有效地包裹siRNA，保護(hù)其免受核酸酶的降解，并實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向遞送。國(guó)內(nèi)在RNAi技術(shù)治療肝癌的研究方面也緊跟國(guó)際步伐。眾多科研團(tuán)隊(duì)通過(guò)構(gòu)建針對(duì)不同肝癌相關(guān)基因（包括STAT3）的shRNA表達(dá)載體，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物模型中均取得了顯著的抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的效果。例如，有研究利用慢病毒載體將shRNA-STAT3導(dǎo)入肝癌細(xì)胞，不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)STAT3基因的長(zhǎng)期穩(wěn)定沉默，還發(fā)現(xiàn)該處理能夠抑制肝癌細(xì)胞的克隆形成能力，降低其在小鼠體內(nèi)的成瘤性。同時(shí)，國(guó)內(nèi)也在積極探索RNAi與其他治療方法如化療、免疫治療的聯(lián)合應(yīng)用策略，期望通過(guò)協(xié)同作用進(jìn)一步提高肝癌的治療效果。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究的主要目的在于深入剖析RNAi沉默STAT3基因?qū)EL-7402肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，并詳盡闡明其內(nèi)在分子機(jī)制。具體而言，通過(guò)化學(xué)合成針對(duì)STAT3基因的siRNA，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將其導(dǎo)入BEL-7402肝癌細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)對(duì)STAT3基因表達(dá)的特異性沉默。隨后，借助多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)、Westernblot等，從細(xì)胞增殖、凋亡、相關(guān)蛋白表達(dá)等多個(gè)層面，系統(tǒng)地檢測(cè)RNAi沉默STAT3基因后對(duì)BEL-7402肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。期望通過(guò)本研究，能夠進(jìn)一步揭示STAT3基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用機(jī)制，為基于RNAi技術(shù)的肝癌基因治療提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支撐。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。首先，在研究視角上具有獨(dú)特性。當(dāng)前針對(duì)STAT3基因與肝癌關(guān)系的研究雖多，但多數(shù)集中于單一通路或機(jī)制的探討。本研究將RNAi技術(shù)與肝癌細(xì)胞凋亡機(jī)制研究相結(jié)合，從多維度深入探究RNAi沉默STAT3基因?qū)Ω伟┘?xì)胞凋亡的影響，不僅關(guān)注STAT3基因本身的變化，還全面分析其下游相關(guān)信號(hào)通路及凋亡相關(guān)蛋白的改變，有望揭示更為全面和深入的分子機(jī)制。其次，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上具有創(chuàng)新性。本研究采用化學(xué)合成的siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，相較于傳統(tǒng)的病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、安全性高、免疫原性低等優(yōu)勢(shì)，能夠更精準(zhǔn)地實(shí)現(xiàn)對(duì)STAT3基因的沉默。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中設(shè)置了嚴(yán)格的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，包括陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。此外，本研究還將嘗試聯(lián)合其他治療手段，如化療藥物或免疫治療藥物，與RNAi沉默STAT3基因協(xié)同作用，探索新的肝癌治療策略，為臨床治療提供更多的思路和方法。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1STAT3基因與信號(hào)通路2.1.1STAT3基因結(jié)構(gòu)與功能STAT3基因在人類中定位于第17號(hào)染色體（q21.1～q21.2），其編碼產(chǎn)物STAT3蛋白是一種具有重要生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄因子，由6個(gè)功能保守結(jié)構(gòu)域組成。氨基末端結(jié)構(gòu)域（NTD）位于STAT3蛋白的N端，參與STAT3蛋白的四聚體化，對(duì)維持蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定可能具有重要作用，進(jìn)而影響其在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)和功能發(fā)揮。螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域（CCD）能夠介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，使STAT3與其他相關(guān)蛋白結(jié)合，形成功能復(fù)合物，參與細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）可特異性識(shí)別并結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定DNA序列，如γ干擾素激活位點(diǎn)（GAS）元件，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，決定了STAT3對(duì)下游基因的靶向性調(diào)節(jié)作用。連接結(jié)構(gòu)域（Linker）起到連接不同結(jié)構(gòu)域的作用，維持STAT3蛋白整體結(jié)構(gòu)的完整性，保障各結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)同功能。SRC同源2結(jié)構(gòu)域（SH2）在STAT3的激活和二聚化過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色，它能夠與磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合，當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，STAT3的SH2結(jié)構(gòu)域與受體上磷酸化的酪氨酸位點(diǎn)相互作用，促進(jìn)STAT3的磷酸化和二聚體形成。羧基末端反式激活結(jié)構(gòu)域（TAD）負(fù)責(zé)招募轉(zhuǎn)錄輔助因子，與轉(zhuǎn)錄機(jī)器相互作用，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄活性，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)。在正常生理狀態(tài)下，STAT3主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，處于非激活狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到白介素6（IL-6）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）等多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子刺激時(shí)，受體發(fā)生寡聚化，激活與之相關(guān)的Janus激酶（JAK）或非受體酪氨酸激酶（Src）。這些激酶將STAT3的酪氨酸殘基705位點(diǎn)（Tyr705）磷酸化，磷酸化后的STAT3通過(guò)SH2結(jié)構(gòu)域形成同源或異源二聚體，隨后二聚體轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定DNA序列結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，從而參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過(guò)程。例如，在胚胎發(fā)育早期，STAT3基因缺陷的胚胎在約7.5天左右就會(huì)死亡，表明STAT3在早期發(fā)育過(guò)程中起著不可或缺的作用，但具體的激活因子和作用位點(diǎn)在胚胎期尚未完全明確。在粒細(xì)胞生成過(guò)程中，粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）與受體結(jié)合，激活下游的JAK激酶，進(jìn)而使STAT3磷酸化激活，活性升高的STAT3可促進(jìn)粒細(xì)胞的增殖反應(yīng)。在表皮細(xì)胞中，HGF刺激能夠激活STAT3，促進(jìn)小管的生長(zhǎng)。在巨噬細(xì)胞內(nèi)，IL-10依賴活性STAT3發(fā)揮其抗炎特性。此外，STAT3還參與細(xì)胞周期的調(diào)控，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，推動(dòng)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞凋亡調(diào)控方面，STAT3可以調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的水平，同時(shí)下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞的存活。2.1.2JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，其激活過(guò)程較為復(fù)雜且精細(xì)。當(dāng)細(xì)胞外的細(xì)胞因子（如IL-6、IL-10、IL-21等）、生長(zhǎng)因子（如EGF、PDGF等）或激素等配體與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合后，受體發(fā)生二聚化（可以是同源二聚化或異源二聚化）。以IL-6與其受體結(jié)合為例，IL-6首先與IL-6受體（IL-6R）結(jié)合，形成IL-6/IL-6R復(fù)合物，然后該復(fù)合物與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)亞基gp130結(jié)合，導(dǎo)致gp130的二聚化。