Legumain促進胃癌生長和轉(zhuǎn)移的機制研究：從分子到臨床的深入剖析

Legumain促進胃癌生長和轉(zhuǎn)移的機制研究：從分子到臨床的深入剖析一、引言1.1研究背景胃癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計，每年全球約有大量新增胃癌病例，且死亡率居高不下。在我國，胃癌同樣是高發(fā)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在各類癌癥中均位居前列。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的多步驟過程，涉及多種基因和信號通路的異常改變。盡管目前胃癌的治療手段包括手術、化療、放療、靶向治療及免疫治療等取得了一定進展，但對于晚期胃癌患者，總體生存率仍不理想，5年生存率較低。這主要是由于胃癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，且腫瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復發(fā)。因此，深入探究胃癌的發(fā)病機制，尋找新的有效的治療靶點和生物標志物，對于提高胃癌的早期診斷率、改善患者預后具有至關重要的意義。Legumain又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶（AEP），是半胱氨酸蛋白酶C13家族的一個新成員。近年來，大量研究表明Legumain在多種惡性腫瘤組織中呈高表達狀態(tài)，并通過多種機制在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著關鍵作用。在腫瘤細胞增殖方面，Legumain可通過調(diào)節(jié)細胞周期相關蛋白的表達，促進腫瘤細胞的快速增殖，使腫瘤細胞獲得更強的生長優(yōu)勢。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中，Legumain能夠降解細胞外基質(zhì)成分，如纖維連接蛋白等，破壞細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性，為腫瘤細胞的遷移和侵襲創(chuàng)造有利條件；同時，它還可以激活其他蛋白酶，如明膠酶原，進一步增強腫瘤細胞降解細胞外基質(zhì)的能力，促進腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。此外，Legumain在腫瘤血管生成中也扮演重要角色，通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子等血管生成相關因子的表達和活性，促進腫瘤新生血管的形成，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應。在胃癌中，已有研究發(fā)現(xiàn)Legumain在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，且其高表達與胃癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預后密切相關。然而，目前關于Legumain促進胃癌生長和轉(zhuǎn)移的具體分子機制尚未完全明確，仍存在許多未知的環(huán)節(jié)和調(diào)控網(wǎng)絡有待深入研究。因此，進一步深入探討Legumain在胃癌中的作用機制，有望為胃癌的治療提供新的靶點和策略，為改善胃癌患者的預后帶來新的希望。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究Legumain促進胃癌生長和轉(zhuǎn)移的具體分子機制，明確其在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵作用環(huán)節(jié)，為胃癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體而言，通過體內(nèi)外實驗，觀察干擾或過表達Legumain對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲和體內(nèi)成瘤能力的影響；運用分子生物學技術，如蛋白質(zhì)免疫印跡、實時熒光定量PCR、免疫共沉淀等，研究Legumain調(diào)控胃癌生長和轉(zhuǎn)移相關的信號通路及關鍵分子，解析其上下游調(diào)控網(wǎng)絡；分析臨床胃癌組織樣本中Legumain的表達水平與患者臨床病理特征及預后的相關性，評估其作為胃癌診斷生物標志物和預后指標的潛在價值。胃癌作為嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，其高發(fā)病率和死亡率給患者及其家庭帶來沉重負擔。深入研究Legumain在胃癌中的作用機制具有重要的理論意義和臨床應用價值。在理論方面，有助于進一步揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，豐富對腫瘤生物學行為的認識，完善胃癌發(fā)病機制的理論體系，為后續(xù)相關研究提供重要參考。在臨床應用方面，若能明確Legumain是促進胃癌生長和轉(zhuǎn)移的關鍵分子，將為胃癌的靶向治療開辟新的方向。以Legumain為靶點開發(fā)特異性的抑制劑或拮抗劑，有望為胃癌患者提供更精準、有效的治療手段，提高治療效果，改善患者預后；同時，Legumain作為潛在的生物標志物，可用于胃癌的早期診斷和病情監(jiān)測，有助于實現(xiàn)胃癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，從而顯著降低胃癌的死亡率，具有重要的社會意義和經(jīng)濟價值。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，早期對Legumain的研究主要集中在其生物學特性和生理功能方面。隨著腫瘤研究的不斷深入，Legumain與腫瘤的關系逐漸受到關注。有研究通過對多種腫瘤細胞系的體外實驗發(fā)現(xiàn)，干擾Legumain的表達可顯著抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。在動物模型研究中，將過表達Legumain的腫瘤細胞接種到裸鼠體內(nèi)，腫瘤生長速度明顯加快，且更容易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移；而抑制Legumain表達后，腫瘤生長受到抑制，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量減少。在對胃癌的研究中，國外學者利用免疫組化等技術分析胃癌組織芯片及臨床樣本，發(fā)現(xiàn)Legumain在胃癌組織中的表達水平與腫瘤的分期、分級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)密切相關，高表達Legumain的胃癌患者總體生存率較低。同時，通過基因芯片和蛋白質(zhì)組學技術，篩選出了一些可能與Legumain相互作用的分子和信號通路，為進一步研究其作用機制奠定了基礎。在國內(nèi)，關于Legumain與胃癌的研究也取得了一系列成果。重慶醫(yī)科大學的研究團隊通過免疫組織化學染色方法檢測大量胃癌組織及癌旁正常組織中Legumain的表達，結(jié)果顯示胃癌組織中Legumain的高表達率顯著高于癌旁正常組織，且其表達與腫瘤遠處轉(zhuǎn)移、低分化等不良預后因素相關，多因素生存分析表明Legumain高表達是影響胃癌患者預后的獨立危險因素。另有研究針對幽門螺桿菌感染性胃癌組織展開，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中Legumain和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）呈過度表達，且兩者表達呈正相關，幽門螺桿菌陽性組中Legumain、MMP-9表達與患者性別、組織分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關，提示幽門螺桿菌感染可能通過影響Legumain等分子的表達參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。