DKK4在肺癌多西他賽耐藥中的作用及機(jī)制解析

DKK4在肺癌多西他賽耐藥中的作用及機(jī)制解析一、引言1.1研究背景肺癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)且致死率極高的惡性腫瘤之一。據(jù)相關(guān)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，肺癌的發(fā)病率在男性中居首位，女性中位列第二，而其死亡率在所有惡性腫瘤中排名第一，占癌癥死亡患者的18%。2020年，中國(guó)新增肺癌病例數(shù)多達(dá)82萬(wàn)例，無(wú)論是在國(guó)際還是國(guó)內(nèi)，肺癌的發(fā)病率和死亡率都處于高位。盡管當(dāng)前肺癌的治療手段，如手術(shù)、放療、化療以及新興的靶向治療和免疫治療等不斷發(fā)展，但肺癌患者的5年生存率依舊較低，其中一個(gè)關(guān)鍵原因便是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。多西他賽（Docetaxel）作為一種廣泛應(yīng)用于肺癌治療的化療藥物，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞微管聚合并抑制其解聚，使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，達(dá)到抗癌目的。在非小細(xì)胞肺癌，尤其是肺腺癌的治療中，多西他賽是重要的一線和二線用藥。然而，臨床實(shí)踐中，肺癌細(xì)胞對(duì)多西他賽的耐藥現(xiàn)象普遍存在，這嚴(yán)重限制了多西他賽的治療效果，導(dǎo)致化療失敗，患者病情進(jìn)展和預(yù)后惡化。耐藥機(jī)制的復(fù)雜性涉及多個(gè)層面，包括藥物外排增加、藥物靶點(diǎn)改變、細(xì)胞凋亡通路受阻、腫瘤干細(xì)胞特性增強(qiáng)以及腫瘤微環(huán)境的影響等。目前，雖然對(duì)肺癌多西他賽耐藥機(jī)制有了一定研究，但仍未完全明確，亟需深入探索以尋找有效的解決策略。DKK4（dickkopf-relatedprotein4）作為一種分泌型糖蛋白，屬于DKK蛋白家族。已有研究表明，DKK4在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和耐藥等生物學(xué)行為密切相關(guān)。在部分腫瘤類型中，DKK4通過(guò)參與Wnt/β-catenin等信號(hào)通路的調(diào)控，影響腫瘤細(xì)胞的命運(yùn)。然而，DKK4在肺癌多西他賽耐藥過(guò)程中的具體作用及機(jī)制尚未完全闡明。因此，深入研究DKK4與肺癌多西他賽耐藥之間的關(guān)系，對(duì)于揭示肺癌耐藥的分子機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)以及開(kāi)發(fā)更有效的治療策略具有重要的理論和臨床意義。1.2研究目的與意義1.2.1研究目的本研究旨在深入探究DKK4在肺癌多西他賽耐藥過(guò)程中的具體作用及分子機(jī)制。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，明確DKK4表達(dá)水平的改變對(duì)肺癌細(xì)胞多西他賽耐藥性的影響；揭示DKK4調(diào)控肺癌多西他賽耐藥的上下游信號(hào)通路及關(guān)鍵分子節(jié)點(diǎn)；并探索以DKK4為靶點(diǎn)逆轉(zhuǎn)肺癌多西他賽耐藥的可行性，為肺癌的臨床治療提供潛在的新靶點(diǎn)和理論依據(jù)。具體而言，首先，在細(xì)胞水平上，通過(guò)構(gòu)建DKK4過(guò)表達(dá)和敲低的肺癌細(xì)胞模型，檢測(cè)細(xì)胞對(duì)多西他賽的敏感性變化，包括細(xì)胞增殖、凋亡、周期阻滯等指標(biāo)，明確DKK4對(duì)肺癌多西他賽耐藥表型的直接影響。其次，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，如蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）、免疫共沉淀（Co-IP）等，分析在多西他賽處理下，DKK4相關(guān)信號(hào)通路分子的表達(dá)和活性變化，確定其參與耐藥調(diào)控的分子機(jī)制。再者，建立肺癌多西他賽耐藥的動(dòng)物模型，驗(yàn)證在體內(nèi)環(huán)境中DKK4對(duì)肺癌多西他賽耐藥的作用及機(jī)制，為后續(xù)臨床研究提供更具說(shuō)服力的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1.2.2研究意義從理論層面來(lái)看，本研究將有助于深化對(duì)肺癌多西他賽耐藥分子機(jī)制的理解。目前，肺癌耐藥機(jī)制復(fù)雜且尚未完全明晰，DKK4作為一個(gè)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用的蛋白，其在肺癌多西他賽耐藥中的作用研究尚不完善。本研究通過(guò)全面深入地探討DKK4與肺癌多西他賽耐藥之間的關(guān)聯(lián)，有望揭示新的耐藥調(diào)控機(jī)制，豐富肺癌耐藥的理論體系，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)腫瘤耐藥的本質(zhì)提供新的視角和思路。這不僅有助于推動(dòng)肺癌基礎(chǔ)研究的發(fā)展，還可能為其他腫瘤耐藥機(jī)制的研究提供借鑒和參考。在臨床實(shí)踐方面，本研究具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。肺癌多西他賽耐藥是導(dǎo)致肺癌化療失敗和患者預(yù)后不良的關(guān)鍵因素之一。若能明確DKK4在肺癌多西他賽耐藥中的作用及機(jī)制，并將其作為新的治療靶點(diǎn)，有望開(kāi)發(fā)出針對(duì)肺癌多西他賽耐藥的新型治療策略，如設(shè)計(jì)特異性的DKK4抑制劑或靶向藥物，聯(lián)合多西他賽進(jìn)行治療，從而提高肺癌患者對(duì)多西他賽的敏感性，增強(qiáng)化療效果，改善患者的生存質(zhì)量，延長(zhǎng)患者的生存期。此外，DKK4還可能作為預(yù)測(cè)肺癌患者對(duì)多西他賽治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物，通過(guò)檢測(cè)患者腫瘤組織中DKK4的表達(dá)水平，提前篩選出可能對(duì)多西他賽耐藥的患者，為臨床醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案提供依據(jù)，避免無(wú)效化療對(duì)患者造成的身體損傷和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)1.3.1研究方法細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用多種肺癌細(xì)胞株，如A549、H1299等，分別構(gòu)建DKK4過(guò)表達(dá)和敲低的穩(wěn)定細(xì)胞系。利用CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞在多西他賽處理下的增殖能力；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布，評(píng)估DKK4對(duì)肺癌細(xì)胞多西他賽耐藥相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。此外，采用Transwell實(shí)驗(yàn)探究細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化，以明確DKK4是否通過(guò)影響這些過(guò)程參與肺癌多西他賽耐藥。分子生物學(xué)技術(shù)：運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)DKK4及相關(guān)耐藥基因、信號(hào)通路分子的mRNA表達(dá)水平；蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)用于檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)量和磷酸化水平，從而確定DKK4調(diào)控肺癌多西他賽耐藥的分子機(jī)制。利用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)篩選與DKK4相互作用的蛋白，進(jìn)一步揭示其在耐藥過(guò)程中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，通過(guò)基因芯片或RNA測(cè)序技術(shù)，全面分析DKK4表達(dá)改變前后肺癌細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化，挖掘潛在的耐藥相關(guān)基因和信號(hào)通路。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：建立肺癌多西他賽耐藥的裸鼠移植瘤模型，將構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)或敲低DKK4的肺癌細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi)，待腫瘤生長(zhǎng)至合適大小后，給予多西他賽腹腔注射處理。定期測(cè)量腫瘤體積和重量，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，評(píng)估DKK4對(duì)肺癌多西他賽耐藥在體內(nèi)的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取腫瘤組織進(jìn)行免疫組化、免疫熒光等檢測(cè)，驗(yàn)證細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，從整體動(dòng)物水平深入探究DKK4與肺癌多西他賽耐藥的關(guān)系。生物信息學(xué)分析：利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)，如TCGA（TheCancerGenomeAtlas）、GEO（GeneExpressionOmnibus）等，分析肺癌患者腫瘤組織中DKK4的表達(dá)與臨床病理特征、多西他賽治療效果及患者預(yù)后的相關(guān)性。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件，分析DKK4的結(jié)構(gòu)、功能域以及可能參與的信號(hào)通路，為實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)和研究方向，同時(shí)結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證和深入分析。1.3.2創(chuàng)新點(diǎn)研究視角創(chuàng)新：目前關(guān)于肺癌多西他賽耐藥機(jī)制的研究主要集中在傳統(tǒng)的耐藥相關(guān)蛋白、信號(hào)通路以及腫瘤微環(huán)境等方面，而對(duì)DKK4在肺癌多西他賽耐藥中作用及機(jī)制的研究相對(duì)較少。本研究從DKK4這一較少被關(guān)注的角度切入，有望發(fā)現(xiàn)全新的肺癌多西他賽耐藥調(diào)控機(jī)制，為肺癌耐藥研究開(kāi)辟新的方向。研究方法創(chuàng)新：本研究綜合運(yùn)用多種前沿技術(shù)，將細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)技術(shù)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與生物信息學(xué)分析有機(jī)結(jié)合。在細(xì)胞和動(dòng)物水平深入探究DKK4對(duì)肺癌多西他賽耐藥的影響及分子機(jī)制的同時(shí)，利用生物信息學(xué)從大數(shù)據(jù)層面分析其與臨床的相關(guān)性，實(shí)現(xiàn)了從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的初步探索，這種多維度、多層次的研究方法有助于全面深入地揭示DKK4在肺癌多西他賽耐藥中的作用，提高研究結(jié)果的可靠性和臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。潛在靶點(diǎn)創(chuàng)新：若本研究證實(shí)DKK4在肺癌多西他賽耐藥中起關(guān)鍵作用，那么DKK4將成為肺癌多西他賽耐藥治療的潛在新靶點(diǎn)。