受體二聚化使得與之結(jié)合的Janus激酶（JAK）家族成員發(fā)生相互磷酸化而激活。JAK家族包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2，它們具有非受體酪氨酸激酶活性，每個(gè)JAK蛋白含有7個(gè)同源結(jié)構(gòu)域（JH1-JH7），其中JH1結(jié)構(gòu)域?yàn)榧っ竻^(qū)，負(fù)責(zé)催化底物的磷酸化。激活后的JAK激酶通過(guò)其激酶活性，使受體胞內(nèi)段的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，形成具有招募功能的磷酸酪氨酸位點(diǎn)。STAT3蛋白通過(guò)其SH2結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合到受體上磷酸化的酪氨酸位點(diǎn)，被招募到受體復(fù)合物附近。隨后，JAK激酶將STAT3的Tyr705位點(diǎn)磷酸化，使STAT3激活。磷酸化的STAT3分子之間通過(guò)SH2結(jié)構(gòu)域與另一個(gè)STAT3分子的磷酸酪氨酸（pTyr705）相互作用，形成同源或異源二聚體。這種二聚體化改變了STAT3的構(gòu)象，暴露出其核定位信號(hào)（NLS）。在核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的協(xié)助下，STAT3二聚體從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)。進(jìn)入細(xì)胞核后，STAT3二聚體與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定DNA序列（如GAS元件）結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄輔助因子，如CBP/p300等，與RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄機(jī)器相互作用，啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)。例如，STAT3與VEGF啟動(dòng)子結(jié)合后，可上調(diào)腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤新生血管的形成；與MMP-2啟動(dòng)子結(jié)合，能上調(diào)MMP-2表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起著至關(guān)重要的作用。在多種腫瘤細(xì)胞中，該信號(hào)通路常呈現(xiàn)持續(xù)激活狀態(tài)。例如，在肝癌細(xì)胞中，由于乙肝病毒感染、基因突變或腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子的異常分泌等因素，導(dǎo)致JAK/STAT3信號(hào)通路過(guò)度激活。持續(xù)激活的STAT3可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，通過(guò)上調(diào)CyclinD1和c-myc等基因的表達(dá)，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，使腫瘤細(xì)胞獲得不受控制的增殖能力。同時(shí)，STAT3能夠抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，增加抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的水平，降低促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的凋亡調(diào)控機(jī)制。此外，STAT3還參與腫瘤血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程。在血管生成方面，STAT3可誘導(dǎo)VEGF等血管生成因子的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，為腫瘤生長(zhǎng)提供充足的血液供應(yīng)。在侵襲轉(zhuǎn)移方面，STAT3通過(guò)上調(diào)MMPs（如MMP-2和MMP-9）的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞組織屏障，使腫瘤細(xì)胞能夠突破基底膜，侵入周圍組織和血管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。同時(shí)，STAT3還可以調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug和Twist的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程，使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，STAT3的持續(xù)激活還能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。例如，STAT3可誘導(dǎo)腫瘤組織中樹突狀細(xì)胞的異常分化，抑制其抗原呈遞功能，阻止樹突狀細(xì)胞成熟，從而使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視；還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌免疫抑制因子，如IL-10等，抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，降低機(jī)體的免疫防御能力。2.2RNAi技術(shù)原理與應(yīng)用2.2.1RNAi作用機(jī)制RNAi現(xiàn)象最早于1998年被發(fā)現(xiàn)，是一種由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。這一過(guò)程涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟和分子，其作用機(jī)制復(fù)雜且精細(xì)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入dsRNA時(shí)，起始階段隨即開啟。這些dsRNA的來(lái)源多樣，既可以是外源導(dǎo)入的，如通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段將特定的dsRNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)；也可能源于轉(zhuǎn)基因、病毒感染等過(guò)程，例如某些病毒在感染細(xì)胞后會(huì)產(chǎn)生dsRNA中間體。細(xì)胞內(nèi)的核酸酶Dicer酶發(fā)揮關(guān)鍵作用，它屬于RNaseⅢ家族，能夠特異性識(shí)別dsRNA。Dicer酶以一種ATP依賴的方式對(duì)dsRNA進(jìn)行逐步切割，將其切割成長(zhǎng)約21-23nt的雙鏈小分子干擾RNA（siRNA）。siRNA的每條單鏈的3’端都帶有2個(gè)突出的非配對(duì)堿基，多數(shù)情況下為UU，這種結(jié)構(gòu)特征使其成為識(shí)別靶RNA的重要標(biāo)志，siRNA的生成也正式啟動(dòng)了RNAi反應(yīng)。進(jìn)入效應(yīng)階段，siRNA會(huì)結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物，進(jìn)而形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）。RISC是RNAi發(fā)揮作用的核心組件，它由內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA搜索活性蛋白等四種成分組成。在激活RISC的過(guò)程中，需要一個(gè)ATP依賴的將siRNA解雙鏈的過(guò)程。活化后的RISC具備了對(duì)靶mRNA的識(shí)別和切割能力，它能夠精準(zhǔn)地定位到與siRNA中的反義鏈互補(bǔ)的靶mRNA轉(zhuǎn)錄本上。RISC會(huì)在距離siRNA3’端12個(gè)堿基的位置對(duì)mRNA進(jìn)行切割，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶mRNA的降解，阻斷其翻譯過(guò)程，最終達(dá)到基因沉默的效果。通過(guò)遺傳分析方法發(fā)現(xiàn)，線蟲中的RDE-1、MUT-7和DNA/RNA解旋酶及其他PAZ/Piwi蛋白也參與到該階段的反應(yīng)，進(jìn)一步豐富了RNAi效應(yīng)階段的分子機(jī)制。此外，RNAi還可能通過(guò)其他機(jī)制影響基因表達(dá)，如觸發(fā)染色質(zhì)固縮、DNA甲基化等，從表觀遺傳學(xué)層面調(diào)控基因的表達(dá)水平。2.2.2RNAi在腫瘤研究中的應(yīng)用RNAi技術(shù)憑借其高效性、特異性和可設(shè)計(jì)性強(qiáng)等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在腫瘤研究領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，為腫瘤的發(fā)病機(jī)制研究、診斷和治療開辟了全新的道路。在腫瘤基因功能研究方面，RNAi技術(shù)為科研人員提供了強(qiáng)大的工具，使得深入探究腫瘤相關(guān)基因的功能成為可能。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)特定基因的siRNA或shRNA，能夠特異性地沉默腫瘤細(xì)胞中目標(biāo)基因的表達(dá)?？蒲腥藛T可以觀察基因沉默后腫瘤細(xì)胞在增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為上的變化，從而明確該基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體作用。在對(duì)乳腺癌細(xì)胞的研究中，利用RNAi技術(shù)沉默了表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，表明EGFR基因在乳腺癌細(xì)胞的增殖過(guò)程中起著關(guān)鍵的促進(jìn)作用。在肝癌研究中，通過(guò)RNAi沉默c-myc基因，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的克隆形成能力顯著下降，細(xì)胞凋亡增加，揭示了c-myc基因在肝癌細(xì)胞存活和增殖調(diào)控中的重要作用。通過(guò)這種方式，科研人員能夠逐步揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中復(fù)雜的分子機(jī)制，為腫瘤的防治提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。