在機制研究方面，國內(nèi)學者從細胞周期調(diào)控、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、腫瘤血管生成等多個角度進行探索，發(fā)現(xiàn)Legumain可通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D1等分子的表達促進胃癌細胞的增殖；通過激活EMT相關信號通路，如TGF-β/Smad信號通路，誘導胃癌細胞發(fā)生EMT，增強其遷移和侵襲能力；還可通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子等血管生成因子的表達，促進胃癌組織新生血管的形成。然而，目前國內(nèi)外對于Legumain促進胃癌生長和轉(zhuǎn)移的分子機制研究仍存在一些不足之處。雖然已發(fā)現(xiàn)一些與Legumain相關的信號通路和分子，但這些通路和分子之間的相互作用網(wǎng)絡尚未完全闡明，存在許多未知的調(diào)控節(jié)點和反饋機制。對于Legumain在胃癌微環(huán)境中的作用，以及它如何與腫瘤相關巨噬細胞、成纖維細胞等其他細胞成分相互作用來促進腫瘤進展，研究還不夠深入。此外，針對Legumain開發(fā)的特異性抑制劑或靶向治療策略，目前大多還處于實驗室研究階段，在臨床應用中的有效性和安全性仍有待進一步驗證。二、胃癌概述2.1胃癌的流行病學胃癌是全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的重大公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率和死亡率在各類惡性腫瘤中始終占據(jù)較高比例。根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，當年全世界胃癌新發(fā)病例約108.9萬例，在所有惡性腫瘤發(fā)病人數(shù)中位居第五位；死亡病例數(shù)約76.9萬例，居惡性腫瘤死亡人數(shù)的第四位。這表明胃癌在全球范圍內(nèi)廣泛分布，給眾多患者及其家庭帶來沉重的痛苦和負擔，也對全球醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)造成巨大壓力。從地域分布來看，胃癌的發(fā)病率存在明顯的地區(qū)差異。亞洲地區(qū)是胃癌的高發(fā)區(qū)域，尤其是中國、日本和韓國等國家。其中，中國的胃癌發(fā)病情況尤為嚴峻。據(jù)中國國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)，2019年我國胃癌發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位列第二位，死亡率居第三位，是我國發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均遠高于世界平均水平。2020年，我國胃癌新發(fā)病例數(shù)約占全球發(fā)病總數(shù)的43.9%，死亡病例數(shù)約占全球死亡總數(shù)的48.6%，近乎占據(jù)全球胃癌發(fā)病和死亡人數(shù)的半壁江山。這種地域差異的形成與多種因素密切相關，包括不同地區(qū)的飲食習慣、幽門螺桿菌（Hp）感染率、環(huán)境因素以及遺傳易感性等。在亞洲國家，普遍存在高鹽飲食、腌制食品攝入較多的飲食習慣，這些食物中含有的亞硝酸鹽等致癌物質(zhì)在胃酸作用下可轉(zhuǎn)化為亞硝胺類化合物，長期攝入會增加胃癌的發(fā)病風險。同時，亞洲部分地區(qū)幽門螺桿菌感染率較高，幽門螺桿菌持續(xù)感染可引發(fā)胃黏膜慢性炎癥，進而導致胃黏膜上皮細胞損傷、增殖異常，最終促使胃癌的發(fā)生。在我國，胃癌的發(fā)病也呈現(xiàn)出一定的特點。農(nóng)村地區(qū)的胃癌發(fā)病率高于城市地區(qū)，這可能與農(nóng)村地區(qū)居民的生活條件、飲食結(jié)構(gòu)、衛(wèi)生習慣以及醫(yī)療資源可及性等因素有關。偏遠地區(qū)由于經(jīng)濟相對落后，居民的飲食中新鮮蔬菜水果攝入不足，而高鹽、腌制、熏制食品攝入較多，同時衛(wèi)生條件相對較差，幽門螺桿菌感染機會增加，這些因素共同作用，使得偏遠地區(qū)的胃癌發(fā)病率高于沿海等經(jīng)濟相對發(fā)達地區(qū)。此外，胃癌的發(fā)病還存在性別差異，男性胃癌的發(fā)病率約為女性的3倍，死亡率約為女性的2.7倍，主要高發(fā)年齡段集中在60-69歲的男性群體。男性不良的生活習慣，如吸煙、過量飲酒比例遠高于女性，加之社會壓力較大、飲食習慣不夠規(guī)律和健康，使得男性患胃癌的風險顯著增加。盡管近年來隨著人們生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整以及醫(yī)療衛(wèi)生條件的改善，全球及我國胃癌的發(fā)病率和死亡率總體上呈現(xiàn)出下降趨勢，但值得注意的是，胃癌發(fā)病人群卻出現(xiàn)了年輕化態(tài)勢，19歲至35歲青年人的胃癌發(fā)病率明顯上升。這可能與現(xiàn)代社會快節(jié)奏的生活方式、不健康的作息習慣（如熬夜、失眠等）以及不良的飲食習慣（如長期食用快餐、外賣，喜食辛辣、油膩、刺激性食物，飲食不規(guī)律等）密切相關。同時，工作和生活壓力增大，精神長期處于緊張、焦慮狀態(tài)，也可能通過影響機體的內(nèi)分泌和免疫功能，進而增加胃癌的發(fā)病風險。此外，幽門螺桿菌感染在年輕人群中依然較為普遍，這也是導致年輕人群胃癌發(fā)病率上升的重要因素之一。2.2胃癌的發(fā)病機制胃癌的發(fā)病機制極為復雜，涉及多種因素的相互作用，是一個多步驟、多階段的過程。從分子層面來看，基因的異常改變在胃癌發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用。原癌基因的激活和抑癌基因的失活是導致細胞惡性轉(zhuǎn)化的重要原因。原癌基因如Ras基因家族，在正常細胞中，其表達受到嚴格調(diào)控，參與細胞的正常生長、分化和增殖等生理過程。然而，當Ras基因發(fā)生點突變時，其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，持續(xù)激活下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，使細胞不受控制地增殖，從而引發(fā)腫瘤的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，在部分胃癌組織中存在Ras基因的點突變，突變頻率約為10%-30%，且突變的Ras基因與胃癌的侵襲性和不良預后相關。抑癌基因如p53基因，正常情況下，p53蛋白能夠監(jiān)控細胞基因組的完整性，當細胞DNA受到損傷時，p53蛋白被激活，通過誘導細胞周期阻滯、促進DNA修復或觸發(fā)細胞凋亡等機制，維持細胞基因組的穩(wěn)定性，防止細胞發(fā)生癌變。在胃癌發(fā)生過程中，p53基因常常發(fā)生突變或缺失，導致p53蛋白功能喪失，無法有效發(fā)揮其抑癌作用，使得受損DNA的細胞得以繼續(xù)存活和增殖，增加了細胞惡性轉(zhuǎn)化的風險。據(jù)統(tǒng)計，約50%-70%的胃癌組織中存在p53基因的異常改變。此外，一些與細胞周期調(diào)控、凋亡、DNA修復等相關的基因表達異常也與胃癌的發(fā)生密切相關。細胞周期蛋白D1（CyclinD1）基因的過表達可促進細胞周期進程，使細胞增殖加快，在胃癌組織中，CyclinD1的過表達率較高，且與胃癌的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關。除了基因?qū)用娴母淖?，環(huán)境因素在胃癌的發(fā)病中也扮演著重要角色。飲食因素是不可忽視的環(huán)境因素之一。長期高鹽飲食是胃癌發(fā)生的重要危險因素。高鹽食物可直接損傷胃黏膜上皮細胞，破壞胃黏膜的保護屏障，使胃黏膜更容易受到其他致癌物質(zhì)的侵襲。高鹽還可促進幽門螺桿菌的生長和定植，增強幽門螺桿菌的致病性，兩者協(xié)同作用，進一步增加胃癌的發(fā)病風險。腌制食品中含有大量的亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在胃內(nèi)酸性環(huán)境下可與食物中的二級胺結(jié)合，形成亞硝胺類化合物，亞硝胺具有強烈的致癌性，能夠誘導胃黏膜上皮細胞發(fā)生基因突變，引發(fā)細胞惡性轉(zhuǎn)化。有研究表明，經(jīng)常食用腌制食品的人群，其胃癌的發(fā)病風險比普通人群高出數(shù)倍。