針對(duì)DKK4開(kāi)發(fā)特異性的抑制劑或靶向藥物，有望為肺癌多西他賽耐藥患者提供新的治療策略，這對(duì)于改善肺癌患者的治療效果和預(yù)后具有重要意義，也可能為其他腫瘤耐藥治療靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)提供借鑒。二、肺癌與多西他賽耐藥概述2.1肺癌的現(xiàn)狀與危害肺癌作為全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)且致死率極高的惡性腫瘤之一，對(duì)人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。從發(fā)病率來(lái)看，其在各類癌癥中始終處于高位。在男性群體中，肺癌的發(fā)病率位居首位，在女性群體中，肺癌發(fā)病率位列第二。2020年，中國(guó)新增肺癌病例數(shù)高達(dá)82萬(wàn)例，而全球范圍內(nèi)肺癌的發(fā)病率也持續(xù)攀升，每年新發(fā)肺癌的人數(shù)在180萬(wàn)左右。肺癌的高發(fā)病率與多種因素密切相關(guān)，其中吸煙是導(dǎo)致肺癌的首要危險(xiǎn)因素，研究表明，吸煙量較大的人群中，約有1/7的患者死于肺癌，煙草中的尼古丁、焦油等多種致癌物質(zhì)，長(zhǎng)期作用于呼吸道黏膜，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷和基因突變，進(jìn)而引發(fā)肺癌。此外，空氣污染，如工業(yè)廢氣、汽車尾氣以及室內(nèi)裝修材料釋放的有害氣體等；職業(yè)暴露，像石棉、氡氣、鉻、鎳等致癌物質(zhì)的接觸；以及遺傳因素等，都在肺癌的發(fā)病過(guò)程中起到重要作用。肺癌的死亡率同樣令人擔(dān)憂，在所有惡性腫瘤的死亡病例中，肺癌占比高達(dá)18%，每年因肺癌死亡的人數(shù)眾多，在中國(guó)，每年肺癌死亡人數(shù)約為60萬(wàn)，全球每年肺癌死亡人數(shù)大概為160萬(wàn)。肺癌死亡率居高不下的原因主要在于其早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期。早期肺癌患者往往僅表現(xiàn)出咳嗽、咳痰、咯血、胸痛等非特異性癥狀，這些癥狀容易被患者忽視或被誤診為其他呼吸系統(tǒng)疾病，如感冒、支氣管炎等。當(dāng)患者出現(xiàn)明顯的呼吸困難、消瘦、乏力等癥狀時(shí)，病情通常已進(jìn)展到中晚期，此時(shí)癌細(xì)胞大多已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，如轉(zhuǎn)移至腦部、骨骼、肝臟等重要器官，這極大地增加了治療難度。肺癌患者的5年生存率較低，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和壽命，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。2.2多西他賽在肺癌治療中的應(yīng)用多西他賽作為一種重要的化療藥物，在肺癌治療領(lǐng)域具有不可或缺的地位。其作用原理基于對(duì)細(xì)胞微管動(dòng)力學(xué)的精準(zhǔn)調(diào)控，通過(guò)與微管蛋白緊密結(jié)合，促進(jìn)微管的聚合過(guò)程，同時(shí)強(qiáng)力抑制微管的解聚，使得細(xì)胞內(nèi)的微管結(jié)構(gòu)維持在一種高度穩(wěn)定但異常的狀態(tài)。這種異常狀態(tài)對(duì)細(xì)胞的有絲分裂進(jìn)程產(chǎn)生了顯著的阻礙作用，具體表現(xiàn)為紡錘體的正常組裝和功能受到干擾，細(xì)胞無(wú)法順利地從有絲分裂中期向后期轉(zhuǎn)化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期被阻滯在G2/M期。細(xì)胞周期的阻滯有效地抑制了腫瘤細(xì)胞的快速增殖，打破了腫瘤細(xì)胞不受控制的生長(zhǎng)節(jié)奏，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷和抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。在臨床實(shí)踐中，多西他賽廣泛應(yīng)用于肺癌的治療，尤其是在非小細(xì)胞肺癌的治療方案中占據(jù)重要地位。對(duì)于晚期非小細(xì)胞肺癌患者，多西他賽常作為一線或二線治療藥物使用。一項(xiàng)大規(guī)模的臨床研究表明，在晚期非小細(xì)胞肺癌患者中，使用含多西他賽的化療方案，患者的客觀緩解率（ORR）可達(dá)20%-30%左右，疾病控制率（DCR）能達(dá)到50%-60%，這意味著相當(dāng)一部分患者的腫瘤體積得到了明顯的縮小或病情得到了有效的控制。在肺腺癌患者中，多西他賽的治療效果也較為顯著。有研究對(duì)肺腺癌患者進(jìn)行多西他賽聯(lián)合順鉑的化療方案治療，結(jié)果顯示患者的中位無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）可達(dá)6-8個(gè)月，中位總生存期（OS）可達(dá)10-12個(gè)月，為患者的生存帶來(lái)了一定的改善。此外，多西他賽還可用于非小細(xì)胞肺癌術(shù)后的輔助化療，能夠降低腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，提高患者的長(zhǎng)期生存率。多西他賽不僅可以單藥使用，還常與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，組成聯(lián)合化療方案，以增強(qiáng)治療效果。常見(jiàn)的聯(lián)合方案包括多西他賽聯(lián)合順鉑（DP方案）、多西他賽聯(lián)合卡鉑（DC方案）等。在DP方案中，順鉑能夠破壞腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)，干擾其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程，與多西他賽抑制細(xì)胞有絲分裂的作用機(jī)制相互補(bǔ)充，協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞，提高治療效果。臨床研究表明，DP方案在晚期非小細(xì)胞肺癌患者中的客觀緩解率相較于單藥多西他賽治療有顯著提高，可達(dá)30%-40%左右。多西他賽與其他藥物聯(lián)合使用時(shí)，雖然能提高療效，但也可能增加不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、肝腎功能損害等。在使用多西他賽進(jìn)行肺癌治療時(shí)，醫(yī)生需要根據(jù)患者的具體情況，如年齡、身體狀況、腫瘤分期、病理類型等，權(quán)衡治療的利弊，制定個(gè)性化的治療方案，以達(dá)到最佳的治療效果和安全性。2.3肺癌對(duì)多西他賽耐藥的現(xiàn)狀肺癌對(duì)多西他賽的耐藥現(xiàn)象在臨床治療中極為普遍，嚴(yán)重制約了多西他賽的療效，成為肺癌治療面臨的重大挑戰(zhàn)之一。大量臨床研究和實(shí)踐數(shù)據(jù)表明，肺癌患者在接受多西他賽治療過(guò)程中，相當(dāng)比例的患者會(huì)逐漸出現(xiàn)耐藥情況。在初治的晚期非小細(xì)胞肺癌患者中，使用多西他賽單藥或聯(lián)合化療方案后，約30%-40%的患者在治療后的6-12個(gè)月內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。在經(jīng)過(guò)多線治療的肺癌患者中，耐藥比例更高，可達(dá)70%-80%。這種高耐藥率使得多西他賽在肺癌治療中的效果大打折扣，許多患者無(wú)法從多西他賽治療中獲得長(zhǎng)期的生存益處。肺癌對(duì)多西他賽耐藥所帶來(lái)的后果十分嚴(yán)重。一旦腫瘤細(xì)胞對(duì)多西他賽產(chǎn)生耐藥，患者的病情往往會(huì)迅速惡化。腫瘤細(xì)胞會(huì)重新獲得增殖和侵襲能力，導(dǎo)致腫瘤體積增大、轉(zhuǎn)移灶增多?；颊呖赡軙?huì)出現(xiàn)一系列癥狀加重的表現(xiàn)，如咳嗽加劇、咯血頻繁、胸痛難忍、呼吸困難加重等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。耐藥還使得后續(xù)治療選擇變得極為有限，因?yàn)槎辔魉惸退幍姆伟┘?xì)胞往往對(duì)其他化療藥物也存在不同程度的交叉耐藥現(xiàn)象，這使得醫(yī)生在為患者制定后續(xù)治療方案時(shí)面臨困境，進(jìn)一步降低了患者的生存希望，導(dǎo)致患者的生存期明顯縮短，5年生存率進(jìn)一步降低。目前，對(duì)于肺癌多西他賽耐藥機(jī)制的研究已取得了一定進(jìn)展，但仍存在許多未知領(lǐng)域。在藥物外排機(jī)制方面，研究發(fā)現(xiàn)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）家族中的部分成員，如P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）等，在肺癌多西他賽耐藥細(xì)胞中高表達(dá)。這些蛋白能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將細(xì)胞內(nèi)的多西他賽主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。在肺癌多西他賽耐藥細(xì)胞系中，P-gp的表達(dá)水平顯著高于敏感細(xì)胞系，且其表達(dá)水平與多西他賽的耐藥程度呈正相關(guān)。在細(xì)胞凋亡通路受阻方面，肺癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的異常表達(dá)在多西他賽耐藥中發(fā)揮重要作用。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其中Bcl-2具有抗凋亡作用，而B(niǎo)ax具有促凋亡作用。在多西他賽耐藥的肺癌細(xì)胞中，Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致Bcl-2/Bax比值升高，使得細(xì)胞對(duì)多西他賽誘導(dǎo)的凋亡敏感性降低，從而產(chǎn)生耐藥。一些凋亡相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路的異常激活，也能通過(guò)調(diào)節(jié)下游凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肺癌多西他賽耐藥的發(fā)生。腫瘤干細(xì)胞特性的增強(qiáng)也是肺癌多西他賽耐藥的重要機(jī)制之一。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新、多向分化和高耐藥性的特點(diǎn)。研究表明，肺癌腫瘤干細(xì)胞表面存在多種耐藥相關(guān)蛋白，如ABCG2等，這些蛋白能夠?qū)⒍辔魉惖然熕幬锱懦黾?xì)胞外，使腫瘤干細(xì)胞對(duì)多西他賽產(chǎn)生耐藥。腫瘤干細(xì)胞的微環(huán)境，如與周圍基質(zhì)細(xì)胞的相互作用、細(xì)胞外基質(zhì)的組成等，也能通過(guò)分泌細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等，維持腫瘤干細(xì)胞的干性和耐藥性。雖然對(duì)肺癌多西他賽耐藥機(jī)制有了上述認(rèn)識(shí)，但耐藥機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，涉及多個(gè)基因、蛋白和信號(hào)通路之間的相互作用，仍有許多細(xì)節(jié)和未知的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究，以尋找更有效的逆轉(zhuǎn)耐藥策略。三、DKK4的生物學(xué)特性及在腫瘤中的作用3.1DKK4的結(jié)構(gòu)與功能DKK4基因在人類中定位于染色體10q24.33，其全長(zhǎng)包含多個(gè)外顯子和內(nèi)含子。該基因編碼的DKK4蛋白是一種分泌型糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為35-40kDa。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來(lái)看，DKK4具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域，其N端含有兩個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（cystine-richdomain，CRD），這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)τ贒KK4發(fā)揮其生物學(xué)功能至關(guān)重要。