在治療靶點(diǎn)篩選方面，RNAi技術(shù)也發(fā)揮著不可或缺的作用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的異常改變，尋找有效的治療靶點(diǎn)是腫瘤治療的關(guān)鍵。運(yùn)用RNAi技術(shù)，可以對(duì)大量潛在的腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行系統(tǒng)性的功能篩選。通過(guò)高通量實(shí)驗(yàn)，同時(shí)沉默多個(gè)基因，觀察腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)，能夠快速準(zhǔn)確地篩選出對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、存活至關(guān)重要的基因，這些基因有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。在對(duì)肺癌細(xì)胞的研究中，利用RNAi文庫(kù)對(duì)數(shù)千個(gè)基因進(jìn)行了沉默篩選，成功鑒定出多個(gè)與肺癌細(xì)胞增殖和存活密切相關(guān)的基因，為肺癌的靶向治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。此外，結(jié)合生物信息學(xué)分析和功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，能夠進(jìn)一步確定這些靶點(diǎn)的有效性和特異性，提高治療靶點(diǎn)篩選的效率和準(zhǔn)確性。在腫瘤治療策略開發(fā)方面，RNAi技術(shù)為腫瘤的基因治療帶來(lái)了新的希望?；赗NAi原理，可以設(shè)計(jì)針對(duì)腫瘤關(guān)鍵基因的siRNA或shRNA，通過(guò)合適的遞送系統(tǒng)將其導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤相關(guān)基因的特異性沉默，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)其凋亡。針對(duì)STAT3基因的siRNA，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方式導(dǎo)入肝癌細(xì)胞中，能夠有效沉默STAT3基因的表達(dá)，阻斷STAT3信號(hào)通路，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在肝癌的治療中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。為了提高RNAi治療的效果和安全性，科研人員還在不斷探索新型的遞送系統(tǒng)和聯(lián)合治療策略。開發(fā)了脂質(zhì)納米粒（LNP）、聚合物納米粒、外泌體等新型遞送載體，這些載體能夠有效地包裹siRNA，保護(hù)其免受核酸酶的降解，提高細(xì)胞攝取效率，并實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向遞送。此外，將RNAi與傳統(tǒng)的化療、放療、免疫治療等方法聯(lián)合應(yīng)用，能夠發(fā)揮協(xié)同作用，增強(qiáng)治療效果，減少藥物的副作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將針對(duì)腫瘤血管生成相關(guān)基因的siRNA與化療藥物聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)不僅能夠抑制腫瘤血管生成，還能增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。2.3BEL-7402肝癌細(xì)胞特性BEL-7402肝癌細(xì)胞株于1974年從臨床肝癌手術(shù)標(biāo)本中成功建立，其來(lái)源明確，為深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)制、生物學(xué)行為以及治療靶點(diǎn)提供了寶貴的實(shí)驗(yàn)材料。在細(xì)胞形態(tài)方面，BEL-7402肝癌細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的上皮樣細(xì)胞形態(tài)。在光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞多呈多邊形，邊界較為清晰，細(xì)胞之間緊密相連，形成類似上皮組織的結(jié)構(gòu)。細(xì)胞體積較大，細(xì)胞核相對(duì)明顯，核質(zhì)比適中，具有豐富的細(xì)胞器，這些形態(tài)特征與正常肝細(xì)胞存在顯著差異，反映了其惡性腫瘤細(xì)胞的特性。通過(guò)電子顯微鏡進(jìn)一步觀察，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞具有上皮細(xì)胞所特有的橋粒和張力原纖維，這不僅證實(shí)了其上皮樣細(xì)胞的屬性，還表明其在細(xì)胞連接和維持細(xì)胞形態(tài)方面具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，與臨床肝癌細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)相似，為研究肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。從生長(zhǎng)特性來(lái)看，BEL-7402肝癌細(xì)胞群體倍增時(shí)間約為20小時(shí)，這表明其生長(zhǎng)速度相對(duì)較快。在適宜的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞能夠迅速增殖，在體外培養(yǎng)過(guò)程中，通常6-7天即可進(jìn)行一次傳代。當(dāng)細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中后，在較短時(shí)間內(nèi)就能貼壁生長(zhǎng)，并逐漸鋪滿瓶底。在細(xì)胞生長(zhǎng)曲線中，呈現(xiàn)出典型的指數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞數(shù)量快速增加，代謝活動(dòng)也極為旺盛。細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)在分瓶培養(yǎng)第四天時(shí)約為7%，這顯示出細(xì)胞具有較高的增殖活性，不斷通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生新的細(xì)胞，以滿足其快速生長(zhǎng)的需求。此外，BEL-7402肝癌細(xì)胞在移植到處理過(guò)的wistar大鼠體內(nèi)后，能夠形成腫瘤結(jié)節(jié)，這進(jìn)一步證明了其在體內(nèi)也具有較強(qiáng)的成瘤能力，可用于構(gòu)建動(dòng)物模型，研究肝癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及藥物治療效果等。在生物學(xué)特征方面，BEL-7402肝癌細(xì)胞具有一系列獨(dú)特的表現(xiàn)。其染色體數(shù)為不足三倍體，并且存在一個(gè)異常的近端著絲點(diǎn)染色體，這種染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的異常是腫瘤細(xì)胞的重要遺傳學(xué)特征之一，可能與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、增殖失控以及其他生物學(xué)行為改變密切相關(guān)。通過(guò)間接免疫熒光法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的甲胎蛋白（AFP）呈陽(yáng)性反應(yīng)。AFP是一種重要的肝癌標(biāo)志物，在正常成人肝細(xì)胞中表達(dá)量極低，但在肝癌細(xì)胞中常常高表達(dá)，BEL-7402肝癌細(xì)胞AFP陽(yáng)性，表明其具有肝癌細(xì)胞的特異性標(biāo)志物特征，可用于細(xì)胞的鑒定和相關(guān)研究。在酶譜分析方面，LDH同工酶譜顯示該細(xì)胞與成年人肝細(xì)胞不同，而與人胚肝及臨床肝癌相近。這一特征反映了BEL-7402肝癌細(xì)胞在代謝酶表達(dá)上的異常，提示其代謝途徑可能發(fā)生了改變，以適應(yīng)腫瘤細(xì)胞快速增殖和生存的需求，同時(shí)也為研究肝癌細(xì)胞的代謝機(jī)制提供了線索。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本研究選用的BEL-7402肝癌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細(xì)胞株于1974年從臨床肝癌手術(shù)標(biāo)本中成功建立，具有明確的來(lái)源和特性。BEL-7402肝癌細(xì)胞呈上皮樣細(xì)胞形態(tài)，在光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞多為多邊形，邊界清晰，細(xì)胞間緊密相連。細(xì)胞群體倍增時(shí)間約為20小時(shí)，生長(zhǎng)速度較快。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，將其置于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）中，于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基需定期更換，一般每2-3天更換一次，以保證細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，需進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中，T25瓶加入1-2mL，T75瓶加入2-3mL，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液，然后在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2-1：5的比例分到新的培養(yǎng)瓶中，添加適量按照說(shuō)明書要求配置的新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的雄性BALB/c裸鼠，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。裸鼠體重在18-22g之間，健康狀況良好，無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)。將裸鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，室內(nèi)溫度控制在22±2℃，相對(duì)濕度維持在40%-70%。動(dòng)物房?jī)?nèi)保持通風(fēng)良好，光照采用12h光照/12h黑暗的循環(huán)模式。裸鼠自由攝取滅菌后的飼料和飲水，飼料為標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒類動(dòng)物飼料，飲水經(jīng)過(guò)高溫滅菌處理。