此外，長期缺乏新鮮蔬菜水果的攝入，導致機體抗氧化物質(zhì)（如維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素等）和微量元素（如硒等）攝入不足，這些物質(zhì)具有抗氧化、清除自由基的作用，能夠保護胃黏膜免受氧化損傷，減少致癌物質(zhì)的生成，缺乏時會使胃黏膜更容易受到損傷，增加胃癌的發(fā)病風險。幽門螺桿菌感染是胃癌發(fā)生的另一個重要環(huán)境因素，也是目前已知的第Ⅰ類生物致癌因子。幽門螺桿菌能夠在胃內(nèi)酸性環(huán)境中生存并定植于胃黏膜表面，通過分泌多種毒力因子，如細胞毒素相關基因A（CagA）蛋白、空泡毒素A（VacA）等，引發(fā)胃黏膜的慢性炎癥反應。CagA蛋白可通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)注入胃上皮細胞內(nèi)，激活一系列細胞內(nèi)信號通路，如Src家族激酶、絲裂原活化蛋白激酶等，導致細胞骨架重排、增殖異常和凋亡受阻，促進胃黏膜上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化。VacA則可使胃上皮細胞形成空泡樣變性，破壞細胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，同時還能抑制免疫細胞的活性，削弱機體的免疫防御能力，為胃癌的發(fā)生創(chuàng)造條件。長期的幽門螺桿菌感染可導致胃黏膜從慢性淺表性胃炎逐步發(fā)展為萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生，最終演變?yōu)槲赴?，這一過程被稱為“Correa序列”。研究顯示，幽門螺桿菌感染人群發(fā)生胃癌的風險比未感染人群高出3-6倍，全球約80%的胃癌發(fā)生與幽門螺桿菌感染有關。遺傳因素在胃癌發(fā)病中也具有一定的作用。家族聚集現(xiàn)象在胃癌中較為常見，約10%的胃癌患者有家族遺傳傾向。遺傳性彌漫型胃癌（HDGC）是一種具有明確遺傳背景的胃癌類型，主要由E-鈣黏蛋白（CDH1）基因的胚系突變引起。CDH1基因編碼的E-鈣黏蛋白是一種重要的細胞黏附分子，能夠維持上皮細胞之間的緊密連接，抑制細胞的遷移和侵襲。當CDH1基因發(fā)生突變時，E-鈣黏蛋白的表達和功能受損，導致細胞間黏附力下降，上皮細胞的極性和完整性被破壞，使得腫瘤細胞更容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。HDGC患者通常發(fā)病年齡較早，且多為彌漫型胃癌，病情進展迅速，預后較差。除了HDGC，還有其他一些遺傳綜合征與胃癌的發(fā)生風險增加相關，如林奇綜合征（Lynchsyndrome），該綜合征是由于DNA錯配修復基因（如MLH1、MSH2、MSH6、PMS2等）發(fā)生突變所致，患者不僅結(jié)直腸癌的發(fā)病風險顯著增加，胃癌等其他惡性腫瘤的發(fā)病風險也會升高。此外，一些基因多態(tài)性也可能影響個體對胃癌的易感性，如細胞色素P4502E1（CYP2E1）基因多態(tài)性與個體對亞硝胺類致癌物的代謝能力相關，某些基因型的個體可能對亞硝胺的解毒能力較弱，從而增加胃癌的發(fā)病風險。綜上所述，胃癌的發(fā)病是基因、環(huán)境和遺傳等多種因素相互作用的結(jié)果?；虻漠惓８淖?yōu)槲赴┑陌l(fā)生提供了內(nèi)在基礎，環(huán)境因素如飲食、幽門螺桿菌感染等則是誘發(fā)胃癌的重要外部因素，而遺傳因素在部分胃癌患者中起著關鍵作用，決定了個體對胃癌的易感性。深入研究這些因素及其相互作用機制，對于揭示胃癌的發(fā)病機制、制定有效的預防和治療策略具有重要意義。2.3胃癌的轉(zhuǎn)移途徑及危害胃癌的轉(zhuǎn)移是導致患者病情惡化和預后不良的重要因素，了解其轉(zhuǎn)移途徑及危害對于制定合理的治療策略和評估患者預后至關重要。胃癌主要有以下幾種轉(zhuǎn)移途徑。血行轉(zhuǎn)移：當胃癌發(fā)展到一定階段，腫瘤細胞可侵入血管，隨血液循環(huán)播散到全身各處。常見的轉(zhuǎn)移部位包括肝臟、肺、骨骼、腦等重要器官。肝臟是胃癌血行轉(zhuǎn)移最常見的靶器官之一，這主要是因為胃的靜脈血流首先回流至門靜脈，使得癌細胞容易通過門靜脈系統(tǒng)進入肝臟并定植生長。一旦癌細胞在肝臟形成轉(zhuǎn)移灶，會嚴重影響肝臟的正常功能，導致肝功能受損，出現(xiàn)黃疸、腹水、肝功能異常等癥狀，如膽紅素升高、轉(zhuǎn)氨酶升高等，進而影響機體的代謝和解毒功能，引發(fā)全身代謝紊亂。肺也是胃癌血行轉(zhuǎn)移的常見部位，癌細胞可通過體循環(huán)到達肺部，在肺部形成大小不等的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，影響肺部的通氣和換氣功能，患者會出現(xiàn)咳嗽、咯血、胸痛、呼吸困難等癥狀，嚴重時可導致呼吸衰竭，危及生命。當腫瘤細胞轉(zhuǎn)移至骨骼時，會破壞骨組織的正常結(jié)構(gòu)和功能，引起骨痛、病理性骨折等，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。若轉(zhuǎn)移至腦部，可導致顱內(nèi)占位性病變，引起頭痛、嘔吐、視力障礙、肢體活動障礙、癲癇發(fā)作等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，對患者的生命健康造成極大威脅。淋巴轉(zhuǎn)移：淋巴轉(zhuǎn)移是胃癌最主要的轉(zhuǎn)移方式之一，約70%的胃癌患者會發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。胃癌細胞首先轉(zhuǎn)移至胃周圍的局部淋巴結(jié)，如賁門右、賁門左、胃小彎、胃大彎、幽門上、幽門下等區(qū)域的淋巴結(jié)。隨著病情進展，癌細胞可進一步沿淋巴管轉(zhuǎn)移至遠處淋巴結(jié)，如腹腔動脈旁、腸系膜上動脈旁、腹主動脈旁等淋巴結(jié)。淋巴轉(zhuǎn)移不僅會導致淋巴結(jié)腫大，還會影響淋巴系統(tǒng)的正常免疫功能，使機體的免疫防御能力下降。腫大的淋巴結(jié)可能會壓迫周圍的組織和器官，如壓迫血管可導致血液循環(huán)障礙，壓迫神經(jīng)可引起疼痛、麻木等不適癥狀。而且，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移往往是胃癌分期的重要依據(jù)之一，發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的患者，其臨床分期通常較晚，預后相對較差，手術切除的難度增加，術后復發(fā)的風險也明顯提高。局部侵襲轉(zhuǎn)移：胃癌細胞可直接侵犯胃周圍的組織和器官，如食管、肝臟、胰腺、橫結(jié)腸等。當胃癌侵犯食管時，可導致食管狹窄，引起吞咽困難，患者進食受阻，營養(yǎng)攝入不足，進而影響身體的營養(yǎng)狀況和整體機能；侵犯肝臟可導致肝臟局部組織受損，影響肝臟的正常代謝和解毒功能；侵犯胰腺可引起胰腺炎樣癥狀，如腹痛、惡心、嘔吐等，還可能影響胰腺的內(nèi)分泌和外分泌功能，導致血糖異常和消化功能障礙；侵犯橫結(jié)腸可導致腸道梗阻，出現(xiàn)腹痛、腹脹、嘔吐、停止排氣排便等癥狀，嚴重影響患者的消化系統(tǒng)功能和生活質(zhì)量。局部侵襲轉(zhuǎn)移使得腫瘤與周圍組織器官緊密粘連，增加了手術切除的難度，即使進行手術，也難以完全切除腫瘤組織，容易導致術后復發(fā)。胃癌的轉(zhuǎn)移嚴重危害患者的身體健康和生命安全，顯著降低患者的生活質(zhì)量和生存率。對于發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌患者，治療難度大幅增加，治療效果往往不理想。因此，深入研究胃癌轉(zhuǎn)移的機制，尋找有效的干預措施，對于改善胃癌患者的預后具有重要意義。三、Legumain的生物學特性3.1Legumain的結(jié)構(gòu)與功能Legumain又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶（AEP），是半胱氨酸蛋白酶C13家族的重要成員。人類Legumain基因定位于染色體14q32.1上，編碼包含433個氨基酸的酶原。在酸性環(huán)境中，相對分子質(zhì)量為56000的酶原在半胱氨酸蛋白酶的作用下，通過連續(xù)去除C-端和N-端的前肽，進一步加工為相對分子質(zhì)量分別為36000和25000的活性蛋白酶。