其中，第一個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域參與與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，第二個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域則在維持蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象以及與其他蛋白的相互作用中起到關(guān)鍵作用。在正常生理過(guò)程中，DKK4主要參與胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持等重要生物學(xué)過(guò)程。在胚胎發(fā)育階段，DKK4對(duì)器官的形成和組織的分化起著不可或缺的調(diào)控作用。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，DKK4通過(guò)調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，影響神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生成數(shù)量和比例，從而確保神經(jīng)系統(tǒng)的正常結(jié)構(gòu)和功能的建立。研究表明，在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中，敲低DKK4基因會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)管閉合異常，出現(xiàn)神經(jīng)管畸形等發(fā)育缺陷。在心血管系統(tǒng)發(fā)育中，DKK4參與心臟的形成和血管的生成。它能夠調(diào)節(jié)心臟祖細(xì)胞的分化和遷移，促進(jìn)心臟各腔室和瓣膜的正常發(fā)育。同時(shí)，DKK4還通過(guò)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，對(duì)血管系統(tǒng)的構(gòu)建產(chǎn)生重要影響。在斑馬魚(yú)胚胎中，抑制DKK4的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致心臟發(fā)育不全和血管生成障礙，表現(xiàn)為心臟形態(tài)異常、心跳減弱以及血管分支減少等。在成年個(gè)體中，DKK4在維持組織穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。在皮膚組織中，DKK4參與調(diào)控皮膚干細(xì)胞的自我更新和分化，維持皮膚的正常結(jié)構(gòu)和功能。它能夠調(diào)節(jié)皮膚表皮細(xì)胞的增殖和分化平衡，促進(jìn)表皮細(xì)胞的正常更替，保持皮膚的屏障功能。在腸道組織中，DKK4對(duì)腸道干細(xì)胞的功能維持和腸道上皮細(xì)胞的更新具有重要意義。它通過(guò)與腸道干細(xì)胞表面的受體結(jié)合，調(diào)節(jié)干細(xì)胞的增殖和分化，確保腸道上皮細(xì)胞的正常更新和腸道黏膜的完整性。研究發(fā)現(xiàn)，在腸道損傷修復(fù)過(guò)程中，DKK4的表達(dá)會(huì)上調(diào)，促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖和分化，加速損傷部位的修復(fù)。3.2DKK4在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用近年來(lái)，DKK4在腫瘤領(lǐng)域的研究備受關(guān)注，其在多種腫瘤中的表達(dá)情況呈現(xiàn)出復(fù)雜性，且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及耐藥等過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。在乳腺癌中，研究發(fā)現(xiàn)DKK4的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)。在部分乳腺癌組織樣本中，DKK4呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。通過(guò)對(duì)乳腺癌細(xì)胞系的研究表明，高表達(dá)的DKK4能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。其作用機(jī)制主要與激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)，DKK4通過(guò)與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，抑制了該信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，使得β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)一系列與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1等，從而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展。有研究通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將高表達(dá)DKK4的乳腺癌細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯加快，且更容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌中，DKK4的表達(dá)同樣具有重要意義。在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移組織中，DKK4蛋白的表達(dá)明顯高于結(jié)腸原發(fā)灶。利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中的DKK4基因后，在含有5-氟尿嘧啶（5-FU）的培養(yǎng)基中，細(xì)胞隨5-FU濃度增加而加速死亡，而野生型細(xì)胞則可繼續(xù)增殖。這表明DKK4表達(dá)水平對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞耐受5-FU殺傷有極為重要的影響，提示DKK4可能是影響腫瘤耐受5-FU化療的重要因素和潛在治療靶點(diǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DKK4在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝重編程有關(guān)，它能夠影響腫瘤細(xì)胞內(nèi)的糖代謝和脂代謝相關(guān)酶的表達(dá)，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供更多的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展和耐藥。在胃癌中，DKK4也被發(fā)現(xiàn)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。研究人員通過(guò)基因芯片技術(shù)篩選出胃間質(zhì)瘤中主要的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)DKK4在瘤組織中特異性表達(dá)，而在瘤周組織中不表達(dá)。雖然目前對(duì)于DKK4在胃癌中具體作用機(jī)制的研究還不夠深入，但初步研究推測(cè)，DKK4可能通過(guò)與其他信號(hào)通路的相互作用，如與PI3K/Akt信號(hào)通路的交聯(lián)，影響胃癌細(xì)胞的存活、增殖和遷移等生物學(xué)行為。在胃癌細(xì)胞系中，抑制DKK4的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖能力和遷移能力有所下降，同時(shí)Akt蛋白的磷酸化水平也降低，提示DKK4可能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)胃癌的發(fā)展。在肝癌中，DKK4的異常表達(dá)與肝癌的進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)。在肝癌組織中，DKK4的表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)水平與腫瘤的大小、TNM分期以及血管侵犯等臨床病理參數(shù)呈正相關(guān)。功能實(shí)驗(yàn)表明，高表達(dá)的DKK4能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，使得肝癌細(xì)胞更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。其作用機(jī)制涉及多條信號(hào)通路，如通過(guò)激活TGF-β/Smad信號(hào)通路，上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug等的表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的EMT和轉(zhuǎn)移。此外，DKK4還可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，為肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。DKK4在不同腫瘤中通過(guò)多種復(fù)雜的機(jī)制發(fā)揮著促癌作用，其表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及耐藥等過(guò)程緊密相關(guān)，深入研究DKK4在腫瘤中的作用機(jī)制，有望為腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的靶點(diǎn)和思路。3.3DKK4與肺癌關(guān)系的研究現(xiàn)狀近年來(lái)，DKK4與肺癌的關(guān)系逐漸成為研究熱點(diǎn)，眾多研究從不同角度揭示了DKK4在肺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及耐藥等過(guò)程中的作用。在肺癌組織中，DKK4的表達(dá)水平呈現(xiàn)出明顯的異常。通過(guò)對(duì)大量肺癌患者腫瘤組織樣本的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，部分肺癌組織中DKK4的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織。在非小細(xì)胞肺癌患者的癌組織標(biāo)本中，利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DKK4的mRNA和蛋白表達(dá)量相較于癌旁正常肺組織分別升高了2-3倍和1.5-2.5倍。進(jìn)一步的研究表明，DKK4的表達(dá)水平與肺癌的臨床病理特征密切相關(guān)。在腫瘤體積較大（直徑大于3cm）的肺癌患者中，DKK4的表達(dá)水平明顯高于腫瘤體積較小的患者；在TNM分期較晚（II期及以上）的肺癌患者中，DKK4的表達(dá)量也顯著高于早期（I期）患者。這提示DKK4的高表達(dá)可能與肺癌的腫瘤進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)。DKK4的異常表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生了重要影響。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，在肺癌細(xì)胞系中，上調(diào)DKK4的表達(dá)能夠顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。當(dāng)使用慢病毒載體將DKK4基因?qū)敕伟〢549細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖速度明顯加快，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)DKK4的A549細(xì)胞在48小時(shí)和72小時(shí)的吸光度值相較于對(duì)照組分別提高了30%-40%和40%-50%。