在實(shí)驗(yàn)前，裸鼠需適應(yīng)環(huán)境1周，以減少環(huán)境變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密切觀察裸鼠的健康狀況，包括飲食、活動(dòng)、體重等指標(biāo)，如有異常情況及時(shí)處理。3.1.2主要試劑與儀器RNA提取試劑選用TRIzol試劑（Invitrogen公司），該試劑能夠高效地從細(xì)胞和組織中提取總RNA。其原理是利用TRIzol中的異硫氰酸胍和苯酚等成分，迅速裂解細(xì)胞，使核酸蛋白復(fù)合物解離，并使RNA釋放到溶液中。同時(shí)，TRIzol中的成分能夠抑制RNA酶的活性，保護(hù)RNA不被降解。逆轉(zhuǎn)錄試劑采用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司），該試劑盒能夠?qū)⑻崛〉腞NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于后續(xù)的PCR反應(yīng)。其中的gDNAEraser能夠有效去除基因組DNA的污染，提高逆轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確性。PCR試劑包括SYBRPremixExTaqⅡ（TaKaRa公司）、上下游引物（由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）。SYBRPremixExTaqⅡ中含有TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2?等成分，能夠在PCR反應(yīng)中特異性地?cái)U(kuò)增目的基因。上下游引物根據(jù)STAT3基因和內(nèi)參基因GAPDH的序列設(shè)計(jì)，具有高度的特異性，能夠準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出目的片段。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司），它是一種陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，能夠與核酸形成復(fù)合物，通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞作用將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。該試劑具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效地將針對(duì)STAT3基因的siRNA轉(zhuǎn)染到BEL-7402肝癌細(xì)胞中。此外，實(shí)驗(yàn)還用到了其他試劑，如DEPC水（Sigma公司），用于配制各種RNA相關(guān)的試劑，以防止RNA酶的污染；RIPA裂解液（Beyotime公司），用于裂解細(xì)胞，提取總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司），用于測(cè)定蛋白濃度；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（Beyotime公司），用于制備SDS-PAGE凝膠，進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳；PVDF膜（Millipore公司），用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜；一抗（anti-STAT3antibody、anti-cleavedCaspase-3antibody、anti-Bcl-2antibody、anti-Baxantibody等，CellSignalingTechnology公司），用于特異性地識(shí)別目的蛋白；二抗（HRP-conjugatedgoatanti-rabbitIgG，CellSignalingTechnology公司），與一抗結(jié)合，用于檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（ThermoFisherScientific公司），用于檢測(cè)轉(zhuǎn)膜后的蛋白信號(hào)。實(shí)驗(yàn)儀器主要包括PCR儀（AppliedBiosystems公司），用于進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增目的基因；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司），用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)的進(jìn)程，對(duì)目的基因進(jìn)行定量分析；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于觀察和記錄PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果；電泳儀（Bio-Rad公司），用于進(jìn)行核酸和蛋白質(zhì)的電泳分離；離心機(jī)（Eppendorf公司），用于分離細(xì)胞、沉淀蛋白質(zhì)等；CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的溫度、濕度和CO?濃度；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司），用于檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）中的吸光度值，如CCK-8實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司），用于分析細(xì)胞的凋亡、周期等生物學(xué)特性；恒溫?fù)u床（NewBrunswickScientific公司），用于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的振蕩培養(yǎng)，使細(xì)胞均勻分布，充分接觸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1免疫組織化學(xué)檢測(cè)STAT3在肝癌組織中的表達(dá)取臨床手術(shù)切除的肝癌組織標(biāo)本，將其迅速置于4%多聚甲醛溶液中固定24小時(shí)。固定完成后，將組織標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)脫水處理，依次經(jīng)過(guò)梯度酒精（70%、80%、90%、95%、100%）浸泡，每個(gè)梯度浸泡時(shí)間為1-2小時(shí)，以去除組織中的水分。隨后，將脫水后的組織浸入二甲苯中透明2次，每次15-20分鐘，使組織變得透明，便于后續(xù)石蠟的浸入。將透明后的組織放入融化的石蠟中進(jìn)行包埋，包埋時(shí)需注意組織的方向，確保切片時(shí)能夠獲得完整的組織結(jié)構(gòu)。將包埋好的組織蠟塊切成厚度為4μm的切片，將切片裱貼在經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，置于60℃烤箱中烘烤2小時(shí)，使切片牢固地附著在載玻片上。將烤好的切片進(jìn)行脫蠟處理，依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各10分鐘，以去除石蠟。然后進(jìn)行水化，依次經(jīng)過(guò)梯度酒精（100%、95%、90%、80%、70%）浸泡，每個(gè)梯度浸泡時(shí)間為5分鐘，使組織恢復(fù)到含水狀態(tài)。將水化后的切片放入檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中，進(jìn)行抗原修復(fù)。采用高壓抗原修復(fù)法，將切片放入高壓鍋中，加熱至噴氣后保持2-3分鐘，然后自然冷卻，以暴露被封閉的抗原表位。待切片冷卻后，用PBS沖洗3次，每次5分鐘，以去除緩沖液。在切片上滴加3%過(guò)氧化氫溶液，室溫孵育10-15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性背景染色。傾去封閉液，不洗，直接滴加兔抗人STAT3單克隆抗體（1:100稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，將切片從冰箱中取出，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育30分鐘。PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘。PBS沖洗3次，每次5分鐘。使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性信號(hào)時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，時(shí)間為1-2分鐘，然后用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用自來(lái)水沖洗返藍(lán)。依次經(jīng)過(guò)梯度酒精（70%、80%、90%、95%、100%）脫水，每個(gè)梯度浸泡時(shí)間為3-5分鐘。二甲苯透明2次，每次5-10分鐘。最后用中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察并采集圖像，分析STAT3蛋白在肝癌組織中的表達(dá)情況，陽(yáng)性表達(dá)以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為判斷標(biāo)準(zhǔn)。3.2.2靶向STAT3的RNA干擾載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank中人類STAT3基因序列（NM_003150.4），利用RNAi設(shè)計(jì)軟件（如Ambion公司的siRNATargetFinder）設(shè)計(jì)針對(duì)STAT3基因的小干擾RNA（siRNA）序列。設(shè)計(jì)的siRNA序列需滿足以下條件：長(zhǎng)度為19-21個(gè)核苷酸，GC含量在30%-50%之間，避免出現(xiàn)連續(xù)的4個(gè)或以上相同核苷酸，且與其他基因無(wú)明顯同源性。經(jīng)過(guò)篩選，確定的siRNA序列為：正義鏈5’-GCUACUUCUUGUGUACUUA-3’，反義鏈5’-UAAGUAACACAAGAAGUAGC-3’。同時(shí)，設(shè)計(jì)陰性對(duì)照siRNA序列，其序列與STAT3基因無(wú)同源性，用于排除非特異性干擾。以設(shè)計(jì)好的siRNA序列為模板，合成帶有黏性末端的雙鏈DNA寡核苷酸片段。合成的寡核苷酸片段兩端分別帶有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，以便后續(xù)與載體連接。將合成的雙鏈DNA寡核苷酸片段與經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切的pGPU6/GFP/Neo載體（上海吉瑪基因公司）進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系包括10×T4DNA連接酶緩沖液、T4DNA連接酶、載體片段和雙鏈DNA寡核苷酸片段，總體積為20μL。