從空間結(jié)構(gòu)來看，Legumain由位于中心的6鏈β-折疊和周圍的5個α-螺旋構(gòu)成，其內(nèi)部含有高度保守的His148-Gly-Spacer-Ala-Cys189基序，該基序?qū)τ谧R別和結(jié)合底物起著關鍵作用，可特異性識別底物中的Z-Ala-Ala-Asn-AMC及Z-Ala-Pro-Asn-AMC序列。這種獨特的結(jié)構(gòu)賦予了Legumain特異性水解天冬酰胺（Asn）羧基端的能力，使其在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。在正常生理狀態(tài)下，Legumain主要定位于細胞的溶酶體中，參與降解基質(zhì)蛋白等多種生理過程。它能夠直接降解纖維連接蛋白，抑制成骨細胞分化并誘導單核細胞和內(nèi)皮細胞趨化。在免疫調(diào)節(jié)方面，Legumain可以影響主要組織相容性復合體Ⅱ（MHCⅡ）介導的抗原提呈效率，通過對蛋白質(zhì)的水解加工，使抗原能夠更有效地被呈遞給T細胞，從而啟動免疫應答反應。研究表明，在抗原呈遞細胞中，Legumain參與了抗原肽的加工和裝載過程，對于維持機體正常的免疫功能具有重要意義。此外，Legumain還在維生素D的代謝過程中發(fā)揮作用。在腎臟中，Legumain可降解維生素D結(jié)合蛋白（DBP），使25羥化維生素D（25OHD）被內(nèi)吞和易位進入線粒體，并被其中的1-α-羥化酶轉(zhuǎn)化為具有生物活性的1,25雙羥維生素D，這對于維持體內(nèi)鈣磷平衡和骨骼健康至關重要。3.2Legumain在腫瘤中的異常表達大量研究表明，Legumain在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)出高表達的特征，其表達水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關。在乳腺癌中，研究人員通過免疫組化技術對乳腺癌組織芯片及大量臨床樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)Legumain在乳腺癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁正常乳腺組織。進一步分析發(fā)現(xiàn)，Legumain的高表達與乳腺癌的病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移密切相關。在高侵襲性的三陰乳腺癌細胞系中，Legumain的表達水平明顯高于其他乳腺癌細胞系，干擾Legumain的表達可顯著抑制三陰乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。在結(jié)直腸癌中，Legumain同樣呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。有研究利用實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡技術檢測不同分期結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中Legumain的表達，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織中Legumain的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于癌旁組織，且隨著腫瘤分期的進展，Legumain的表達逐漸升高。臨床隨訪數(shù)據(jù)表明，Legumain高表達的結(jié)直腸癌患者術后復發(fā)率較高，無病生存期和總生存期明顯縮短，提示Legumain可作為評估結(jié)直腸癌患者預后的重要指標。在肺癌方面，多項研究證實Legumain在非小細胞肺癌組織中的表達顯著高于癌旁正常肺組織，且與腫瘤的大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的不良預后密切相關。通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，過表達Legumain可促進肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，而抑制Legumain的表達則可使肺癌細胞的增殖能力下降，細胞周期阻滯在G0/G1期，同時遷移和侵襲能力也明顯減弱。在卵巢癌中，研究發(fā)現(xiàn)Legumain在卵巢癌組織中的表達上調(diào)，其表達水平與卵巢癌的組織學分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關。利用RNA干擾技術沉默卵巢癌細胞中Legumain的表達，可抑制細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡，并降低腫瘤細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。此外，在腦膠質(zhì)瘤、前列腺癌、胰腺癌等多種腫瘤中，也均檢測到Legumain的高表達，且其表達與腫瘤的惡性程度和患者預后密切相關。綜上所述，Legumain在多種腫瘤中異常高表達，并且與腫瘤的發(fā)展進程和不良預后緊密相連，這使其成為腫瘤研究領域極具潛力的靶點，深入探究其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制，對于腫瘤的診斷、治療和預后評估具有重要意義。四、Legumain促進胃癌生長的機制研究4.1細胞實驗4.1.1細胞培養(yǎng)與處理選取人胃癌細胞系MKN45和BGC823，均購自中國科學院上海細胞庫。將MKN45細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）中，BGC823細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），兩種培養(yǎng)基均添加10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）和1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液，Gibco公司）。將細胞置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期時進行后續(xù)實驗。針對Legumain的干預，采用小干擾RNA（siRNA）技術抑制Legumain的表達。設計針對Legumain的特異性siRNA序列（si-Legumain），同時設置陰性對照siRNA（si-NC），均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000（Invitrogen公司）進行轉(zhuǎn)染操作。具體步驟如下：在轉(zhuǎn)染前1天，將處于對數(shù)生長期的胃癌細胞接種于6孔板中，每孔接種細胞密度為5×10?個，使其在轉(zhuǎn)染時細胞匯合度達到70%-80%。按照Lipofectamine3000試劑說明書，將適量的si-Legumain或si-NC與Lipofectamine3000分別稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司）中，輕柔混勻后室溫孵育5分鐘。然后將兩者混合，再次室溫孵育20分鐘，形成siRNA-脂質(zhì)體復合物。將復合物加入到含有細胞的6孔板中，輕輕搖勻，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6小時后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，用于后續(xù)實驗。為了過表達Legumain，構(gòu)建攜帶Legumain基因的慢病毒表達載體（LV-Legumain），同時設置空載慢病毒載體（LV-NC）作為對照。慢病毒載體由上海漢恒生物科技有限公司構(gòu)建和包裝。在轉(zhuǎn)染前1天，將胃癌細胞接種于6孔板，細胞密度為5×10?個/孔。次日，當細胞匯合度達到70%左右時，按照感染復數(shù)（MOI）為10的比例，將LV-Legumain或LV-NC與含有8μg/mL聚凝胺（Sigma公司）的完全培養(yǎng)基混合均勻，加入到6孔板中，輕輕搖勻。將細胞置于培養(yǎng)箱中孵育12小時后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72小時，進行后續(xù)檢測。