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)DKK4的A549細(xì)胞穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量相較于對(duì)照組增加了2-3倍，表明其遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)。而抑制DKK4的表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力受到抑制。利用RNA干擾技術(shù)沉默肺癌H1299細(xì)胞中的DKK4基因后，細(xì)胞的增殖活性明顯降低，克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，敲低DKK4的H1299細(xì)胞形成的克隆數(shù)相較于對(duì)照組減少了50%-60%。同時(shí)，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低DKK4后的H1299細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著下降，穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量相較于對(duì)照組減少了3-4倍。在肺癌多西他賽耐藥方面，目前已有研究初步揭示了DKK4與肺癌多西他賽耐藥之間的關(guān)聯(lián)。研究人員通過(guò)建立肺癌多西他賽耐藥細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞系中DKK4的表達(dá)水平明顯高于親本敏感細(xì)胞系。在多西他賽耐藥的肺癌A549/DTX細(xì)胞中，DKK4的mRNA和蛋白表達(dá)量相較于親本A549細(xì)胞分別升高了3-4倍和2-3倍。進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)表明，抑制DKK4的表達(dá)能夠增強(qiáng)肺癌多西他賽耐藥細(xì)胞對(duì)多西他賽的敏感性。當(dāng)使用siRNA干擾A549/DTX細(xì)胞中的DKK4表達(dá)后，在多西他賽處理下，細(xì)胞的增殖抑制率明顯增加，凋亡率顯著提高。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾DKK4表達(dá)后的A549/DTX細(xì)胞在多西他賽作用48小時(shí)后的增殖抑制率相較于對(duì)照組提高了30%-40%；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，凋亡率從對(duì)照組的15%-20%提高到了30%-40%。這些研究結(jié)果初步表明，DKK4在肺癌多西他賽耐藥過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，可能是肺癌多西他賽耐藥的潛在調(diào)控因子。四、DKK4促進(jìn)肺癌多西他賽耐藥的實(shí)驗(yàn)研究4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株：選用人肺癌細(xì)胞株A549、H1299，均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。A549細(xì)胞為肺腺癌上皮細(xì)胞，具有上皮樣形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)，在肺癌研究中廣泛應(yīng)用，常用于探討肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及藥物敏感性研究。H1299細(xì)胞是一種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，不表達(dá)p53基因，其生長(zhǎng)特性和生物學(xué)行為與其他肺癌細(xì)胞株有所差異，常被用于研究肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及耐藥相關(guān)機(jī)制。這些細(xì)胞株在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中用于構(gòu)建多西他賽耐藥細(xì)胞模型以及進(jìn)行DKK4功能研究。實(shí)驗(yàn)試劑：多西他賽（Docetaxel）購(gòu)自賽默飛世爾科技公司，純度大于98%，為白色結(jié)晶粉末，在實(shí)驗(yàn)中用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成10mM的儲(chǔ)存液，-20℃避光保存，使用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，這兩種培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，RPMI-1640培養(yǎng)基適合多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)，尤其常用于懸浮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)；DMEM培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分豐富，含有高濃度的葡萄糖和多種氨基酸、維生素等，適合貼壁細(xì)胞如A549、H1299細(xì)胞的生長(zhǎng)。胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子和激素等，在細(xì)胞培養(yǎng)中添加10%的胎牛血清以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)需求。胰蛋白酶、EDTA購(gòu)自Solarbio公司，用于細(xì)胞的消化傳代，胰蛋白酶能夠水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來(lái)，EDTA則可增強(qiáng)胰蛋白酶的消化作用，兩者配合使用，提高細(xì)胞消化效率。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司，用于將外源核酸（如質(zhì)粒、siRNA等）導(dǎo)入細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低，在基因功能研究中發(fā)揮重要作用。DKK4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、DKK4siRNA均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，DKK4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒包含完整的DKK4基因編碼序列，可在細(xì)胞中高效表達(dá)DKK4蛋白；DKK4siRNA能夠特異性地與DKK4mRNA結(jié)合，通過(guò)RNA干擾機(jī)制降解DKK4mRNA，從而抑制DKK4蛋白的表達(dá)。CCK-8試劑購(gòu)自同仁化學(xué)研究所，用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，其原理是利用細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶將CCK-8中的四氮唑鹽還原為具有顏色的甲瓚產(chǎn)物，通過(guò)檢測(cè)甲瓚產(chǎn)物的吸光度值來(lái)反映細(xì)胞數(shù)量和增殖能力。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BDBiosciences公司，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡，AnnexinV能夠特異性地與凋亡早期細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，F(xiàn)ITC標(biāo)記的AnnexinV可通過(guò)熒光信號(hào)指示凋亡細(xì)胞，PI則可用于區(qū)分壞死細(xì)胞和活細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析不同熒光標(biāo)記的細(xì)胞群體，可準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)胞凋亡率。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）相關(guān)試劑，包括SDS凝膠配制試劑盒、Tris-HCl緩沖液、Tween-20、脫脂奶粉、HRP標(biāo)記的二抗等，均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，通過(guò)電泳將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，轉(zhuǎn)膜至固相膜上，再用特異性抗體進(jìn)行免疫雜交，最后通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白條帶。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）相關(guān)試劑，包括RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenPCRMasterMix等，購(gòu)自Takara公司，用于檢測(cè)基因的mRNA表達(dá)水平，先提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程，從而準(zhǔn)確測(cè)定目的基因的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientific），提供穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度（95%）和二氧化碳濃度（5%）環(huán)境，滿足細(xì)胞生長(zhǎng)所需條件。超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過(guò)過(guò)濾空氣中的塵埃和微生物，提供無(wú)菌的操作環(huán)境，防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中受到污染。倒置顯微鏡（Olympus），用于實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和貼壁情況等，可直接在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿外進(jìn)行觀察，不影響細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。離心機(jī)（Eppendorf），用于細(xì)胞和細(xì)胞裂解液等的離心分離，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求，可選擇不同轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞沉淀、蛋白質(zhì)分離等操作。酶標(biāo)儀（BioTek），用于檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞增殖相關(guān)的吸光度值，以及其他酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）等的吸光度檢測(cè)，具有高精度和快速檢測(cè)的特點(diǎn)。流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur），用于分析細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)等，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)熒光標(biāo)記后的熒光信號(hào)強(qiáng)度和散射光信號(hào)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析和分選。PCR儀（AppliedBiosystems），用于進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)中的基因擴(kuò)增反應(yīng)，可精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，保證PCR反應(yīng)的高效性和特異性。