連接反應(yīng)條件為16℃孵育過(guò)夜，使雙鏈DNA寡核苷酸片段與載體通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)和連接酶的作用形成重組載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中。將感受態(tài)細(xì)胞從-80℃冰箱取出，冰上融化后，加入10μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30分鐘。然后將混合物置于42℃水浴中熱激90秒，迅速放回冰上冷卻2分鐘。加入900μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)并表達(dá)抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，使轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌形成單菌落。從平板上挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取重組質(zhì)粒，采用堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒提取。提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，用BamHⅠ和HindⅢ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系包括10×Buffer、BamHⅠ、HindⅢ和重組質(zhì)粒，總體積為20μL。37℃孵育2-3小時(shí)后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司（如上海生工生物工程股份有限公司）進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的siRNA序列進(jìn)行比對(duì)，確保重組載體構(gòu)建正確。3.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組處理將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEL-7402肝癌細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前，將Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑和針對(duì)STAT3基因的siRNA（或陰性對(duì)照siRNA）分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋。具體操作如下：取2個(gè)無(wú)菌EP管，分別標(biāo)記為A管和B管。在A管中加入5μLLipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，再加入125μLOpti-MEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。在B管中加入5μLsiRNA（終濃度為50nM）或陰性對(duì)照siRNA，再加入125μLOpti-MEM培養(yǎng)基，輕輕混勻。5分鐘后，將A管中的溶液緩慢加入B管中，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，使轉(zhuǎn)染試劑與siRNA形成復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2次，去除殘留的培養(yǎng)基。每孔加入870μLOpti-MEM培養(yǎng)基，再將上述孵育好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入孔中，輕輕搖勻。將6孔板放回37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時(shí)。4-6小時(shí)后，吸出轉(zhuǎn)染液，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)共分為3組：空白對(duì)照組，不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染處理，僅加入正常的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA，用于排除轉(zhuǎn)染試劑和非特異性RNA干擾對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；siRNA-STAT3組，轉(zhuǎn)染針對(duì)STAT3基因的siRNA，以實(shí)現(xiàn)對(duì)STAT3基因的沉默。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)分別收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。3.2.4檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集各組細(xì)胞。用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞2次，去除殘留的培養(yǎng)基。加入0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，37℃孵育1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用PBS重懸細(xì)胞，再次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。分別加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡率。AnnexinV是一種Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能夠與凋亡早期細(xì)胞的細(xì)胞膜上外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合。FITC是一種熒光素，標(biāo)記在AnnexinV上，使其在熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀下能夠發(fā)出綠色熒光。PI是一種核酸染料，能夠穿透壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，在流式細(xì)胞儀下發(fā)出紅色熒光。正常細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，PS位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，AnnexinV和PI均不能與之結(jié)合，表現(xiàn)為雙陰性；早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，但PS外翻，AnnexinV能夠與之結(jié)合，而PI不能穿透細(xì)胞膜，因此表現(xiàn)為AnnexinV陽(yáng)性、PI陰性；晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜受損，AnnexinV和PI均可與之結(jié)合，表現(xiàn)為雙陽(yáng)性。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同熒光強(qiáng)度的細(xì)胞比例，即可計(jì)算出細(xì)胞凋亡率。利用Hoechst33258熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，每孔接種5×10?個(gè)細(xì)胞，加入1mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞2次。加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定15-20分鐘。固定結(jié)束后，用PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。加入Hoechst33258染色液（1μg/mL），室溫避光孵育10-15分鐘。孵育后，用PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。將蓋玻片從24孔板中取出，置于載玻片上，滴加一滴抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，正常細(xì)胞核呈均勻的藍(lán)色熒光，而凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈現(xiàn)出亮藍(lán)色熒光。隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。Hoechst33258是一種能夠與DNA特異性結(jié)合的熒光染料，在紫外線激發(fā)下會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光。正常細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)完整，染色質(zhì)均勻分布，Hoechst33258與之結(jié)合后，細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻的藍(lán)色熒光。而凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)會(huì)發(fā)生濃縮、邊緣化等形態(tài)學(xué)改變，Hoechst33258與濃縮的染色質(zhì)結(jié)合后，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，在熒光顯微鏡下表現(xiàn)為亮藍(lán)色熒光。通過(guò)觀察細(xì)胞核的熒光形態(tài)和計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)，可直觀地判斷細(xì)胞凋亡情況。3.2.5檢測(cè)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的方法采用RT-PCR方法檢測(cè)STAT3及凋亡相關(guān)基因（如Bcl-2、Bax、Caspase-3等）的mRNA表達(dá)水平。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集各組細(xì)胞。按照TRIzol試劑說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA。取1μg總RNA，利用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括5×PrimeScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、OligodTPrimer、Random6mers和總RNA，總體積為20μL。反應(yīng)條件為37℃15分鐘，85℃5秒。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括2×SYBRPremixExTaqⅡ、上下游引物、cDNA模板和ddH?O，總體積為20μL。