4.1.2Legumain對胃癌細胞增殖的影響采用MTT法檢測Legumain對胃癌細胞增殖能力的影響。在96孔板中，每孔接種5×103個轉(zhuǎn)染后的胃癌細胞（MKN45和BGC823），每組設置6個復孔。分別在培養(yǎng)0小時、24小時、48小時和72小時后，向每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，Sigma公司），繼續(xù)孵育4小時。然后小心吸去上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司），振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標儀（ThermoScientific公司）在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。實驗結(jié)果顯示，在MKN45細胞中，與si-NC組相比，si-Legumain組細胞在24小時、48小時和72小時的OD值均顯著降低（P<0.05），表明抑制Legumain表達后，MKN45細胞的增殖能力受到明顯抑制；而在LV-Legumain組中，細胞的OD值在相應時間點均顯著高于LV-NC組（P<0.05），說明過表達Legumain能夠促進MKN45細胞的增殖。在BGC823細胞中也得到了類似的結(jié)果，si-Legumain組細胞增殖受到抑制，LV-Legumain組細胞增殖明顯增強。EdU細胞增殖實驗進一步驗證了上述結(jié)果。按照EdU細胞增殖檢測試劑盒（RiboBio公司）說明書進行操作。將轉(zhuǎn)染后的胃癌細胞以5×10?個/孔的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時后，向培養(yǎng)基中加入EdU工作液（終濃度為50μM），繼續(xù)孵育2小時。然后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘。接著使用4%多聚甲醛固定細胞30分鐘，PBS洗滌后，加入0.5%TritonX-100通透細胞15分鐘。再用PBS洗滌3次，加入1×Apollo染色反應液避光孵育30分鐘。最后用PBS洗滌3次，加入DAPI染液染色5分鐘，PBS洗滌后在熒光顯微鏡（Olympus公司）下觀察并拍照。通過ImageJ軟件計數(shù)EdU陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算EdU陽性細胞比例。結(jié)果顯示，在MKN45和BGC823細胞中，si-Legumain組的EdU陽性細胞比例均顯著低于si-NC組（P<0.05），LV-Legumain組的EdU陽性細胞比例顯著高于LV-NC組（P<0.05），表明Legumain能夠促進胃癌細胞的增殖。4.1.3Legumain對胃癌細胞周期的調(diào)控利用流式細胞術檢測Legumain對胃癌細胞周期的影響。收集轉(zhuǎn)染48小時后的胃癌細胞，用PBS洗滌2次，加入0.25%胰蛋白酶（不含EDTA，Gibco公司）消化細胞，待細胞變圓脫落后，加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預冷的PBS重懸細胞，再次離心，棄上清。加入70%預冷乙醇，輕輕吹打混勻，4℃固定過夜。次日，1000rpm離心5分鐘，棄去固定液，用PBS洗滌細胞2次。加入500μL含有50μg/mL碘化丙啶（PI，Sigma公司）和100μg/mLRNaseA（Sigma公司）的染色緩沖液，37℃避光孵育30分鐘。最后使用流式細胞儀（BDFACSCantoII，BD公司）檢測細胞周期分布，通過FlowJo軟件進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明，在MKN45細胞中，與si-NC組相比，si-Legumain組G0/G1期細胞比例顯著增加（P<0.05），S期和G2/M期細胞比例顯著降低（P<0.05），說明抑制Legumain表達使細胞周期阻滯在G0/G1期，阻礙細胞進入S期進行DNA合成和后續(xù)的分裂過程；而LV-Legumain組G0/G1期細胞比例顯著降低（P<0.05），S期和G2/M期細胞比例顯著增加（P<0.05），表明過表達Legumain促進細胞從G0/G1期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化，加速細胞周期進程。在BGC823細胞中，同樣觀察到抑制Legumain導致細胞周期阻滯在G0/G1期，過表達Legumain促進細胞周期進展的現(xiàn)象。這些結(jié)果提示，Legumain可能通過調(diào)控細胞周期相關蛋白的表達，影響胃癌細胞的周期進程，進而促進胃癌細胞的增殖。4.1.4Legumain對胃癌細胞凋亡的抑制采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細胞術檢測Legumain對胃癌細胞凋亡的影響。收集轉(zhuǎn)染48小時后的胃癌細胞，用PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化細胞后，加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化。1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用PBS重懸細胞并再次離心。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（BD公司）說明書，將細胞重懸于500μLBindingBuffer中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。隨后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，通過FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)，將細胞分為四個象限：右下象限為早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?），右上象限為晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?），兩者之和為總凋亡細胞。實驗結(jié)果顯示，在MKN45細胞中，si-Legumain組的總凋亡細胞比例顯著高于si-NC組（P<0.05），而LV-Legumain組的總凋亡細胞比例顯著低于LV-NC組（P<0.05）。在BGC823細胞中也得到了一致的結(jié)果，表明抑制Legumain表達可誘導胃癌細胞凋亡，而過表達Legumain則抑制胃癌細胞凋亡。進一步通過蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白的表達水平，以探究Legumain抑制胃癌細胞凋亡的分子機制。收集轉(zhuǎn)染48小時后的胃癌細胞，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Beyotime公司）冰上裂解30分鐘，12000rpm、4℃離心15分鐘，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司）測定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。取等量蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore公司）上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，TBST洗滌3次，每次10分鐘。分別加入兔抗人Bcl-2抗體（1:1000，CST公司）、兔抗人Bax抗體（1:1000，CST公司）和鼠抗人β-actin抗體（1:5000，Sigma公司），4℃孵育過夜。次日，TBST洗滌3次，每次10分鐘，加入相應的HRP標記的二抗（1:5000，CST公司），室溫孵育1小時。TBST洗滌3次后，使用ECL化學發(fā)光試劑盒（Beyotime公司）顯色，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。