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad），用于檢測(cè)Westernblot實(shí)驗(yàn)中的蛋白質(zhì)條帶和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)中的瓊脂糖凝膠電泳條帶，通過(guò)對(duì)條帶的成像和分析，可定量或半定量地評(píng)估目的蛋白和基因的表達(dá)水平。4.1.2實(shí)驗(yàn)方法多西他賽耐藥細(xì)胞模型的構(gòu)建：采用逐步增加多西他賽濃度、間歇誘導(dǎo)的方法構(gòu)建肺癌多西他賽耐藥細(xì)胞模型。以A549細(xì)胞為例，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，更換為含有低濃度多西他賽（0.01μM）的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48-72小時(shí)，此時(shí)可觀察到部分細(xì)胞死亡，存活細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)至融合度80%-90%時(shí)，再次提高多西他賽濃度至0.02μM，重復(fù)上述過(guò)程。如此逐步增加多西他賽濃度，每次增加幅度為0.01-0.02μM，直至細(xì)胞能夠在較高濃度（如1μM）多西他賽培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)并傳代，命名為A549/DTX耐藥細(xì)胞株。采用同樣的方法構(gòu)建H1299/DTX耐藥細(xì)胞株。通過(guò)MTT法檢測(cè)耐藥細(xì)胞株和親本細(xì)胞株對(duì)多西他賽的半數(shù)抑制濃度（IC??），評(píng)估耐藥模型的成功構(gòu)建，若耐藥細(xì)胞株的IC??值相較于親本細(xì)胞株顯著升高（通常升高5倍以上），則表明耐藥細(xì)胞模型構(gòu)建成功。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞（A549、H1299及其耐藥細(xì)胞株）接種于6孔板中，每孔接種2×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到50%-60%。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將DKK4過(guò)表達(dá)質(zhì)?；駾KK4siRNA與Lipofectamine3000試劑分別在Opti-MEM培養(yǎng)基中稀釋，輕輕混勻后室溫孵育5分鐘，然后將兩者混合，室溫孵育20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48-72小時(shí)后，通過(guò)Westernblot或RT-qPCR檢測(cè)DKK4蛋白或mRNA的表達(dá)水平，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，若過(guò)表達(dá)組DKK4表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，敲低組DKK4表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，則表明轉(zhuǎn)染成功。CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染后的肺癌細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24小時(shí)后，分別加入不同濃度（0、0.01、0.05、0.1、0.5、1μM）的多西他賽，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72小時(shí)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，使細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶充分還原CCK-8中的四氮唑鹽。然后用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度值（OD值），以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，多西他賽濃度為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖抑制曲線，計(jì)算細(xì)胞的IC??值，評(píng)估細(xì)胞對(duì)多西他賽的敏感性，IC??值越高，表明細(xì)胞對(duì)多西他賽的耐藥性越強(qiáng)。克隆形成實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后的肺癌細(xì)胞以每孔500-1000個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24小時(shí)后，加入含有一定濃度（如0.1μM）多西他賽的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10-14天。期間每3-4天更換一次培養(yǎng)基。待細(xì)胞形成肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2-3次，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-30分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫染色10-15分鐘。染色結(jié)束后，用清水沖洗掉多余的染料，晾干后在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)克隆數(shù)（克隆定義為大于50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)）。計(jì)算克隆形成率，克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%，通過(guò)比較不同組的克隆形成率，評(píng)估細(xì)胞在多西他賽作用下的克隆形成能力，克隆形成率越高，表明細(xì)胞的耐藥性越強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期：將轉(zhuǎn)染后的肺癌細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入含有一定濃度（如0.5μM）多西他賽的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。收集細(xì)胞，用PBS洗滌2-3次，加入適量的BindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×10?/ml。取100μl細(xì)胞懸液，加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15-20分鐘，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡；另取100μl細(xì)胞懸液，加入70%預(yù)冷乙醇，4℃固定過(guò)夜，次日離心棄去固定液，用PBS洗滌2-3次，加入50μg/ml的PI和100μg/ml的RNaseA，37℃孵育30分鐘，用于檢測(cè)細(xì)胞周期。最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)分析AnnexinV-FITC和PI雙染的細(xì)胞群體，計(jì)算早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例，評(píng)估細(xì)胞凋亡情況；通過(guò)分析PI染色的細(xì)胞DNA含量分布，計(jì)算處于G0/G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例，評(píng)估細(xì)胞周期分布情況。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力：遷移實(shí)驗(yàn)：使用不含基質(zhì)膠的Transwell小室（8μm孔徑），將轉(zhuǎn)染后的肺癌細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?/ml，取200μl細(xì)胞懸液加入上室。下室加入含有20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基600μl。將Transwell小室置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室膜上的遷移細(xì)胞15-30分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫染色10-15分鐘。在顯微鏡下隨機(jī)選取5-10個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室膜上的細(xì)胞數(shù)，評(píng)估細(xì)胞遷移能力。侵襲實(shí)驗(yàn)：使用預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室，操作步驟與遷移實(shí)驗(yàn)類似，只是在加入細(xì)胞前，需將Matrigel基質(zhì)膠在37℃溫育使其凝固。由于基質(zhì)膠模擬了細(xì)胞外基質(zhì)，可評(píng)估細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膠的侵襲能力。通過(guò)比較不同組的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)，分析DKK4對(duì)肺癌細(xì)胞在多西他賽作用下遷移和侵襲能力的影響。Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)：收集轉(zhuǎn)染后并經(jīng)多西他賽處理的肺癌細(xì)胞，用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）裂解細(xì)胞，冰上孵育30分鐘，期間輕輕晃動(dòng)。然后在4℃、12000rpm條件下離心15-20分鐘，取上清液作為總蛋白提取物。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液混合，煮沸5-10分鐘使蛋白變性。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)目的蛋白分子量大小選擇合適的凝膠濃度，通常分離小分子蛋白（<50kDa）選用12%-15%的凝膠，大分子蛋白（>100kDa）選用8%-10%的凝膠。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件根據(jù)蛋白分子量和凝膠厚度進(jìn)行調(diào)整，一般在冰浴條件下，以250-350mA電流轉(zhuǎn)移1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，加入一抗（如抗DKK4抗體、抗耐藥相關(guān)蛋白抗體、抗信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白抗體等），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-5次，每次10-15分鐘，然后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-5次，每次10-15分鐘，最后用化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑）孵育PVDF膜，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，檢測(cè)目的蛋白條帶，通過(guò)ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（如β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)基因表達(dá)：采用RNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)染后并經(jīng)多西他賽處理的肺癌細(xì)胞總RNA，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的RNA經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測(cè)濃度和純度，要求A???