引物序列根據(jù)GenBank中基因序列設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。STAT3上游引物：5’-CCACCTACAGCAGCTACAAG-3’，下游引物：5’-CAGCAGTGTCCAGTGTAGAG-3’；Bcl-2上游引物：5’-GCGGATGGTGGAGAAGTTGT-3’，下游引物：5’-GTCCGGTGGTGAAGATGCTT-3’；Bax上游引物：5’-GACGCCAGGGTTTTTCTTGG-3’，下游引物：5’-GGCAGAGGGAGTGGTTGAGG-3’；Caspase-3上游引物：5’-GAGACGCTGGTGGTGACTAC-3’，下游引物：5’-GGCTGATGACAGTCCAGAGA-3’；GAPDH上游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀分析擴(kuò)增曲線和熔解曲線，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。運(yùn)用Westernblotting方法檢測(cè)STAT3及凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax、cleavedCaspase-3等）的表達(dá)水平。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集各組細(xì)胞。加入適量RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間不斷振蕩。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取30μg蛋白樣品，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳條件為80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，改為120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，利用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為25V、15-20分鐘。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗（anti-STAT3antibody1:1000稀釋、anti-Bcl-2antibody1:1000稀釋、anti-Baxantibody1:1000稀釋、anti-cleavedCaspase-3antibody1:1000稀釋）4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜與二抗（HRP-conjugatedgoatanti-rabbitIgG1:5000稀釋）室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1STAT3在肝癌組織中的表達(dá)情況通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)技術(shù)，對(duì)臨床手術(shù)切除獲取的肝癌組織標(biāo)本以及相應(yīng)的癌旁正常肝組織標(biāo)本進(jìn)行STAT3蛋白表達(dá)的檢測(cè)。結(jié)果顯示，在肝癌組織中，STAT3蛋白呈現(xiàn)出明顯的高表達(dá)狀態(tài)，陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)75%（45/60）。在顯微鏡下，可見(jiàn)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有棕黃色的陽(yáng)性染色顆粒，且染色強(qiáng)度較深，分布較為廣泛。其中，在部分分化程度較低、惡性程度較高的肝癌組織中，STAT3蛋白的表達(dá)更為顯著，陽(yáng)性染色顆粒密集分布，幾乎占據(jù)整個(gè)細(xì)胞。而在癌旁正常肝組織中，STAT3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率僅為20%（12/60）。正常肝細(xì)胞中，僅有少量細(xì)胞呈現(xiàn)出微弱的陽(yáng)性染色，染色顆粒稀疏，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核中幾乎未見(jiàn)陽(yáng)性染色。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，肝癌組織與癌旁正常肝組織中STAT3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明STAT3蛋白在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常肝組織。這一結(jié)果與既往相關(guān)研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了STAT3在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。4.2靶向STAT3的RNA干擾載體的構(gòu)建及鑒定結(jié)果利用RNAi設(shè)計(jì)軟件，針對(duì)STAT3基因成功設(shè)計(jì)出小干擾RNA（siRNA）序列，并通過(guò)一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)步驟構(gòu)建了靶向STAT3的RNA干擾載體。將合成的帶有黏性末端的雙鏈DNA寡核苷酸片段與經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切的pGPU6/GFP/Neo載體進(jìn)行連接，構(gòu)建重組載體。隨后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，經(jīng)篩選、培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒。對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖1所示。1號(hào)泳道為DNAMarker，用于指示DNA片段的大小；2號(hào)泳道為重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后的產(chǎn)物，可見(jiàn)明顯的兩條條帶，一條約為5000bp，與pGPU6/GFP/Neo載體線性化后的大小相符；另一條約為100bp，與設(shè)計(jì)的雙鏈DNA寡核苷酸片段大小一致，表明重組載體構(gòu)建成功。[此處插入酶切鑒定電泳圖，圖注：圖1重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖。1：DNAMarker；2：重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物]為進(jìn)一步驗(yàn)證重組載體的正確性，將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的siRNA序列進(jìn)行比對(duì)，完全一致，從而從序列層面證實(shí)了靶向STAT3的RNA干擾載體構(gòu)建正確，為后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染及功能研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。4.3siRNA-STAT3對(duì)BEL-7402肝癌細(xì)胞凋亡的影響通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染后48小時(shí)各組細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞凋亡率為(3.25±0.56)%，陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(3.87±0.62)%，兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。siRNA-STAT3組細(xì)胞凋亡率顯著升高，達(dá)到(25.63±2.14)%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明轉(zhuǎn)染siRNA-STAT3能夠有效誘導(dǎo)BEL-7402肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。從流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果的散點(diǎn)圖中可以清晰地看到，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組中，處于AnnexinV-FITC陰性和PI陰性象限（代表正常活細(xì)胞）的細(xì)胞比例較高，而處于AnnexinV-FITC陽(yáng)性和PI陰性象限（代表早期凋亡細(xì)胞）以及AnnexinV-FITC陽(yáng)性和PI陽(yáng)性象限（代表晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞）的細(xì)胞比例較低。相比之下，siRNA-STAT3組中處于早期凋亡和晚期凋亡象限的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，表明該組細(xì)胞凋亡明顯增加。[此處插入流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果圖，圖注：圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。A：空白對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：siRNA-STAT3組。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，**P<0.01]采用Hoechst33258熒光染色法進(jìn)一步觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果如圖3所示。在熒光顯微鏡下，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞核呈均勻的藍(lán)色熒光，形態(tài)規(guī)則，染色質(zhì)分布均勻。而siRNA-STAT3組細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)生了明顯的變化，可見(jiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈現(xiàn)出亮藍(lán)色熒光，部分細(xì)胞核出現(xiàn)碎裂現(xiàn)象，這些都是典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征。通過(guò)對(duì)隨機(jī)選取的5個(gè)視野中細(xì)胞的計(jì)數(shù)分析，空白對(duì)照組凋亡細(xì)胞百分比為(3.56±0.78)%，陰性對(duì)照組凋亡細(xì)胞百分比為(4.12±0.85)%，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。