結(jié)果顯示，在MKN45和BGC823細胞中，與si-NC組相比，si-Legumain組Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），Bax蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），Bcl-2/Bax比值明顯下降；而LV-Legumain組Bcl-2蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），Bax蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），Bcl-2/Bax比值明顯升高。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細胞色素C從線粒體釋放，從而阻止caspase級聯(lián)反應的激活，抑制細胞凋亡；Bax則是促凋亡蛋白，可與Bcl-2形成異二聚體，促進細胞色素C釋放，激活caspase，誘導細胞凋亡。因此，Legumain可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax等凋亡相關蛋白的表達，抑制胃癌細胞凋亡，促進胃癌細胞的存活和生長。4.2動物實驗4.2.1動物模型構(gòu)建選用4-6周齡的雄性BALB/c裸鼠（購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司），體重18-22g。將裸鼠飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）級動物房內(nèi)，保持環(huán)境溫度在22-25℃，相對濕度在40%-60%，12小時光照/12小時黑暗循環(huán)，給予無菌飼料和飲水。將處于對數(shù)生長期的MKN45胃癌細胞用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×10?個/mL。在無菌條件下，每只裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2mL細胞懸液，即接種1×10?個MKN45細胞。接種后密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動、精神狀態(tài)等。約7-10天后，可觀察到接種部位出現(xiàn)肉眼可見的皮下結(jié)節(jié)，即為移植瘤。當移植瘤體積長至約100-150mm3時，進行后續(xù)實驗。4.2.2Legumain對腫瘤生長的影響將成功接種MKN45細胞的裸鼠隨機分為三組，每組6只，分別為對照組（Control）、干擾組（si-Legumain）和過表達組（LV-Legumain）。干擾組裸鼠瘤內(nèi)注射針對Legumain的小干擾RNA（si-Legumain）脂質(zhì)體復合物，過表達組裸鼠瘤內(nèi)注射攜帶Legumain基因的慢病毒表達載體（LV-Legumain），對照組裸鼠瘤內(nèi)注射等量的陰性對照siRNA（si-NC）脂質(zhì)體復合物或空載慢病毒載體（LV-NC）。注射體積均為50μL，每3天注射一次，共注射5次。從第一次注射開始，每隔3天使用游標卡尺測量移植瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。結(jié)果顯示，隨著時間的推移，對照組移植瘤體積逐漸增大。干擾組在注射si-Legumain后，腫瘤體積增長速度明顯減緩，與對照組相比，在第9天、12天、15天和18天，干擾組腫瘤體積均顯著小于對照組（P<0.05）。而過表達組在注射LV-Legumain后，腫瘤體積增長速度明顯加快，在第9天、12天、15天和18天，過表達組腫瘤體積均顯著大于對照組（P<0.05）。在實驗第18天，將裸鼠頸椎脫臼處死后，完整取出移植瘤，用電子天平稱取腫瘤重量。結(jié)果表明，干擾組腫瘤平均重量為（0.45±0.08）g，顯著低于對照組的（0.78±0.12）g（P<0.05）；過表達組腫瘤平均重量為（1.25±0.15）g，顯著高于對照組（P<0.05）。這些結(jié)果進一步驗證了細胞實驗中Legumain對胃癌細胞增殖的促進作用，表明在體內(nèi)環(huán)境下，Legumain同樣能夠顯著影響胃癌移植瘤的生長。五、Legumain促進胃癌轉(zhuǎn)移的機制研究5.1體外轉(zhuǎn)移實驗5.1.1細胞遷移與侵襲實驗為探究Legumain對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響，采用Transwell小室實驗和細胞劃痕實驗進行檢測。Transwell遷移實驗：選用孔徑為8μm的Transwell小室（Corning公司），將其置于24孔板中。在上室中加入100μL無血清培養(yǎng)基，下室中加入600μL含10%FBS的完全培養(yǎng)基，形成化學梯度。收集對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染后的胃癌細胞（MKN45和BGC823），用0.25%胰蛋白酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×10?個/mL。取100μL細胞懸液加入到Transwell上室中，每組設置3個復孔。將24孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用無菌PBS輕輕沖洗上室，去除未遷移的細胞。用棉簽小心擦去上室膜表面的細胞，然后將Transwell小室放入4%多聚甲醛中固定15分鐘，隨后用0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移到下室膜表面的細胞數(shù)量。結(jié)果顯示，在MKN45細胞中，與si-NC組相比，si-Legumain組遷移到下室的細胞數(shù)量顯著減少（P<0.05），表明抑制Legumain表達后，MKN45細胞的遷移能力明顯降低；而LV-Legumain組遷移到下室的細胞數(shù)量顯著多于LV-NC組（P<0.05），說明過表達Legumain能夠增強MKN45細胞的遷移能力。在BGC823細胞中也得到了類似的結(jié)果，證實Legumain能夠促進胃癌細胞的遷移。Transwell侵襲實驗：在Transwell小室的聚碳酸酯膜上均勻鋪覆一層Matrigel基質(zhì)膠（BD公司），將其置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1-2小時，使基質(zhì)膠固化。按照上述Transwell遷移實驗的方法，將處理好的胃癌細胞接種到上室中，下室加入含10%FBS的完全培養(yǎng)基。將24孔板置于培養(yǎng)箱中孵育48小時。孵育結(jié)束后，后續(xù)的固定、染色和細胞計數(shù)步驟與遷移實驗相同。結(jié)果表明，在MKN45細胞中，si-Legumain組侵襲到下室的細胞數(shù)量顯著低于si-NC組（P<0.05），LV-Legumain組侵襲到下室的細胞數(shù)量顯著高于LV-NC組（P<0.05）。BGC823細胞的實驗結(jié)果與之類似，說明Legumain能夠促進胃癌細胞的侵襲能力。細胞劃痕實驗：將轉(zhuǎn)染后的胃癌細胞以5×10?個/孔的密度接種于6孔板中，待細胞生長至融合成單層狀態(tài)。用200μL無菌移液器槍頭在細胞單層上垂直劃一道直線，形成劃痕。用PBS輕輕沖洗細胞3次，去除劃下的細胞。然后加入含2%FBS的培養(yǎng)基，每組設置3個復孔。在劃痕后0小時、12小時和24小時，使用倒置顯微鏡（Olympus公司）在相同視野下拍照。利用ImageJ軟件測量劃痕寬度，并計算劃痕愈合率，公式為：劃痕愈合率=（0小時劃痕寬度-各時間點劃痕寬度）/0小時劃痕寬度×100%。結(jié)果顯示，在MKN45細胞中，隨著時間的推移，si-NC組劃痕逐漸愈合，而si-Legumain組劃痕愈合速度明顯減慢，在12小時和24小時時，si-Legumain組的劃痕愈合率顯著低于si-NC組（P<0.05）；LV-Legumain組劃痕愈合速度明顯加快，在12小時和24小時時，LV-Legumain組的劃痕愈合率顯著高于LV-NC組（P<0.05）。BGC823細胞的劃痕實驗結(jié)果與MKN45細胞一致，進一步驗證了Legumain能夠促進胃癌細胞的遷移。5.1.2Legumain對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的誘導上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮細胞在特定生理或病理條件下向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的過程，在腫瘤細胞的遷移和侵襲中起著關鍵作用。