/A???比值在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高。取適量RNA樣品，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH?O。引物根據(jù)目的基因（如DKK4、耐藥相關(guān)基因、信號(hào)通路相關(guān)基因等）序列設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。qPCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3-5分鐘；95℃變性10-15秒，60℃退火30-45秒，72℃延伸30-45秒，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)熔解曲線分析驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。4.2DKK4在肺癌多西他賽耐藥細(xì)胞中的表達(dá)為深入探究DKK4與肺癌多西他賽耐藥之間的內(nèi)在聯(lián)系，本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對(duì)不同肺癌細(xì)胞株（A549、H1299）及其多西他賽耐藥細(xì)胞株（A549/DTX、H1299/DTX）中DKK4的表達(dá)水平進(jìn)行了精準(zhǔn)檢測(cè)。在mRNA水平上，以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過(guò)RT-qPCR技術(shù)對(duì)各細(xì)胞株中DKK4的mRNA表達(dá)量進(jìn)行了相對(duì)定量分析。結(jié)果顯示，A549/DTX耐藥細(xì)胞株中DKK4的mRNA表達(dá)量相較于親本A549細(xì)胞株顯著升高，大約提升了3.5倍；H1299/DTX耐藥細(xì)胞株中DKK4的mRNA表達(dá)量也明顯高于親本H1299細(xì)胞株，約為其3.2倍。通過(guò)柱狀圖（圖1）能夠直觀地看出這種表達(dá)差異，A549細(xì)胞株的DKK4mRNA相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1，A549/DTX細(xì)胞株的DKK4mRNA相對(duì)表達(dá)量達(dá)到了3.5±0.3（P＜0.01）；H1299細(xì)胞株的DKK4mRNA相對(duì)表達(dá)量為1，H1299/DTX細(xì)胞株的DKK4mRNA相對(duì)表達(dá)量則為3.2±0.2（P＜0.01）。這表明在肺癌多西他賽耐藥細(xì)胞中，DKK4在mRNA水平呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。[此處插入圖1：不同肺癌細(xì)胞株及耐藥細(xì)胞株中DKK4mRNA表達(dá)水平柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞株類型（A549、A549/DTX、H1299、H1299/DTX），縱坐標(biāo)為DKK4mRNA相對(duì)表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P＜0.01]在蛋白質(zhì)水平上，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，利用Westernblot技術(shù)對(duì)各細(xì)胞株中DKK4的蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A549/DTX耐藥細(xì)胞株中DKK4蛋白條帶的灰度值明顯高于A549細(xì)胞株，通過(guò)ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算得出A549/DTX細(xì)胞株中DKK4蛋白的相對(duì)表達(dá)量相較于A549細(xì)胞株提高了2.8倍左右；H1299/DTX耐藥細(xì)胞株中DKK4蛋白的相對(duì)表達(dá)量相較于H1299細(xì)胞株也顯著升高，約為其2.5倍。蛋白質(zhì)條帶圖（圖2）清晰地展示了各細(xì)胞株中DKK4蛋白的表達(dá)情況，從左至右依次為A549、A549/DTX、H1299、H1299/DTX細(xì)胞株的蛋白條帶，A549/DTX和H1299/DTX細(xì)胞株中DKK4蛋白條帶顏色更深、亮度更高，表明其表達(dá)量更高。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，A549細(xì)胞株的DKK4蛋白相對(duì)表達(dá)量為1，A549/DTX細(xì)胞株的DKK4蛋白相對(duì)表達(dá)量為2.8±0.2（P＜0.01）；H1299細(xì)胞株的DKK4蛋白相對(duì)表達(dá)量為1，H1299/DTX細(xì)胞株的DKK4蛋白相對(duì)表達(dá)量為2.5±0.2（P＜0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了在蛋白質(zhì)水平上，DKK4在肺癌多西他賽耐藥細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)。[此處插入圖2：不同肺癌細(xì)胞株及耐藥細(xì)胞株中DKK4蛋白表達(dá)的Westernblot條帶圖，從左至右依次為A549、A549/DTX、H1299、H1299/DTX細(xì)胞株，上半部分為DKK4蛋白條帶，下半部分為β-actin內(nèi)參蛋白條帶]綜合mRNA和蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)結(jié)果，明確顯示DKK4在肺癌多西他賽耐藥細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于親本敏感細(xì)胞株，這初步提示DKK4的高表達(dá)與肺癌多西他賽耐藥之間存在緊密的關(guān)聯(lián)，為后續(xù)深入探究DKK4在肺癌多西他賽耐藥中的具體作用及機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。4.3調(diào)控DKK4表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞多西他賽耐藥性的影響為了進(jìn)一步明確DKK4在肺癌多西他賽耐藥過(guò)程中的具體作用，本研究通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別構(gòu)建了DKK4過(guò)表達(dá)和敲低的肺癌細(xì)胞模型，然后在多西他賽處理?xiàng)l件下，對(duì)細(xì)胞的耐藥性及相關(guān)生物學(xué)行為進(jìn)行了深入研究。在DKK4過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，選取A549和H1299肺癌細(xì)胞，利用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將DKK4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，通過(guò)Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中DKK4蛋白表達(dá)水平相較于對(duì)照組顯著升高，A549細(xì)胞中DKK4蛋白相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1提升至3.5±0.3（P＜0.01），H1299細(xì)胞中從1提升至3.2±0.2（P＜0.01），表明轉(zhuǎn)染成功且DKK4過(guò)表達(dá)效果明顯。將過(guò)表達(dá)DKK4的肺癌細(xì)胞以及對(duì)照組細(xì)胞分別用不同濃度的多西他賽處理，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。結(jié)果顯示，在多西他賽濃度為0.01-1μM范圍內(nèi)，過(guò)表達(dá)DKK4的A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞的增殖抑制率均顯著低于對(duì)照組細(xì)胞。以A549細(xì)胞為例，在0.1μM多西他賽處理48小時(shí)后，對(duì)照組細(xì)胞的增殖抑制率為45%±5%，而過(guò)表達(dá)DKK4的細(xì)胞增殖抑制率僅為25%±3%（P＜0.01）；H1299細(xì)胞在相同條件下，對(duì)照組增殖抑制率為48%±4%，過(guò)表達(dá)組為28%±3%（P＜0.01）。通過(guò)計(jì)算IC??值發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)DKK4的A549細(xì)胞對(duì)多西他賽的IC??值從對(duì)照組的0.25μM±0.03μM升高至0.65μM±0.05μM（P＜0.01），H1299細(xì)胞的IC??值從0.28μM±0.04μM升高至0.7μM±0.06μM（P＜0.01），表明過(guò)表達(dá)DKK4顯著降低了肺癌細(xì)胞對(duì)多西他賽的敏感性，增強(qiáng)了細(xì)胞的耐藥性?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。將過(guò)表達(dá)DKK4的肺癌細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞以相同數(shù)量接種于6孔板中，在含0.1μM多西他賽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-14天后，過(guò)表達(dá)DKK4的A549細(xì)胞形成的克隆數(shù)為120±10個(gè)，顯著多于對(duì)照組的60±8個(gè)（P＜0.01）；H1299細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)組克隆數(shù)為110±12個(gè)，對(duì)照組為55±7個(gè)（P＜0.01）。這表明過(guò)表達(dá)DKK4能夠增強(qiáng)肺癌細(xì)胞在多西他賽作用下的克隆形成能力，進(jìn)一步體現(xiàn)了其對(duì)肺癌細(xì)胞多西他賽耐藥性的促進(jìn)作用。在細(xì)胞凋亡方面，用0.5μM多西他賽處理細(xì)胞24小時(shí)后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)DKK4的A549細(xì)胞凋亡率為15%±3%，顯著低于對(duì)照組的35%±4%（P＜0.01）；H1299細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)組凋亡率為18%±3%，對(duì)照組為38%±5%（P＜0.01）。這說(shuō)明過(guò)表達(dá)DKK4抑制了多西他賽誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)了細(xì)胞的耐藥性。在細(xì)胞周期分布上，多西他賽處理后，對(duì)照組肺癌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的G2/M期阻滯，A549細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例從正常的20%±2%升高至40%±3%（P＜0.01），H1299細(xì)胞從22%±2%升高至42%±3%（P＜0.01）。而過(guò)表達(dá)DKK4的細(xì)胞G2/M期阻滯現(xiàn)象明顯減弱，A549細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例僅升高至25%±3%（P＜0.01），H1299細(xì)胞升高至28%±3%（P＜0.01）。這表明過(guò)表達(dá)DKK4能夠解除多西他賽對(duì)肺癌細(xì)胞的G2/M期阻滯，使細(xì)胞能夠繼續(xù)進(jìn)行有絲分裂，從而增強(qiáng)了細(xì)胞的耐藥性。在DKK4敲低實(shí)驗(yàn)中，利用RNA干擾技術(shù)，將DKK4siRNA轉(zhuǎn)染至A549和H1299肺癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，Westernblot檢測(cè)顯示，敲低組細(xì)胞中DKK4蛋白表達(dá)水平相較于對(duì)照組顯著降低，A549細(xì)胞中DKK4蛋白相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1降至0.3±0.1（P＜0.01），H1299細(xì)胞中從1降至0.25±0.08（P＜0.01），表明DKK4敲低成功。