siRNA-STAT3組凋亡細(xì)胞百分比顯著升高至(24.85±2.36)%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這一結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了siRNA-STAT3能夠誘導(dǎo)BEL-7402肝癌細(xì)胞凋亡。[此處插入Hoechst33258熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果圖，圖注：圖3Hoechst33258熒光染色檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況（×400）。A：空白對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：siRNA-STAT3組。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，**P<0.01]4.4相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的變化采用RT-PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)染后48小時(shí)各組細(xì)胞中STAT3及凋亡相關(guān)基因（Bcl-2、Bax、Caspase-3）的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，siRNA-STAT3組中STAT3基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）?？瞻讓?duì)照組中STAT3基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1，陰性對(duì)照組中其相對(duì)表達(dá)量為0.98±0.05，兩組之間無(wú)明顯差異（P>0.05）。而siRNA-STAT3組中STAT3基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量降至0.32±0.03，表明轉(zhuǎn)染siRNA-STAT3能夠有效沉默BEL-7402肝癌細(xì)胞中STAT3基因的mRNA表達(dá)。在凋亡相關(guān)基因方面，siRNA-STAT3組中Bcl-2基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）?？瞻讓?duì)照組中Bcl-2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量為1，陰性對(duì)照組為0.95±0.04，siRNA-STAT3組降至0.45±0.04。相反，siRNA-STAT3組中Bax和Caspase-3基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）?？瞻讓?duì)照組中Bax基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量為1，陰性對(duì)照組為1.02±0.06，siRNA-STAT3組升高至2.35±0.12；Caspase-3基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量在空白對(duì)照組為1，陰性對(duì)照組為1.05±0.07，siRNA-STAT3組升高至2.86±0.15。這些結(jié)果表明，RNAi沉默STAT3基因可調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，促進(jìn)促凋亡基因Bax和Caspase-3的表達(dá)，抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。[此處插入RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)結(jié)果圖，圖注：圖4RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中STAT3及凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平。A：空白對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：siRNA-STAT3組。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，**P<0.01]運(yùn)用Westernblotting方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48小時(shí)各組細(xì)胞中STAT3及凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2、Bax、cleavedCaspase-3）的表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示。蛋白條帶的灰度值分析結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，siRNA-STAT3組中STAT3蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。空白對(duì)照組中STAT3蛋白的相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1，陰性對(duì)照組為0.96±0.04，兩組差異不顯著（P>0.05），siRNA-STAT3組中STAT3蛋白的相對(duì)表達(dá)量降至0.30±0.03，表明RNAi沉默STAT3基因在蛋白水平也取得了良好的效果。在凋亡相關(guān)蛋白方面，siRNA-STAT3組中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）?？瞻讓?duì)照組中Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1，陰性對(duì)照組為0.93±0.04，siRNA-STAT3組降至0.40±0.04。而siRNA-STAT3組中Bax和cleavedCaspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）?？瞻讓?duì)照組中Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1，陰性對(duì)照組為1.03±0.05，siRNA-STAT3組升高至2.40±0.13；cleavedCaspase-3蛋白在空白對(duì)照組中幾乎無(wú)表達(dá)，陰性對(duì)照組中表達(dá)量極低，相對(duì)表達(dá)量可忽略不計(jì)，siRNA-STAT3組中cleavedCaspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高至1.85±0.10。這進(jìn)一步證實(shí)了RNAi沉默STAT3基因能夠調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)促凋亡蛋白Bax和cleavedCaspase-3的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)BEL-7402肝癌細(xì)胞凋亡。[此處插入Westernblotting檢測(cè)蛋白表達(dá)結(jié)果圖，圖注：圖5Westernblotting檢測(cè)各組細(xì)胞中STAT3及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平。A：空白對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：siRNA-STAT3組。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，**P<0.01]五、結(jié)果討論5.1STAT3在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用分析本研究結(jié)果顯示，在肝癌組織中STAT3蛋白呈現(xiàn)出明顯的高表達(dá)狀態(tài)，陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)75%，顯著高于癌旁正常肝組織，這與過(guò)往大量研究結(jié)果相契合。諸多研究表明，STAT3在肝癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中扮演著多方面的關(guān)鍵角色。在細(xì)胞增殖調(diào)控方面，STAT3的持續(xù)激活可上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等基因的表達(dá)。CyclinD1能夠與CDK4結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化，從而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，使細(xì)胞從G1期順利進(jìn)入S期，推動(dòng)細(xì)胞增殖。在肝癌細(xì)胞中，異常激活的STAT3通過(guò)上調(diào)CyclinD1和CDK4的表達(dá)，促使細(xì)胞周期進(jìn)程加快，賦予肝癌細(xì)胞不受控制的增殖能力。在抑制細(xì)胞凋亡方面，STAT3主要通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL）和促凋亡蛋白（如Bax）。STAT3可上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的水平，同時(shí)下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。Bcl-2和Bcl-XL能夠抑制線粒體中細(xì)胞色素C的釋放，阻止凋亡小體的形成，從而抑制細(xì)胞凋亡。而Bax則具有促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放的作用，Bax表達(dá)下調(diào)使得細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)受到阻礙。通過(guò)這種方式，STAT3抑制了肝癌細(xì)胞的凋亡，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的凋亡調(diào)控機(jī)制，得以持續(xù)存活和增殖。在肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，STAT3也發(fā)揮著重要作用。一方面，STAT3可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）如MMP-2和MMP-9的表達(dá)。MMP-2和MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、層粘連蛋白等成分，破壞細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，為肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移開辟道路。