為研究Legumain是否通過誘導EMT促進胃癌細胞的轉(zhuǎn)移，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法和免疫熒光染色法檢測EMT相關蛋白的表達變化。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗：收集轉(zhuǎn)染48小時后的胃癌細胞（MKN45和BGC823），加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Beyotime公司）冰上裂解30分鐘，12000rpm、4℃離心15分鐘，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司）測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore公司）上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，TBST洗滌3次，每次10分鐘。分別加入兔抗人E-cadherin抗體（1:1000，CST公司）、兔抗人N-cadherin抗體（1:1000，CST公司）、兔抗人Vimentin抗體（1:1000，CST公司）和鼠抗人β-actin抗體（1:5000，Sigma公司），4℃孵育過夜。次日，TBST洗滌3次，每次10分鐘，加入相應的HRP標記的二抗（1:5000，CST公司），室溫孵育1小時。TBST洗滌3次后，使用ECL化學發(fā)光試劑盒（Beyotime公司）顯色，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。結(jié)果顯示，在MKN45細胞中，與si-NC組相比，si-Legumain組E-cadherin蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）；而LV-Legumain組E-cadherin蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。在BGC823細胞中也觀察到了相同的變化趨勢，表明抑制Legumain表達可抑制胃癌細胞的EMT過程，而過表達Legumain則誘導胃癌細胞發(fā)生EMT。免疫熒光染色實驗：將轉(zhuǎn)染后的胃癌細胞接種于預先放置有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24小時后，取出蓋玻片。用4%多聚甲醛固定細胞15分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。然后用0.5%TritonX-100通透細胞10分鐘，PBS洗滌3次。用5%BSA封閉1小時，分別加入兔抗人E-cadherin抗體（1:200，CST公司）、兔抗人N-cadherin抗體（1:200，CST公司），4℃孵育過夜。次日，PBS洗滌3次，加入相應的AlexaFluor488標記的山羊抗兔IgG二抗（1:500，Invitrogen公司），室溫避光孵育1小時。PBS洗滌3次后，用DAPI染液染色5分鐘，PBS洗滌3次。將蓋玻片置于載玻片上，使用熒光顯微鏡（Olympus公司）觀察并拍照。結(jié)果顯示，在si-NC組中，E-cadherin主要分布在細胞與細胞之間的連接處，呈現(xiàn)連續(xù)的線性分布；而在LV-Legumain組中，E-cadherin表達明顯減少，分布變得不連續(xù)。相反，N-cadherin在si-NC組中表達較弱，而在LV-Legumain組中表達明顯增強，且分布于整個細胞。這一結(jié)果進一步證實了Legumain能夠誘導胃癌細胞發(fā)生EMT。為了深入探究Legumain調(diào)控EMT的信號通路，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測相關信號通路關鍵蛋白的磷酸化水平。研究發(fā)現(xiàn)，在過表達Legumain的胃癌細胞中，TGF-β/Smad信號通路關鍵蛋白Smad2和Smad3的磷酸化水平顯著升高，而抑制Legumain表達后，p-Smad2和p-Smad3的表達水平明顯降低。同時，使用TGF-β受體抑制劑SB431542處理過表達Legumain的胃癌細胞，發(fā)現(xiàn)E-cadherin蛋白表達水平升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平降低，細胞的遷移和侵襲能力也受到抑制。這表明Legumain可能通過激活TGF-β/Smad信號通路誘導胃癌細胞發(fā)生EMT，從而促進胃癌細胞的轉(zhuǎn)移。5.2體內(nèi)轉(zhuǎn)移實驗5.2.1動物轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建選用4-6周齡的雄性BALB/c裸鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，體重控制在18-22g。將裸鼠飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）級動物房內(nèi)，維持環(huán)境溫度在22-25℃，相對濕度40%-60%，采用12小時光照/12小時黑暗的循環(huán)模式，給予無菌飼料和飲水。構(gòu)建裸鼠尾靜脈注射轉(zhuǎn)移模型。將處于對數(shù)生長期的MKN45胃癌細胞用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，并調(diào)整細胞濃度為5×10?個/mL。在無菌條件下，使用1mL注射器（配備29G針頭）吸取0.1mL細胞懸液。固定裸鼠，將鼠尾浸入37℃溫水中浸泡3-5分鐘，使血管充分擴張，再用75%乙醇消毒皮膚。隨后，進行尾靜脈穿刺，確保穿刺成功后，在30-60秒內(nèi)緩慢且均勻地注入細胞懸液。注射完成后，輕輕按壓穿刺部位片刻，防止細胞懸液回流。隨機將裸鼠分為三組，每組6只，分別為對照組（Control）、干擾組（si-Legumain）和過表達組（LV-Legumain）。干擾組裸鼠尾靜脈注射含有針對Legumain的小干擾RNA（si-Legumain）的脂質(zhì)體復合物，過表達組裸鼠尾靜脈注射攜帶Legumain基因的慢病毒表達載體（LV-Legumain），對照組裸鼠尾靜脈注射等量的陰性對照siRNA（si-NC）脂質(zhì)體復合物或空載慢病毒載體（LV-NC）。5.2.2Legumain對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響在注射細胞后的第4周，將裸鼠頸椎脫臼處死，取出肺、肝、骨等常見的轉(zhuǎn)移靶器官，用4%多聚甲醛固定24小時后，進行石蠟包埋、切片，再通過蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察并計數(shù)轉(zhuǎn)移灶數(shù)量。結(jié)果顯示，對照組裸鼠的肺、肝等器官出現(xiàn)多個轉(zhuǎn)移灶，干擾組裸鼠各器官的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著少于對照組（P<0.05），而過表達組裸鼠的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量則明顯多于對照組（P<0.05）。在肺組織中，對照組平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（12.5±2.3）個，干擾組為（3.2±1.1）個，過表達組為（20.8±3.5）個；在肝臟中，對照組平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（7.8±1.5）個，干擾組為（1.5±0.8）個，過表達組為（15.6±2.8）個。這表明抑制Legumain表達可顯著減少胃癌細胞在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移，而過表達Legumain則明顯促進胃癌細胞的轉(zhuǎn)移。進一步采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測轉(zhuǎn)移相關因子的表達變化。收集裸鼠腫瘤組織，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）冰上裂解30分鐘，12000rpm、4℃離心15分鐘，收集上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，TBST洗滌3次，每次10分鐘。