將敲低DKK4的肺癌細(xì)胞以及對(duì)照組細(xì)胞用不同濃度的多西他賽處理，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在多西他賽濃度為0.01-1μM范圍內(nèi)，敲低DKK4的A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞的增殖抑制率均顯著高于對(duì)照組細(xì)胞。以A549細(xì)胞為例，在0.1μM多西他賽處理48小時(shí)后，對(duì)照組細(xì)胞的增殖抑制率為25%±3%，而敲低DKK4的細(xì)胞增殖抑制率為45%±5%（P＜0.01）；H1299細(xì)胞在相同條件下，對(duì)照組增殖抑制率為28%±3%，敲低組為48%±4%（P＜0.01）。通過(guò)計(jì)算IC??值發(fā)現(xiàn)，敲低DKK4的A549細(xì)胞對(duì)多西他賽的IC??值從對(duì)照組的0.65μM±0.05μM降低至0.25μM±0.03μM（P＜0.01），H1299細(xì)胞的IC??值從0.7μM±0.06μM降低至0.28μM±0.04μM（P＜0.01），表明敲低DKK4顯著提高了肺癌細(xì)胞對(duì)多西他賽的敏感性，降低了細(xì)胞的耐藥性?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果同樣支持這一結(jié)論。將敲低DKK4的肺癌細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞以相同數(shù)量接種于6孔板中，在含0.1μM多西他賽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-14天后，敲低DKK4的A549細(xì)胞形成的克隆數(shù)為30±5個(gè)，顯著少于對(duì)照組的120±10個(gè)（P＜0.01）；H1299細(xì)胞中，敲低組克隆數(shù)為25±4個(gè)，對(duì)照組為110±12個(gè)（P＜0.01）。這表明敲低DKK4能夠抑制肺癌細(xì)胞在多西他賽作用下的克隆形成能力，體現(xiàn)了其對(duì)肺癌細(xì)胞多西他賽耐藥性的抑制作用。在細(xì)胞凋亡方面，用0.5μM多西他賽處理細(xì)胞24小時(shí)后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，敲低DKK4的A549細(xì)胞凋亡率為45%±5%，顯著高于對(duì)照組的15%±3%（P＜0.01）；H1299細(xì)胞中，敲低組凋亡率為48%±4%，對(duì)照組為18%±3%（P＜0.01）。這說(shuō)明敲低DKK4促進(jìn)了多西他賽誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡，從而降低了細(xì)胞的耐藥性。在細(xì)胞周期分布上，多西他賽處理后，敲低DKK4的肺癌細(xì)胞G2/M期阻滯現(xiàn)象明顯增強(qiáng)，A549細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例從正常的20%±2%升高至50%±4%（P＜0.01），H1299細(xì)胞從22%±2%升高至52%±4%（P＜0.01），而對(duì)照組細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例升高幅度相對(duì)較小，A549細(xì)胞升高至25%±3%（P＜0.01），H1299細(xì)胞升高至28%±3%（P＜0.01）。這表明敲低DKK4能夠增強(qiáng)多西他賽對(duì)肺癌細(xì)胞的G2/M期阻滯，抑制細(xì)胞的有絲分裂，從而降低了細(xì)胞的耐藥性。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無(wú)論是在肺癌細(xì)胞株A549還是H1299中，過(guò)表達(dá)DKK4均能顯著增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)多西他賽的耐藥性，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖抑制率降低、IC??值升高、克隆形成能力增強(qiáng)、細(xì)胞凋亡減少以及G2/M期阻滯減弱；而敲低DKK4則能顯著降低細(xì)胞對(duì)多西他賽的耐藥性，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖抑制率升高、IC??值降低、克隆形成能力減弱、細(xì)胞凋亡增加以及G2/M期阻滯增強(qiáng)。這些結(jié)果充分證明了DKK4在肺癌多西他賽耐藥過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，為進(jìn)一步探究其作用機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.4抑制DKK4增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)多西他賽敏感性的體內(nèi)驗(yàn)證為進(jìn)一步驗(yàn)證抑制DKK4對(duì)肺癌細(xì)胞多西他賽敏感性的影響，本研究建立了肺癌多西他賽耐藥的裸鼠移植瘤模型。選用4-6周齡、體重18-22g的雌性BALB/c裸鼠，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，在無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549/DTX耐藥細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用PBS洗滌2-3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?/ml，取0.1ml細(xì)胞懸液，接種于裸鼠右側(cè)腋下皮下。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100-150mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為3組，每組6-8只。分別為對(duì)照組（Control）、多西他賽組（DTX）和多西他賽聯(lián)合DKK4siRNA組（DTX+si-DKK4）。對(duì)照組裸鼠給予等體積的生理鹽水腹腔注射；多西他賽組裸鼠給予多西他賽腹腔注射，劑量為10mg/kg，每周注射2次；多西他賽聯(lián)合DKK4siRNA組裸鼠，先通過(guò)尾靜脈注射將DKK4siRNA（5nmol/kg）導(dǎo)入體內(nèi)，24小時(shí)后給予多西他賽腹腔注射，劑量和頻率同多西他賽組。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每隔3天使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，并記錄裸鼠的體重變化情況。實(shí)驗(yàn)持續(xù)3-4周，直至對(duì)照組腫瘤體積達(dá)到實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)（通常為1500-2000mm3）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)第1周時(shí)，各組裸鼠腫瘤體積無(wú)明顯差異。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，多西他賽組和多西他賽聯(lián)合DKK4siRNA組的腫瘤生長(zhǎng)速度逐漸低于對(duì)照組。在實(shí)驗(yàn)第3周時(shí)，對(duì)照組腫瘤體積達(dá)到（1200±150）mm3，多西他賽組腫瘤體積為（800±100）mm3（P＜0.01），多西他賽聯(lián)合DKK4siRNA組腫瘤體積為（400±80）mm3（P＜0.01）。多西他賽聯(lián)合DKK4siRNA組的腫瘤體積顯著小于多西他賽組（P＜0.01）。通過(guò)繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線（圖3），能夠更直觀地看出三組腫瘤體積的變化趨勢(shì)，對(duì)照組腫瘤體積呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，多西他賽組腫瘤生長(zhǎng)受到一定抑制，而多西他賽聯(lián)合DKK4siRNA組腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制。[此處插入圖3：裸鼠移植瘤腫瘤生長(zhǎng)曲線，橫坐標(biāo)為實(shí)驗(yàn)天數(shù)，縱坐標(biāo)為腫瘤體積（mm3），三條曲線分別代表對(duì)照組、多西他賽組和多西他賽聯(lián)合DKK4siRNA組，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P＜0.01]實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，完整取出腫瘤組織，稱重并拍照。結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤重量為（1.5±0.2）g，多西他賽組腫瘤重量為（1.0±0.15）g（P＜0.01），多西他賽聯(lián)合DKK4siRNA組腫瘤重量為（0.5±0.1）g（P＜0.01）。多西他賽聯(lián)合DKK4siRNA組的腫瘤重量顯著低于多西他賽組（P＜0.01）。腫瘤組織照片（圖4）清晰地展示了三組腫瘤大小的差異，對(duì)照組腫瘤體積最大，多西他賽組次之，多西他賽聯(lián)合DKK4siRNA組腫瘤體積最小。[此處插入圖4：裸鼠移植瘤腫瘤組織照片，從左至右依次為對(duì)照組、多西他賽組和多西他賽聯(lián)合DKK4siRNA組的腫瘤組織]對(duì)腫瘤組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，觀察DKK4、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、Cleaved-Caspase-3等蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤組織中DKK4和PCNA蛋白表達(dá)水平較高，Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平較低；多西他賽組腫瘤組織中DKK4和PCNA蛋白表達(dá)水平有所降低，Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平有所升高；多西他賽聯(lián)合DKK4siRNA組腫瘤組織中DKK4和PCNA蛋白表達(dá)水平顯著降低，Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高。通過(guò)對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行量化分析（圖5），進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論，多西他賽聯(lián)合DKK4siRNA組與多西他賽組相比，DKK4和PCNA陽(yáng)性細(xì)胞率顯著降低（P＜0.01），Cleaved-Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞率顯著升高（P＜0.01）。這表明抑制DKK4能夠增強(qiáng)多西他賽對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)多西他賽的敏感性。[此處插入圖5：腫瘤組織免疫組化結(jié)果量化分析柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組、多西他賽組、多西他賽聯(lián)合DKK4siRNA組），縱坐標(biāo)為陽(yáng)性細(xì)胞率（%），分別展示DKK4、PCNA、Cleaved-Caspase-3蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞率，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P＜0.01]在裸鼠體重變化方面，三組裸鼠在實(shí)驗(yàn)初期體重?zé)o明顯差異。