另一方面，STAT3能夠調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug和Twist的表達(dá)。這些轉(zhuǎn)錄因子可以抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等的表達(dá)，使肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程。EMT過(guò)程使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。此外，STAT3還參與腫瘤血管生成過(guò)程，它可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成因子的表達(dá)。VEGF能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，為腫瘤生長(zhǎng)提供充足的血液供應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。綜上所述，STAT3在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)中均發(fā)揮著重要作用，是肝癌治療的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)。5.2RNAi沉默STAT3基因誘導(dǎo)BEL-7402肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制探討本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了RNAi沉默STAT3基因誘導(dǎo)BEL-7402肝癌細(xì)胞凋亡的內(nèi)在機(jī)制。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，RNAi沉默STAT3基因后，細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路和基因表達(dá)發(fā)生了顯著變化。在凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)方面，研究發(fā)現(xiàn)RNAi沉默STAT3基因可顯著降低Bcl-2基因和蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)顯著上調(diào)Bax和Caspase-3基因和蛋白的表達(dá)水平。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起著核心作用。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它能夠通過(guò)多種機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2可以與促凋亡蛋白Bax形成異源二聚體，從而抑制Bax的促凋亡活性。Bcl-2還能抑制線粒體中細(xì)胞色素C的釋放，細(xì)胞色素C的釋放是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟之一，它能與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活Caspase-9，引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而Bax是一種促凋亡蛋白，它可以在線粒體外膜上形成孔道，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。在本研究中，RNAi沉默STAT3基因后，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)，使得Bax/Bcl-2比值升高。這種比值的變化打破了細(xì)胞內(nèi)原有的凋亡平衡，使得細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶。在細(xì)胞凋亡信號(hào)的刺激下，Caspase-3前體被激活，裂解為具有活性的cleavedCaspase-3。活性Caspase-3可以作用于多種底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡形態(tài)學(xué)改變和DNA斷裂。本研究中，RNAi沉默STAT3基因后，Caspase-3基因和蛋白表達(dá)水平顯著升高，且cleavedCaspase-3蛋白表達(dá)量也明顯增加，表明Caspase-3被激活，進(jìn)而啟動(dòng)了細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。從信號(hào)通路角度分析，STAT3作為JAK/STAT3信號(hào)通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其基因被沉默后，JAK/STAT3信號(hào)通路被阻斷。正常情況下，JAK/STAT3信號(hào)通路的持續(xù)激活會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡。當(dāng)STAT3被沉默后，其下游一系列受調(diào)控的基因表達(dá)發(fā)生改變。STAT3無(wú)法激活其靶基因，如CyclinD1、Bcl-2等，從而抑制了細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力。由于STAT3的沉默，可能影響了其他相關(guān)信號(hào)通路的活性。有研究表明，STAT3信號(hào)通路與PI3K/AKT信號(hào)通路存在相互作用。在肝癌細(xì)胞中，STAT3的激活可以促進(jìn)PI3K/AKT信號(hào)通路的活化，而PI3K/AKT信號(hào)通路的激活又能進(jìn)一步增強(qiáng)STAT3的活性。當(dāng)RNAi沉默STAT3基因后，可能會(huì)打破這種相互促進(jìn)的關(guān)系，間接影響PI3K/AKT信號(hào)通路的活性，從而影響細(xì)胞的生存和凋亡。綜上所述，RNAi沉默STAT3基因誘導(dǎo)BEL-7402肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要是通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和Caspase-3等凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，改變Bax/Bcl-2比值，激活Caspase-3，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。同時(shí)，阻斷JAK/STAT3信號(hào)通路，影響其下游基因的表達(dá)，并可能間接影響其他相關(guān)信號(hào)通路，共同導(dǎo)致肝癌細(xì)胞凋亡。5.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果的臨床意義與應(yīng)用前景本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了RNAi沉默STAT3基因?qū)EL-7402肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其機(jī)制，這一成果在肝癌臨床治療領(lǐng)域具有重要的潛在意義。從臨床角度來(lái)看，肝癌作為一種惡性程度高、預(yù)后差的腫瘤，傳統(tǒng)治療方法如手術(shù)切除、化療和放療等往往存在諸多局限性。對(duì)于中晚期肝癌患者，手術(shù)切除的機(jī)會(huì)有限，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高；化療和放療雖然在一定程度上能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但同時(shí)也會(huì)對(duì)正常組織細(xì)胞造成損傷，產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降。而本研究中RNAi沉默STAT3基因能夠特異性地誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，為肝癌的治療提供了一種全新的、具有高度靶向性的治療策略，有望彌補(bǔ)傳統(tǒng)治療方法的不足，為肝癌患者帶來(lái)新的治療希望。在應(yīng)用前景方面，基于RNAi技術(shù)的STAT3基因沉默治療具有廣闊的發(fā)展空間。隨著對(duì)RNAi技術(shù)研究的不斷深入和完善，其在肝癌治療中的應(yīng)用將更加可行和有效。未來(lái)，可進(jìn)一步優(yōu)化RNAi載體的設(shè)計(jì)和遞送系統(tǒng)，提高siRNA的穩(wěn)定性、靶向性和細(xì)胞攝取效率，減少其在體內(nèi)的降解和非特異性作用。開發(fā)更加高效、安全的脂質(zhì)納米粒（LNP）、聚合物納米粒等遞送載體，能夠更好地將siRNA遞送至肝癌細(xì)胞內(nèi)，增強(qiáng)治療效果。此外，還可以探索RNAi與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用策略。將RNAi沉默STAT3基因與化療藥物聯(lián)合使用，可能通過(guò)協(xié)同作用增強(qiáng)對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效果，同時(shí)降低化療藥物的劑量和副作用。研究表明，在某些腫瘤模型中，聯(lián)合治療組的腫瘤抑制率明顯高于單一治療組，且對(duì)正常組織的損傷較小。RNAi還可以與免疫治療、靶向治療等方法相結(jié)合，充分發(fā)揮不同治療手段的優(yōu)勢(shì)，提高肝癌的綜合治療效果。從臨床轉(zhuǎn)化角度來(lái)看，本研究結(jié)果為開展臨床試驗(yàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。后續(xù)可進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證RNAi沉默STAT3基因治療肝癌的安全性和有效性。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，可構(gòu)建更加接近人類肝癌的動(dòng)物模型，如人肝癌細(xì)胞原位移植模型等，深入研究RNAi治療的效果和機(jī)制。通過(guò)臨床試驗(yàn)，評(píng)估RNAi治療對(duì)肝癌患者的療效、安全性、耐受性等指標(biāo)，為其臨床應(yīng)用提供充分的證據(jù)支持。若RNAi沉默STAT3基因治療在臨床試驗(yàn)中取得良好效果，有望成為肝癌治療的新方法，為肝癌患者的治療帶來(lái)革命性的變化。六、研究結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過(guò)一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)，深入探究了RNAi沉默STAT3基因?qū)EL-7402肝癌細(xì)胞凋亡的影響及其內(nèi)在分子機(jī)制，取得了一系列具有重要意義的研究成果。在肝癌組織中，STAT3蛋白呈現(xiàn)出高表達(dá)