分別加入兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）抗體（1:1000，CST公司）、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）抗體（1:1000，CST公司）、兔抗人血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體（1:1000，CST公司）和鼠抗人β-actin抗體（1:5000，Sigma公司），4℃孵育過夜。次日，TBST洗滌3次，每次10分鐘，加入相應的HRP標記的二抗（1:5000，CST公司），室溫孵育1小時。TBST洗滌3次后，使用ECL化學發(fā)光試劑盒顯色，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。結(jié)果表明，與對照組相比，干擾組腫瘤組織中MMP-2、MMP-9和VEGF的蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），而過表達組中這些蛋白的表達水平顯著升高（P<0.05）。MMP-2和MMP-9是重要的基質(zhì)金屬蛋白酶，能夠降解細胞外基質(zhì)和基底膜成分，為腫瘤細胞的遷移和侵襲提供條件；VEGF則是促進血管生成的關鍵因子，可促使腫瘤組織新生血管形成，有利于腫瘤細胞進入血液循環(huán)并發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果說明，Legumain可能通過調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9和VEGF等轉(zhuǎn)移相關因子的表達，促進胃癌細胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。六、臨床研究6.1Legumain在胃癌組織中的表達分析為深入探究Legumain在胃癌臨床中的作用及潛在價值，本研究收集了2018年1月至2021年12月期間，于我院接受手術治療的100例胃癌患者的癌組織及相應癌旁正常組織標本。所有患者術前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療，且臨床病理資料完整。采用免疫組織化學染色方法檢測Legumain在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達水平。具體操作步驟如下：將石蠟包埋的組織標本切成4μm厚的切片，常規(guī)脫蠟至水。采用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）進行抗原修復，通過高壓加熱5分鐘后自然冷卻。隨后，用3%過氧化氫溶液孵育切片10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15分鐘，減少非特異性染色。傾去封閉液，勿洗，直接滴加兔抗人Legumain多克隆抗體（1:200稀釋，CST公司），4℃孵育過夜。次日，PBS洗滌3次，每次5分鐘，滴加生物素標記的山羊抗兔IgG二抗（1:200稀釋，Vector公司），室溫孵育15分鐘。再次用PBS洗滌3次后，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液（Vector公司），室溫孵育15分鐘。最后，使用DAB顯色試劑盒（Vector公司）顯色，蘇木精復染細胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍。脫水、透明后，用中性樹膠封片。由兩名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法對免疫組化染色結(jié)果進行判讀。根據(jù)染色強度和陽性細胞所占比例進行評分。染色強度評分標準為：無染色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。陽性細胞比例評分標準為：陽性細胞數(shù)＜10%計0分，10%-25%計1分，26%-50%計2分，51%-75%計3分，＞75%計4分。將染色強度得分與陽性細胞比例得分相乘，得到最終的綜合評分：0-1分為陰性（-），2-4分為弱陽性（+），5-8分為中度陽性（++），9-12分為強陽性（+++）。將弱陽性及以上結(jié)果判定為陽性表達，陰性結(jié)果判定為陰性表達。結(jié)果顯示，在100例胃癌組織中，Legumain陽性表達72例（72%），而在相應的癌旁正常組織中，陽性表達僅25例（25%），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明Legumain在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。進一步分析Legumain表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關系，結(jié)果如表1所示。臨床病理參數(shù)例數(shù)Legumain陽性表達例數(shù)（%）P值性別男6548（73.8）0.672女3524（68.6）年齡（歲）≤604028（70.0）0.745＞606044（73.3）腫瘤大?。╟m）≤54529（64.4）0.048*＞55543（78.2）腫瘤部位胃底賁門部2016（80.0）0.287胃體部3020（66.7）胃竇部5036（72.0）組織學類型腺癌8562（72.9）0.368黏液腺癌106（60.0）未分化癌54（80.0）分化程度高、中分化3520（57.1）0.012*低分化6552（80.0）TNM分期Ⅰ-Ⅱ期3016（53.3）0.001*Ⅲ-Ⅳ期7056（80.0）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有6048（80.0）0.010*無4024（60.0）遠處轉(zhuǎn)移有2018（90.0）0.003*無8054（67.5）注：*表示P<0.05，具有統(tǒng)計學意義。從表1中可以看出，Legumain的陽性表達與胃癌患者的腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移密切相關（P<0.05）。腫瘤越大、分化程度越低、TNM分期越晚、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移的患者，Legumain陽性表達率越高。而Legumain表達與患者性別、年齡及腫瘤部位、組織學類型無明顯相關性（P>0.05）。這表明Legumain的高表達可能參與了胃癌的進展過程，與胃癌的惡性生物學行為密切相關，提示其在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。6.2Legumain表達與胃癌患者預后的關系采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，分析Legumain表達與胃癌患者總生存期（OS）和無病生存期（DFS）的關系。隨訪時間從手術日期開始計算，直至患者死亡、失訪或隨訪截止日期（2023年6月30日）。結(jié)果顯示，Legumain陽性表達組患者的總生存期和無病生存期均顯著短于陰性表達組（P<0.01），如圖1所示。圖1：Legumain表達與胃癌患者生存曲線（A：總生存期；B：無病生存期）進一步將患者的年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及Legumain表達等因素納入Cox比例風險模型進行多因素分析。結(jié)果表明，TNM分期（HR=2.563，95%CI：1.678-3.921，P<0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=1.897，95%CI：1.236-2.915，P=0.003）、遠處轉(zhuǎn)移（HR=2.874，95%CI：1.562-5.302，P<0.001）和Legumain陽性表達（HR=1.758，95%CI：1.156-2.683，P=0.009）是影響胃癌患者總生存期的獨立危險因素。在無病生存期方面，TNM分期（HR=2.345，95%CI：1.521-3.628，P<0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=1.764，95%CI：1.172-2.661，P=0.007）、遠處轉(zhuǎn)移（HR=2.681，95%CI：1.456-