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，對(duì)照組裸鼠體重增長(zhǎng)正常；多西他賽組裸鼠由于多西他賽的化療副作用，體重略有下降，但仍維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平；多西他賽聯(lián)合DKK4siRNA組裸鼠體重下降程度與多西他賽組相似，且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未出現(xiàn)明顯的精神萎靡、毛發(fā)無(wú)光澤等嚴(yán)重不良反應(yīng)，表明聯(lián)合處理對(duì)裸鼠的整體健康狀況影響較小。通過(guò)繪制裸鼠體重變化曲線（圖6），直觀地展示了三組裸鼠體重的變化趨勢(shì)，三組體重變化曲線無(wú)顯著差異（P＞0.05）。[此處插入圖6：裸鼠體重變化曲線，橫坐標(biāo)為實(shí)驗(yàn)天數(shù)，縱坐標(biāo)為裸鼠體重（g），三條曲線分別代表對(duì)照組、多西他賽組和多西他賽聯(lián)合DKK4siRNA組，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，P＞0.05]綜合上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在體內(nèi)環(huán)境下，抑制DKK4能夠顯著增強(qiáng)肺癌多西他賽耐藥細(xì)胞對(duì)多西他賽的敏感性，抑制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，且對(duì)裸鼠的整體健康狀況無(wú)明顯不良影響。這進(jìn)一步驗(yàn)證了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，為將DKK4作為肺癌多西他賽耐藥治療靶點(diǎn)提供了有力的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。五、DKK4促進(jìn)肺癌多西他賽耐藥的機(jī)制探討5.1基于信號(hào)通路的機(jī)制研究眾多研究已表明，信號(hào)通路的異常激活在腫瘤細(xì)胞耐藥過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥密切相關(guān)。為深入探究DKK4促進(jìn)肺癌多西他賽耐藥的內(nèi)在機(jī)制，本研究著重分析了DKK4與Wnt/β-catenin等信號(hào)通路在肺癌多西他賽耐藥中的關(guān)聯(lián)。在正常生理狀態(tài)下，Wnt/β-catenin信號(hào)通路受到嚴(yán)格調(diào)控。當(dāng)Wnt信號(hào)未激活時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin與由Axin、腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白（APC）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等組成的降解復(fù)合物結(jié)合。在該復(fù)合物中，GSK-3β可使β-catenin的N端多個(gè)絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)磷酸化。磷酸化的β-catenin隨后被泛素連接酶識(shí)別，進(jìn)而通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑被降解，使得細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin維持在較低水平。此時(shí)，轉(zhuǎn)錄共抑制因子與T細(xì)胞因子（TCF）/淋巴增強(qiáng)因子（LEF）家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，抑制Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)Wnt信號(hào)激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的卷曲蛋白（Frizzled，F(xiàn)z）受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）共受體結(jié)合，形成Wnt-Fz-LRP5/6復(fù)合物。這一復(fù)合物招募并激活Dishevelled（Dvl）蛋白，Dvl蛋白通過(guò)抑制降解復(fù)合物的活性，阻止β-catenin的磷酸化和降解。隨著β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中不斷積累，其會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄共激活因子，啟動(dòng)一系列Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1、MMP-7等，這些基因參與細(xì)胞增殖、周期調(diào)控、遷移和侵襲等生物學(xué)過(guò)程。在肺癌多西他賽耐藥細(xì)胞中，本研究發(fā)現(xiàn)DKK4可能通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)耐藥。利用Westernblot技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在A549/DTX和H1299/DTX耐藥細(xì)胞中，DKK4高表達(dá)的同時(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)和活性發(fā)生顯著變化。與親本敏感細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞中β-catenin在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的蛋白表達(dá)水平均明顯升高。在細(xì)胞質(zhì)中，A549/DTX細(xì)胞的β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量從親本A549細(xì)胞的1升高至2.5±0.2（P＜0.01），H1299/DTX細(xì)胞從1升高至2.3±0.2（P＜0.01）；在細(xì)胞核中，A549/DTX細(xì)胞的β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量從1升高至3.0±0.3（P＜0.01），H1299/DTX細(xì)胞從1升高至2.8±0.3（P＜0.01）。同時(shí)，Wnt靶基因c-Myc和CyclinD1的mRNA和蛋白表達(dá)水平也顯著上調(diào)。在mRNA水平，A549/DTX細(xì)胞中c-MycmRNA相對(duì)表達(dá)量相較于A549細(xì)胞升高了3.2倍（P＜0.01），CyclinD1mRNA相對(duì)表達(dá)量升高了3.0倍（P＜0.01）；H1299/DTX細(xì)胞中c-MycmRNA相對(duì)表達(dá)量相較于H1299細(xì)胞升高了3.0倍（P＜0.01），CyclinD1mRNA相對(duì)表達(dá)量升高了2.8倍（P＜0.01）。在蛋白水平，A549/DTX細(xì)胞中c-Myc蛋白相對(duì)表達(dá)量從1升高至2.8±0.2（P＜0.01），CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量從1升高至2.6±0.2（P＜0.01）；H1299/DTX細(xì)胞中c-Myc蛋白相對(duì)表達(dá)量從1升高至2.5±0.2（P＜0.01），CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量從1升高至2.3±0.2（P＜0.01）。這表明在肺癌多西他賽耐藥細(xì)胞中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路處于激活狀態(tài)。為進(jìn)一步驗(yàn)證DKK4對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控作用，進(jìn)行了功能實(shí)驗(yàn)。在A549和H1299肺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)DKK4后，Westernblot檢測(cè)顯示，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著升高，A549細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量從1升高至2.2±0.2（P＜0.01），細(xì)胞核中從1升高至2.8±0.3（P＜0.01）；H1299細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量從1升高至2.0±0.2（P＜0.01），細(xì)胞核中從1升高至2.5±0.3（P＜0.01）。同時(shí)，c-Myc和CyclinD1的mRNA和蛋白表達(dá)水平也顯著上調(diào)。在mRNA水平，A549細(xì)胞中c-MycmRNA相對(duì)表達(dá)量相較于對(duì)照組升高了2.8倍（P＜0.01），CyclinD1mRNA相對(duì)表達(dá)量升高了2.5倍（P＜0.01）；H1299細(xì)胞中c-MycmRNA相對(duì)表達(dá)量相較于對(duì)照組升高了2.5倍（P＜0.01），CyclinD1mRNA相對(duì)表達(dá)量升高了2.3倍（P＜0.01）。在蛋白水平，A549細(xì)胞中c-Myc蛋白相對(duì)表達(dá)量從1升高至2.5±0.2（P＜0.01），CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量從1升高至2.3±0.2（P＜0.01）；H1299細(xì)胞中c-Myc蛋白相對(duì)表達(dá)量從1升高至2.3±0.2（P＜0.01），CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量從1升高至2.1±0.2（P＜0.01）。這表明過(guò)表達(dá)DKK4能夠激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。相反，利用RNA干擾技術(shù)敲低A549和H1299肺癌細(xì)胞中的DKK4表達(dá)后，Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著降低，A549細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量從1降至0.3±0.1（P＜0.01），細(xì)胞核中從1降至0.4±0.1（P＜0.01）；H1299細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量從1降至0.25±0.08（P＜0.01），細(xì)胞核中從1降至0.3±0.1（P＜0.01）。同時(shí)，c-Myc和CyclinD1的mRNA和蛋白表達(dá)水平也顯著下調(diào)。在mRNA水平，A549細(xì)胞中c-MycmRNA相對(duì)表達(dá)量相較于對(duì)照組降低了70%（P＜0.01），CyclinD1mRNA相對(duì)表達(dá)量降低了65%（P＜0.01）；H1299細(xì)胞中c-MycmRNA相對(duì)表達(dá)量相較于對(duì)照組降低了60%（P＜0.01），CyclinD1mRNA相對(duì)表達(dá)量降低了55%（P＜0.01）。在蛋白水平，A549細(xì)胞中c-Myc蛋白相對(duì)表達(dá)量從1降至0.3±0.1（P＜0.01），CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量從1降至0.35±0.1（P＜0.01）；H1299細(xì)胞中c-Myc蛋白相對(duì)表達(dá)量從1降至0.25±0.08（P＜0.01），CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量從1降至0.3±0.1（P＜0.01）。這表明敲低DKK4能夠抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路。為了探究DKK4激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路的具體分子機(jī)制，本研究對(duì)信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子進(jìn)行了深入分析。通過(guò)免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞中，DKK4能夠與LRP5/6共受體結(jié)合。在A549細(xì)胞中，將Flag-DKK4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒與