NRAGE基因甲基化對乳腺癌細胞表達的調(diào)控機制及臨床意義探究

NRAGE基因甲基化對乳腺癌細胞表達的調(diào)控機制及臨床意義探究一、引言1.1研究背景乳腺癌作為全球女性健康的首要威脅，已成為女性中最為常見的惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的GLOBOCAN2020數(shù)據(jù)顯示，2020年全球乳腺癌新發(fā)病例高達226萬，首次超越肺癌，躍居全球癌癥發(fā)病首位，且這一數(shù)字在近年來仍呈持續(xù)上升趨勢。在中國，乳腺癌同樣是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，每年約有20萬女性被確診，發(fā)病年齡相較于西方國家更早，且確診時多為中晚期，嚴重影響患者的生存質(zhì)量與預后。盡管乳腺癌的治療手段在不斷發(fā)展，包括手術、化療、放療、內(nèi)分泌治療和靶向治療等，但晚期患者的5年生存率僅為20％，總體中位生存時間僅為2-3年，因此，深入探究乳腺癌的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和生物標志物，對于提高乳腺癌的早期診斷率和治療效果具有至關重要的意義。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的眾多機制中，DNA甲基化作為表觀遺傳學的重要調(diào)控方式，近年來備受關注。DNA甲基化是在DNA甲基轉移酶（DNMT）的作用下，將甲基基團添加到DNA分子的特定區(qū)域，通常是CpG島（富含CpG二核苷酸的區(qū)域），這種修飾大多發(fā)生在基因啟動子區(qū)域，雖然不改變DNA序列，但卻能對基因表達進行調(diào)控。在腫瘤發(fā)生過程中，DNA甲基化模式會發(fā)生顯著改變，包括基因組整體甲基化水平降低以及某些特定基因啟動子區(qū)域的高甲基化。這些變化能夠導致基因表達異常，使抑癌基因沉默，無法發(fā)揮抑制細胞異常增殖和轉移的功能，同時也可能激活癌基因，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。大量研究表明，DNA異常甲基化與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移及預后密切相關，檢測特定基因的甲基化程度已成為判斷乳腺癌發(fā)展狀態(tài)和預后的重要指標，為乳腺癌的早期診斷、治療方案選擇和預后評估提供了新的思路和方法。NRAGE基因（NeurotrophinReceptor-interactingMAGEHomolog），又稱MAGE-D1，是黑色素瘤相關抗原MAGE家族的重要成員之一。與大部分僅在腫瘤和睪丸中表達的MAGE家族蛋白不同，NRAGE基因在個體發(fā)育早期以及成年后的各個組織中均有表達。現(xiàn)有研究顯示，NRAGE基因具有明顯的促進細胞凋亡和抑制腫瘤轉移的能力，被認為是一個潛在的抑癌基因。在乳腺癌的研究中，發(fā)現(xiàn)NRAGE基因的表達受到DNA甲基化調(diào)控的影響，但其具體的甲基化調(diào)控機制及其在乳腺癌細胞中的表達調(diào)控模式尚不完全清楚。深入研究NRAGE基因的甲基化調(diào)控機制及其對乳腺癌細胞中NRAGE表達的影響，不僅有助于揭示乳腺癌的發(fā)病機制，還可能為乳腺癌的治療提供新的靶點和策略，具有重要的理論和臨床意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入剖析NRAGE基因甲基化對其在乳腺癌細胞中表達的調(diào)控機制。通過對比正常乳腺細胞與乳腺癌細胞中NRAGE基因的甲基化狀態(tài)，探究其甲基化在乳腺癌細胞中的具體調(diào)控機制，明確NRAGE基因甲基化與乳腺癌細胞中NRAGE表達之間的關系，為進一步揭示乳腺癌的發(fā)病機制奠定理論基礎。乳腺癌作為嚴重威脅女性健康的重大疾病，盡管當前的治療手段取得了一定進展，但仍存在諸多難題，如晚期患者生存率低、治療耐藥性等。深入研究NRAGE基因甲基化調(diào)控機制，對于乳腺癌的防治具有重大意義。在治療方面，若能明確NRAGE基因甲基化與乳腺癌細胞中NRAGE表達的關系，有望開發(fā)以NRAGE基因為靶點的新型治療策略。例如，針對NRAGE基因高甲基化導致其表達沉默的情況，研發(fā)能夠特異性逆轉這種甲基化狀態(tài)的藥物，恢復NRAGE基因的正常表達，從而發(fā)揮其抑制腫瘤轉移和促進細胞凋亡的作用，為乳腺癌患者提供新的治療選擇。在預后判斷方面，NRAGE基因的甲基化狀態(tài)有可能作為一種新的生物標志物，用于評估乳腺癌患者的預后情況。高甲基化狀態(tài)可能預示著患者的病情更容易進展，預后較差；而低甲基化狀態(tài)則可能提示較好的預后。這將幫助醫(yī)生更準確地判斷患者的病情發(fā)展趨勢，制定個性化的治療方案，提高治療效果和患者的生存質(zhì)量。二、相關理論基礎2.1DNA甲基化概述2.1.1DNA甲基化的概念與修飾方式DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾，指的是在DNA甲基轉移酶（DNMT）的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）為甲基供體，將甲基基團（-CH?）共價結合到DNA分子特定堿基上的過程。在哺乳動物中，這種修飾大多發(fā)生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶（C）的第五位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC），這也是目前研究最為廣泛和深入的DNA甲基化形式。CpG二核苷酸在基因組中并非均勻分布，某些區(qū)域其密度比平均密度高10-20倍，這些區(qū)域被稱為CpG島。通常情況下，基因組中約70%的CpG島處于甲基化狀態(tài)。在正常細胞中，基因啟動子區(qū)域的CpG島大多處于非甲基化狀態(tài)，這有利于基因的轉錄起始，因為轉錄因子能夠順利結合到這些區(qū)域，啟動基因的轉錄過程；而當基因啟動子區(qū)域的CpG島發(fā)生高甲基化時，甲基基團的存在會阻礙轉錄因子與DNA的結合，或者招募一些抑制性的甲基結合蛋白，從而導致基因表達被抑制，使基因無法正常轉錄為RNA，進而影響蛋白質(zhì)的合成。除了5-甲基胞嘧啶這種主要的修飾方式外，在其他生物或特定情況下，DNA甲基化還可能發(fā)生在腺嘌呤的N-6位（形成N6-甲基腺嘌呤，N6-mA）以及鳥嘌呤的N-7位（形成7-甲基鳥嘌呤，7-mG），但這些修飾形式在哺乳動物中相對較少見，其功能和調(diào)控機制也有待進一步深入研究。2.1.2DNA甲基化的正常生理功能在生物體內(nèi)，DNA甲基化參與了眾多重要的生理過程，對維持生物體的正常生長發(fā)育和細胞功能起著不可或缺的作用。在基因表達調(diào)控方面，DNA甲基化猶如一個精細的開關，通過對基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)的調(diào)控，精確地控制著基因的表達水平。如管家基因，其啟動子區(qū)域通常保持低甲基化狀態(tài)，使得這些基因能夠持續(xù)穩(wěn)定地表達，為細胞的基本生命活動提供必要的物質(zhì)基礎，像參與細胞代謝、蛋白質(zhì)合成等過程的相關基因，它們的穩(wěn)定表達確保了細胞內(nèi)各種生化反應的正常進行。而對于一些組織特異性基因，其表達則受到發(fā)育階段和組織環(huán)境的嚴格調(diào)控，DNA甲基化在這個過程中發(fā)揮著關鍵作用。在胚胎發(fā)育早期，隨著細胞的分化，不同組織細胞會逐漸建立起特定的DNA甲基化模式，使得相應的組織特異性基因在正確的時間和細胞類型中表達，從而促使不同組織和器官的正常發(fā)育和形成。例如，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，神經(jīng)相關基因啟動子區(qū)域的低甲基化，使得這些基因能夠大量表達，為神經(jīng)細胞的分化、遷移和功能建立提供保障?；蚪M印記也是DNA甲基化的重要生理功能之一?；蚪M印記是一種表觀遺傳現(xiàn)象，它使得來自父方和母方的等位基因在子代中呈現(xiàn)出差異性表達。這種差異性表達是由親代配子形成過程中建立的DNA甲基化印記所決定的。例如，胰島素樣生長因子2（Igf2）基因，在小鼠中只有來自父方的等位基因能夠表達，而來自母方的等位基因則由于啟動子區(qū)域的高甲基化而處于沉默狀態(tài)。這種印記模式對于胚胎的正常發(fā)育至關重要，如果基因組印記異常，可能導致胚胎發(fā)育異常、生長遲緩甚至引發(fā)多種遺傳性疾病。X染色體失活同樣依賴于DNA甲基化。在雌性哺乳動物中，為了平衡雌雄個體X染色體上基因的劑量，兩條X染色體中的一條會隨機發(fā)生失活，形成巴氏小體。這一過程涉及到X染色體上的Xist基因，Xist基因轉錄產(chǎn)生的非編碼RNA會包裹并覆蓋在即將失活的X染色體上，隨后引發(fā)一系列的表觀遺傳修飾變化，其中DNA甲基化起著關鍵的維持作用。失活X染色體上的基因啟動子區(qū)域會發(fā)生廣泛的高甲基化，使得這些基因無法表達，從而確保了雌性個體細胞中X染色體基因表達劑量與雄性個體的平衡。若X染色體失活過程中DNA甲基化異常，可能導致X染色體相關基因的表達紊亂，引發(fā)各種發(fā)育異常和疾病。2.1.3DNA甲基化與腫瘤的關系大量研究表明，DNA甲基化異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，是腫瘤表觀遺傳學研究的重要內(nèi)容。在腫瘤發(fā)生過程中，DNA甲基化模式會發(fā)生顯著改變，主要表現(xiàn)為基因組整體甲基化水平降低以及某些特定基因啟動子區(qū)域的高甲基化?；蚪M整體甲基化水平降低會導致基因組的不穩(wěn)定性增加。這是因為在正常情況下，DNA甲基化能夠抑制轉座子等重復序列的活性，維持基因組的穩(wěn)定性。當整體甲基化水平降低時，轉座子等重復序列被激活，它們可以在基因組中移動和插入，導致基因結構的破壞和突變的發(fā)生，進而促進腫瘤的發(fā)生。例如，LINE-1（長散在核元件-1）是一種常見的轉座子，在腫瘤細胞中，LINE-1的甲基化水平明顯降低，其活性增強，導致LINE-1在基因組中的轉座和插入頻率增加，破壞了正常基因的結構和功能，為腫瘤的發(fā)生提供了分子基礎。而某些特定基因啟動子區(qū)域的高甲基化則是腫瘤發(fā)生的重要機制之一，尤其是抑癌基因。抑癌基因在正常細胞中發(fā)揮著抑制細胞異常增殖、誘導細胞凋亡、維持基因組穩(wěn)定性等重要作用。當這些抑癌基因啟動子區(qū)域發(fā)生高甲基化時，基因的表達被沉默，無法發(fā)揮其正常的抑癌功能，使得細胞失去了對增殖和凋亡的正常調(diào)控，從而導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。以乳腺癌相關的BRCA1基因（乳腺癌易感基因1）為例，該基因啟動子區(qū)域的高甲基化在部分乳腺癌患者中頻繁出現(xiàn)，導致BRCA1基因表達缺失，使得細胞對DNA損傷的修復能力下降，基因組不穩(wěn)定性增加，進而促進了乳腺癌的發(fā)生。此外，腫瘤抑制基因p16的啟動子區(qū)域高甲基化也常見于多種腫瘤，包括乳腺癌、肺癌等。p16基因編碼的蛋白參與細胞周期的調(diào)控，當p16基因啟動子高甲基化導致其表達沉默時，細胞周期調(diào)控紊亂，細胞容易發(fā)生異常增殖，最終引發(fā)腫瘤。除了在腫瘤發(fā)生階段的作用，DNA甲基化還與腫瘤的轉移、耐藥性等密切相關。腫瘤細胞在轉移過程中，某些與細胞粘附、遷移相關基因的甲基化狀態(tài)改變，會促進腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。同時，腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性也與DNA甲基化有關，一些耐藥相關基因的高甲基化可能導致腫瘤細胞對化療藥物的敏感性降低，從而影響腫瘤的治療效果。因此，深入研究DNA甲基化與腫瘤的關系，對于腫瘤的早期診斷、治療和預后評估具有重要的臨床意義。2.2NRAGE基因概述2.2.1NRAGE基因的結構與編碼蛋白特點NRAGE基因，又稱MAGE-D1，定位于人類染色體1p36.3區(qū)域。該區(qū)域在多種腫瘤中常出現(xiàn)缺失或異常，暗示了NRAGE基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的潛在重要性。NRAGE基因全長約[X]kb，包含[X]個外顯子和[X]個內(nèi)含子。其獨特的基因結構通過精確的轉錄和剪接機制，指導合成具有特定功能的NRAGE蛋白。NRAGE基因編碼的NRAGE蛋白由[X]個氨基酸殘基組成，分子量約為[X]kDa。該蛋白具有典型的MAGE家族結構特征，包含一個高度保守的MAGE結構域，位于蛋白的N端，約由160個氨基酸組成。這個結構域是MAGE家族蛋白發(fā)揮功能的關鍵區(qū)域，它能夠介導NRAGE蛋白與其他蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，參與多種細胞內(nèi)信號傳導通路。研究表明，NRAGE蛋白的MAGE結構域可與p53蛋白相互作用，增強p53的穩(wěn)定性和轉錄活性，從而促進細胞凋亡。除MAGE結構域外，NRAGE蛋白的C端還含有多個潛在的磷酸化位點和蛋白質(zhì)結合位點，這些位點能夠在細胞受到不同刺激時，發(fā)生磷酸化修飾或與其他蛋白質(zhì)結合，進而調(diào)節(jié)NRAGE蛋白的活性和功能。例如，在細胞受到應激刺激時，NRAGE蛋白C端的某些磷酸化位點會被激活，使其能夠招募特定的信號分子，啟動細胞的應激反應。2.2.2NRAGE基因的生物學功能NRAGE基因在細胞的生命活動中發(fā)揮著多方面的重要作用，對維持細胞的正常生理狀態(tài)和調(diào)控細胞的病理過程具有關鍵意義。在細胞凋亡調(diào)控方面，NRAGE基因扮演著重要角色。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡過程，對于維持機體的正常發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關重要。NRAGE基因能夠通過多種途徑促進細胞凋亡。一方面，NRAGE蛋白可以與p53蛋白相互作用，穩(wěn)定p53蛋白的結構，增強其轉錄活性。p53作為一種重要的腫瘤抑制因子，能夠激活一系列促凋亡基因的表達，如Bax、PUMA等，從而誘導細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在正常細胞中，NRAGE與p53的結合有助于維持p53的穩(wěn)定水平，當細胞受到DNA損傷等刺激時，NRAGE-p53復合物能夠迅速響應，啟動細胞凋亡程序，清除受損細胞。另一方面，NRAGE還可以直接與凋亡相關蛋白相互作用，調(diào)節(jié)凋亡信號通路。例如，NRAGE能夠與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結合，促進凋亡小體的形成，激活半胱天冬酶（caspase）家族成員，引發(fā)細胞凋亡的級聯(lián)反應。NRAGE基因對細胞周期也具有顯著的抑制作用。細胞周期的正常調(diào)控是保證細胞正常增殖和分化的基礎，一旦細胞周期失控，細胞就可能發(fā)生異常增殖，進而導致腫瘤的發(fā)生。NRAGE基因能夠通過調(diào)節(jié)細胞周期相關蛋白的表達和活性，使細胞周期停滯在特定階段，抑制細胞的增殖。研究表明，NRAGE可以抑制細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，CDK是細胞周期進程中的關鍵調(diào)節(jié)因子，其活性的抑制會導致細胞周期停滯在G1期或G2/M期。同時，NRAGE還能上調(diào)細胞周期抑制蛋白p21的表達，p21可以與CDK-細胞周期蛋白復合物結合，阻止細胞周期的推進，從而抑制細胞的增殖。在乳腺癌細胞中，過表達NRAGE基因會導致細胞周期相關蛋白的表達發(fā)生改變，使細胞周期停滯，細胞增殖能力明顯下降。此外，NRAGE基因在細胞分化和胚胎發(fā)育過程中也發(fā)揮著不可或缺的作用。在胚胎發(fā)育早期，NRAGE基因在多個組織和器官中均有表達，參與細胞的分化和組織器官的形成。例如，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，NRAGE基因的表達對于神經(jīng)干細胞的分化和神經(jīng)元的遷移具有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，敲低NRAGE基因會導致神經(jīng)干細胞的分化異常，神經(jīng)元的遷移受阻，從而影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。在心血管系統(tǒng)發(fā)育中，NRAGE基因也參與調(diào)控心肌細胞的分化和心臟的形態(tài)發(fā)生，其表達異?？赡軐е滦呐K發(fā)育畸形。2.2.3NRAGE基因在正常細胞與腫瘤細胞中的表達差異NRAGE基因在正常細胞和腫瘤細胞中的表達呈現(xiàn)出明顯的差異，這種差異與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。在正常細胞中，NRAGE基因通常呈現(xiàn)出一定水平的表達，但其表達受到嚴格的調(diào)控，維持在相對穩(wěn)定的狀態(tài)。在胚胎發(fā)育早期，NRAGE基因在多個組織和器官中廣泛表達，對細胞的分化和組織器官的形成起到重要作用。隨著個體的發(fā)育成熟，NRAGE基因在大多數(shù)成年組織中的表達水平逐漸降低，但在一些特定組織中仍保持相對穩(wěn)定的低水平表達，如大腦、心臟、肝臟等。在正常乳腺組織中，NRAGE基因的表達能夠維持乳腺上皮細胞的正常生理功能，參與細胞的增殖、分化和凋亡調(diào)控，對維持乳腺組織的穩(wěn)態(tài)具有重要意義。然而，在腫瘤細胞中，NRAGE基因的表達常常發(fā)生異常改變。大量研究表明，在多種腫瘤中，包括乳腺癌、肝癌、胃癌等，NRAGE基因的表達水平明顯低于正常組織，呈現(xiàn)出低表達或沉默狀態(tài)。在乳腺癌患者的腫瘤組織樣本中，通過實時熒光定量PCR和免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，NRAGE基因的mRNA和蛋白表達水平相較于正常乳腺組織顯著降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)，NRAGE基因的低表達與乳腺癌的惡性程度密切相關，低表達的NRAGE基因會導致乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力增強，患者的預后較差。這種表達差異的產(chǎn)生機制與腫瘤細胞中NRAGE基因啟動子區(qū)域的高甲基化密切相關。腫瘤細胞中，NRAGE基因啟動子區(qū)域的CpG島發(fā)生高甲基化，使得轉錄因子無法與啟動子區(qū)域結合，從而抑制了NRAGE基因的轉錄，導致其表達水平降低。相反，在少數(shù)腫瘤中，NRAGE基因也可能出現(xiàn)高表達的情況。例如，在部分肝癌細胞中，NRAGE基因的表達水平明顯高于正常肝細胞，這可能是由于肝癌細胞所處的微環(huán)境因素，如低氧、炎癥等，誘導了NRAGE基因的表達上調(diào)。但這種高表達在不同腫瘤中的具體作用和機制尚不完全清楚，仍需進一步深入研究。三、NRAGE基因在乳腺癌中的表達及甲基化狀態(tài)分析3.1乳腺癌患者中NRAGE基因的表達水平調(diào)查為全面了解NRAGE基因在乳腺癌患者中的表達情況，本研究精心選取了[X]例乳腺癌患者作為研究對象。這些患者均來自[醫(yī)院名稱]，且在20XX年至20XX年期間接受了手術治療，術前均未接受過化療、放療或其他抗腫瘤治療，以確保研究結果不受其他治療因素的干擾。同時，為了使研究結果更具可靠性和對比性，選取了[X]例年齡匹配的乳腺良性疾病患者的正常乳腺組織作為對照樣本，這些患者同樣來自[醫(yī)院名稱]，并在同期接受了手術切除，病理診斷均為乳腺纖維瘤、乳腺增生等良性病變。在實驗方法上，運用實時熒光定量PCR技術對乳腺癌組織和正常乳腺組織中NRAGE基因的mRNA表達水平進行精確檢測。首先，采用TRIzol試劑分別從乳腺癌組織和正常乳腺組織樣本中提取總RNA，通過核酸蛋白測定儀對RNA的濃度和純度進行嚴格測定，確保其OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量良好，可用于后續(xù)實驗。接著，利用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA，隨后以cDNA為模板，運用設計好的特異性引物進行實時熒光定量PCR擴增。在引物設計方面，依據(jù)NRAGE基因的序列信息，借助PrimerPremier5.0軟件進行精心設計，并經(jīng)過BLAST比對確保引物的特異性。擴增反應在實時熒光定量PCR儀上嚴格按照標準程序進行，反應體系包含cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenPCRMasterMix等，反應條件為95℃預變性30s，然后進行40個循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s。在反應過程中，實時監(jiān)測熒光信號的變化，通過分析Ct值（循環(huán)閾值），采用2-ΔΔCt法計算NRAGE基因mRNA的相對表達量。同時，運用免疫組化技術對NRAGE基因編碼蛋白的表達水平及定位進行深入研究。將乳腺癌組織和正常乳腺組織樣本制成4μm厚的石蠟切片，依次進行脫蠟、水化處理，然后采用高溫高壓抗原修復法進行抗原修復。接著，用3%過氧化氫溶液孵育切片以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，隨后加入正常山羊血清進行封閉，以減少非特異性染色。之后，滴加一抗（兔抗人NRAGE多克隆抗體），4℃孵育過夜，使抗體與組織中的NRAGE蛋白充分結合。次日，用PBS沖洗切片后，滴加生物素標記的二抗，37℃孵育30min，再滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復合物，37℃孵育30min。最后，使用DAB顯色試劑盒進行顯色，蘇木精復染細胞核，脫水、透明后封片。在顯微鏡下觀察染色結果，根據(jù)染色強度和陽性細胞比例對NRAGE蛋白的表達進行半定量分析。染色強度分為陰性（0分）、弱陽性（1分）、中度陽性（2分）和強陽性（3分），陽性細胞比例分為<10%（0分）、10%-50%（1分）、51%-80%（2分）和>80%（3分），兩者得分相加，總分為0-1分為陰性，2-3分為弱陽性，4-5分為中度陽性，6分為強陽性。通過對不同分期乳腺癌患者的NRAGE基因表達數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤分期的進展，NRAGE基因的表達水平呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢。在I期乳腺癌患者中，NRAGE基因mRNA的相對表達量為[X1]，免疫組化檢測顯示NRAGE蛋白陽性表達率為[X1%]，其中中度陽性和強陽性表達率為[X11%]；而在IV期乳腺癌患者中，NRAGE基因mRNA的相對表達量僅為[X4]，免疫組化檢測顯示NRAGE蛋白陽性表達率降至[X4%]，中度陽性和強陽性表達率僅為[X44%]。不同分期之間NRAGE基因表達水平的差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在不同分型的乳腺癌患者中，NRAGE基因的表達也存在顯著差異。在LuminalA型乳腺癌患者中，NRAGE基因mRNA的相對表達量為[XA]，免疫組化檢測顯示NRAGE蛋白陽性表達率為[XA%]，其中中度陽性和強陽性表達率為[XA1%]；而在三陰性乳腺癌患者中，NRAGE基因mRNA的相對表達量為[XB]，免疫組化檢測顯示NRAGE蛋白陽性表達率為[XB%]，其中中度陽性和強陽性表達率為[XB1%]。LuminalA型乳腺癌患者的NRAGE基因表達水平明顯高于三陰性乳腺癌患者，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這些結果表明，NRAGE基因的表達水平與乳腺癌的分期和分型密切相關，其低表達可能在乳腺癌的進展和惡性轉化過程中發(fā)揮重要作用。3.2正常乳腺細胞與乳腺癌細胞中NRAGE基因甲基化狀態(tài)的比較3.2.1實驗設計與樣本選擇為深入探究NRAGE基因甲基化狀態(tài)在正常乳腺細胞與乳腺癌細胞中的差異，本研究選取了[X]例乳腺癌患者手術切除的新鮮乳腺癌組織樣本，以及距離腫瘤邊緣至少5cm的正常乳腺組織樣本作為對照。這些患者均為女性，年齡范圍在35-65歲之間，平均年齡為[X]歲，且均經(jīng)病理確診為浸潤性導管癌。同時，為了排除個體差異對實驗結果的影響，所有樣本均在手術切除后立即進行處理，以確保細胞的活性和基因甲基化狀態(tài)的穩(wěn)定性。實驗技術上，采用甲基化特異性PCR（MSP）技術來檢測NRAGE基因的甲基化狀態(tài)。該技術的原理是利用亞硫酸鹽處理DNA，使未甲基化的胞嘧啶轉變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的胞嘧啶保持不變。隨后，設計兩組特異性引物，一組針對甲基化的DNA序列（M引物），另一組針對未甲基化的DNA序列（U引物）。通過PCR擴增，若M引物能擴增出條帶，則表明樣本中NRAGE基因啟動子區(qū)域發(fā)生了甲基化；若U引物能擴增出條帶，則表明樣本中NRAGE基因啟動子區(qū)域未發(fā)生甲基化。在進行MSP實驗之前，首先對提取的基因組DNA進行質(zhì)量檢測，確保其純度和完整性。采用核酸蛋白測定儀測定DNA的濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之間。同時，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，觀察其是否有降解現(xiàn)象。然后，對基因組DNA進行亞硫酸鹽處理，具體步驟如下：取2μg基因組DNA，加入適量的亞硫酸鹽轉化試劑，按照試劑盒說明書進行操作。處理后的DNA經(jīng)過純化回收，去除未反應的亞硫酸鹽和雜質(zhì)，以確保后續(xù)PCR反應的準確性。為了驗證MSP實驗結果的可靠性，設置了陽性對照和陰性對照。陽性對照采用已知甲基化狀態(tài)的DNA樣本，陰性對照則采用水代替DNA模板。在PCR反應體系中，除了模板DNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和緩沖液外，還加入了適量的Mg2+，以優(yōu)化PCR反應條件。PCR反應程序為：95℃預變性5min，然后進行35個循環(huán)的95℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物通過2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄結果。3.2.2實驗結果與數(shù)據(jù)分析通過甲基化特異性PCR（MSP）技術對正常乳腺細胞和乳腺癌細胞中NRAGE基因的甲基化狀態(tài)進行檢測，結果顯示：在[X]例正常乳腺組織樣本中，NRAGE基因啟動子區(qū)域未發(fā)生甲基化的樣本有[X1]例，占比為[X1%]；發(fā)生甲基化的樣本有[X2]例，占比為[X2%]。而在[X]例乳腺癌組織樣本中，NRAGE基因啟動子區(qū)域未發(fā)生甲基化的樣本僅有[X3]例，占比為[X3%]；發(fā)生甲基化的樣本高達[X4]例，占比為[X4%]。乳腺癌組織中NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化頻率顯著高于正常乳腺組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。對不同分期乳腺癌患者的NRAGE基因甲基化狀態(tài)進行分析，發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤分期的升高，NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化頻率逐漸增加。在I期乳腺癌患者中，NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化頻率為[X5%]；II期乳腺癌患者中，甲基化頻率上升至[X6%]；III期乳腺癌患者中，甲基化頻率進一步升高至[X7%]；IV期乳腺癌患者中，甲基化頻率高達[X8%]。不同分期之間NRAGE基因甲基化頻率的差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在不同分型的乳腺癌患者中，NRAGE基因甲基化狀態(tài)也存在明顯差異。在LuminalA型乳腺癌患者中，NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化頻率為[X9%]；而在三陰性乳腺癌患者中，甲基化頻率高達[X10%]。三陰性乳腺癌患者的NRAGE基因甲基化頻率顯著高于LuminalA型乳腺癌患者，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。通過對正常乳腺細胞與乳腺癌細胞中NRAGE基因甲基化狀態(tài)的比較分析，明確了NRAGE基因啟動子區(qū)域在乳腺癌細胞中呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，且這種甲基化狀態(tài)與乳腺癌的分期和分型密切相關。這一結果為進一步探究NRAGE基因甲基化在乳腺癌細胞中的調(diào)控機制奠定了基礎。四、NRAGE基因甲基化在乳腺癌細胞中的調(diào)控機制4.1影響NRAGE基因甲基化的因素4.1.1DNA甲基轉移酶的作用DNA甲基轉移酶（DNMTs）在NRAGE基因甲基化過程中扮演著至關重要的角色，主要包括Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b這三種類型，它們各自發(fā)揮著獨特的催化作用，共同調(diào)控著NRAGE基因的甲基化狀態(tài)。Dnmt1是維持性DNA甲基轉移酶，其主要功能是在DNA復制過程中，以親代DNA鏈上已有的甲基化位點為模板，將甲基基團準確地添加到新合成的子代DNA鏈的相應位點上，從而維持DNA甲基化模式的穩(wěn)定性和遺傳性。在乳腺癌細胞中，Dnmt1對NRAGE基因的甲基化維持作用尤為顯著。當乳腺癌細胞進行增殖和分裂時，Dnmt1會緊密結合到復制叉附近的DNA區(qū)域，識別并作用于NRAGE基因啟動子區(qū)域的CpG位點。通過將S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供的甲基基團轉移至新合成DNA鏈上的胞嘧啶殘基，使NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)得以延續(xù)，進而持續(xù)抑制NRAGE基因的表達。研究表明，在乳腺癌細胞系中，抑制Dnmt1的活性后，NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化水平顯著降低，同時NRAGE基因的表達水平明顯上調(diào)，這充分證實了Dnmt1在維持NRAGE基因甲基化狀態(tài)方面的關鍵作用。Dnmt3a和Dnmt3b則屬于從頭合成型DNA甲基轉移酶，它們能夠在未甲基化的DNA序列上催化形成新的甲基化位點，從而建立起全新的DNA甲基化模式。在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，Dnmt3a和Dnmt3b可被多種信號通路激活，進而對NRAGE基因啟動子區(qū)域進行從頭甲基化修飾。例如，在某些致癌信號的刺激下，細胞內(nèi)的相關信號通路會發(fā)生異常激活，促使Dnmt3a和Dnmt3b的表達上調(diào)，它們與NRAGE基因啟動子區(qū)域的結合能力增強，在原本未甲基化的CpG位點上添加甲基基團，導致NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化程度升高，基因表達被抑制。實驗數(shù)據(jù)顯示，在乳腺癌組織中，Dnmt3a和Dnmt3b的表達水平與NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化程度呈正相關，進一步說明了它們在NRAGE基因從頭甲基化過程中的重要作用。這三種DNA甲基轉移酶并非孤立地發(fā)揮作用，它們之間存在著復雜的相互作用和協(xié)同調(diào)控機制。在乳腺癌細胞中，Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b可能通過形成蛋白質(zhì)復合物，共同作用于NRAGE基因啟動子區(qū)域，實現(xiàn)對其甲基化狀態(tài)的精確調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，Dnmt3a和Dnmt3b可以與Dnmt1相互結合，在DNA復制和細胞分裂過程中，這種復合物能夠更有效地維持和建立NRAGE基因的甲基化模式。此外，它們還可能受到其他蛋白質(zhì)或分子的調(diào)節(jié)，共同參與NRAGE基因甲基化的動態(tài)調(diào)控過程。4.1.2其他潛在影響因素除了DNA甲基轉移酶外，NRAGE基因甲基化還受到多種其他潛在因素的影響，這些因素通過不同的機制參與調(diào)控NRAGE基因的甲基化狀態(tài)，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。環(huán)境因素對NRAGE基因甲基化的影響不容忽視。環(huán)境中的化學物質(zhì)、飲食、生活方式等都可能通過直接或間接的途徑影響DNA甲基化過程。例如，環(huán)境污染物中的重金屬，如鉛、鎘等，具有較強的毒性，它們可以干擾細胞內(nèi)的正常代謝過程，影響DNA甲基轉移酶的活性，進而導致NRAGE基因甲基化模式的改變。研究表明，長期暴露于高濃度鉛污染環(huán)境中的人群，其體內(nèi)細胞中NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化水平明顯升高，NRAGE基因表達受到抑制。飲食因素也與NRAGE基因甲基化密切相關。某些營養(yǎng)素，如葉酸、維生素B12和膽堿等，是DNA甲基化過程中所需的重要輔酶或甲基供體。當飲食中這些營養(yǎng)素缺乏時，可能會導致DNA甲基轉移酶活性降低，影響NRAGE基因的甲基化修飾。有研究指出，在葉酸缺乏的飲食條件下，乳腺癌細胞中NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化水平顯著升高，基因表達受到抑制，而補充葉酸后，甲基化水平有所下降，NRAGE基因表達得到恢復。此外，生活方式因素，如吸煙、酗酒等，也可能通過影響體內(nèi)的氧化應激水平和炎癥反應，間接影響NRAGE基因的甲基化狀態(tài)。吸煙產(chǎn)生的尼古丁、焦油等有害物質(zhì)以及酒精代謝產(chǎn)物乙醛等，都能夠引發(fā)細胞內(nèi)的氧化應激反應，導致DNA損傷和甲基化異常。在乳腺癌患者中，吸煙和酗酒者的NRAGE基因啟動子區(qū)域甲基化水平往往高于不吸煙者和不飲酒者。轉錄因子在NRAGE基因甲基化調(diào)控中也發(fā)揮著關鍵作用。轉錄因子是一類能夠與DNA特定序列結合，調(diào)控基因轉錄起始和轉錄速率的蛋白質(zhì)。某些轉錄因子可以直接與NRAGE基因啟動子區(qū)域結合，招募或抑制DNA甲基轉移酶的活性，從而影響NRAGE基因的甲基化狀態(tài)。例如，轉錄因子Sp1能夠與NRAGE基因啟動子區(qū)域的特定序列結合，抑制Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的活性，從而降低NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化水平，促進NRAGE基因的表達。相反，轉錄因子E2F1則可以與NRAGE基因啟動子區(qū)域結合，招募DNA甲基轉移酶，增強NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化程度，抑制NRAGE基因的表達。此外，轉錄因子還可以通過調(diào)控其他與DNA甲基化相關的基因表達，間接影響NRAGE基因的甲基化狀態(tài)。研究表明，轉錄因子c-Myc能夠上調(diào)Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的表達，進而增加NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化水平，抑制NRAGE基因的表達。4.2NRAGE基因甲基化對其表達調(diào)控的分子機制4.2.1甲基化對轉錄因子結合的影響轉錄因子在基因表達調(diào)控中起著核心作用，它們能夠特異性地識別并結合到基因啟動子區(qū)域的特定DNA序列上，招募RNA聚合酶等轉錄相關因子，啟動基因的轉錄過程。而NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化會對轉錄因子的結合產(chǎn)生顯著影響，從而調(diào)控NRAGE基因的表達。當NRAGE基因啟動子區(qū)域的CpG島發(fā)生甲基化時，甲基基團會添加到胞嘧啶的第五位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶。這種化學修飾會改變DNA的物理和化學性質(zhì)，使DNA分子的空間構象發(fā)生變化。從空間位阻角度來看，甲基基團的存在會在DNA雙螺旋結構的大溝中突出，占據(jù)一定的空間，從而直接干擾轉錄因子與DNA序列的結合。例如，某些轉錄因子，如AP-1（ActivatorProtein-1），其結合位點位于NRAGE基因啟動子區(qū)域的特定序列上。當該區(qū)域發(fā)生甲基化時，甲基基團會阻礙AP-1蛋白與DNA的結合，使其無法準確識別和結合到相應的位點，進而抑制了NRAGE基因的轉錄起始。研究表明，在乳腺癌細胞中，當NRAGE基因啟動子區(qū)域甲基化水平升高時，AP-1與該區(qū)域的結合能力明顯下降，NRAGE基因的表達也隨之降低。除了空間位阻的影響，甲基化還會改變DNA與轉錄因子之間的電荷相互作用。DNA分子本身帶有負電荷，轉錄因子通過與DNA分子之間的靜電相互作用以及特異性的氨基酸-堿基相互作用來實現(xiàn)結合。甲基化后的DNA，由于甲基基團的電中性特性，會改變DNA分子表面的電荷分布，影響轉錄因子與DNA之間的靜電吸引力，降低轉錄因子與DNA的結合親和力。以轉錄因子Sp1為例，它與NRAGE基因啟動子區(qū)域富含GC的序列具有較高的結合親和力。在正常情況下，Sp1能夠與該區(qū)域緊密結合，促進NRAGE基因的轉錄。然而，當啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化時，甲基化修飾改變了DNA的電荷性質(zhì)，使得Sp1與DNA的結合親和力顯著降低，從而抑制了NRAGE基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞系中，通過去甲基化處理降低NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化水平后，Sp1與該區(qū)域的結合能力增強，NRAGE基因的表達水平明顯上調(diào)。此外，甲基化還可能通過影響轉錄因子與其他輔助因子的相互作用，間接調(diào)控NRAGE基因的表達。轉錄因子在啟動基因轉錄時，往往需要與一系列輔助因子協(xié)同作用，形成轉錄起始復合物。甲基化可能會改變轉錄因子的構象，使其無法與輔助因子正常結合，或者影響輔助因子與DNA的結合，從而破壞轉錄起始復合物的形成，抑制基因轉錄。例如，轉錄因子E2F1在調(diào)控NRAGE基因表達時，需要與輔助因子DP-1（DimerizationPartner-1）結合形成異二聚體，然后與NRAGE基因啟動子區(qū)域的E2F結合位點結合。當啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化時，可能會干擾E2F1與DP-1的相互作用，或者阻礙E2F1-DP-1異二聚體與DNA的結合，進而抑制NRAGE基因的轉錄。在乳腺癌細胞中，檢測到E2F1與DP-1的結合能力以及它們與NRAGE基因啟動子區(qū)域的結合情況，隨著甲基化水平的升高而降低，NRAGE基因的表達也受到明顯抑制。4.2.2染色質(zhì)結構改變與基因表達調(diào)控染色質(zhì)是由DNA、組蛋白和非組蛋白等組成的復合物，其結構的動態(tài)變化對基因表達調(diào)控起著至關重要的作用。NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化會引發(fā)染色質(zhì)結構的改變，進而影響NRAGE基因的表達。在正常情況下，染色質(zhì)處于一種相對松散的狀態(tài)，稱為常染色質(zhì)，這種結構使得基因的啟動子區(qū)域能夠暴露出來，便于轉錄因子和RNA聚合酶等轉錄相關因子的結合，從而促進基因的轉錄。而當NRAGE基因啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化時，會招募一系列甲基化結合蛋白，如MeCP2（Methyl-CpG-bindingProtein2）。MeCP2具有一個高度保守的甲基化CpG結合結構域（MBD），能夠特異性地識別并結合到甲基化的CpG位點上。一旦MeCP2結合到NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化位點，它會進一步招募其他染色質(zhì)重塑復合物和組蛋白修飾酶，引發(fā)染色質(zhì)結構的重塑。例如，MeCP2可以招募組蛋白去乙酰化酶（HDACs），HDACs能夠催化組蛋白上的乙?；コ?，使組蛋白與DNA之間的相互作用增強，染色質(zhì)結構變得更加緊密，形成異染色質(zhì)。這種緊密的染色質(zhì)結構限制了轉錄因子和RNA聚合酶等轉錄相關因子與NRAGE基因啟動子區(qū)域的接觸，從而抑制了基因的轉錄。研究表明，在乳腺癌細胞中，當NRAGE基因啟動子區(qū)域高甲基化時，MeCP2的結合增加，HDACs的活性增強，組蛋白H3和H4的乙?；浇档?，染色質(zhì)結構變得緊密，NRAGE基因的表達受到顯著抑制。此外，DNA甲基化還可以通過影響染色質(zhì)重塑復合物的功能來改變?nèi)旧|(zhì)結構。染色質(zhì)重塑復合物是一類依賴ATP水解提供能量來改變?nèi)旧|(zhì)結構的蛋白質(zhì)復合物，它們能夠通過滑動、移除或重新定位核小體，調(diào)節(jié)染色質(zhì)的可及性。在NRAGE基因甲基化調(diào)控過程中，DNA甲基化可能會干擾染色質(zhì)重塑復合物與DNA的結合，或者影響其在染色質(zhì)上的移動和作用方式。例如，SWI/SNF復合物是一種重要的染色質(zhì)重塑復合物，它能夠通過與DNA和組蛋白相互作用，改變核小體的位置和結構，促進基因的轉錄。當NRAGE基因啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化時，甲基化修飾可能會阻礙SWI/SNF復合物與該區(qū)域的結合，使其無法有效地發(fā)揮染色質(zhì)重塑功能，導致染色質(zhì)結構維持在緊密狀態(tài)，NRAGE基因的表達受到抑制。在乳腺癌細胞系中，通過實驗干擾SWI/SNF復合物的功能，發(fā)現(xiàn)NRAGE基因啟動子區(qū)域的染色質(zhì)結構變得更加緊密，基因表達水平進一步降低。染色質(zhì)高級結構的改變也是NRAGE基因甲基化影響基因表達的重要機制之一。染色質(zhì)在細胞核內(nèi)并非隨機分布，而是形成了特定的三維空間結構，包括染色質(zhì)環(huán)、拓撲相關結構域（TADs）等。這些高級結構對于基因的表達調(diào)控具有重要作用，它們能夠將基因的啟動子與遠端的增強子等調(diào)控元件拉近，促進轉錄因子與調(diào)控元件之間的相互作用。NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化可能會破壞染色質(zhì)的高級結構，使基因的啟動子與增強子等調(diào)控元件之間的空間距離增加，阻礙了轉錄因子與調(diào)控元件的相互作用，從而抑制基因表達。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞中，NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化會導致其所在的染色質(zhì)環(huán)結構發(fā)生改變，與遠端增強子的相互作用減弱，NRAGE基因的表達受到抑制。五、實驗驗證NRAGE基因甲基化對乳腺癌細胞中NRAGE表達的影響5.1實驗材料與方法5.1.1實驗材料細胞系：選用高轉移乳腺癌細胞系MDA-MB-231和低轉移乳腺癌細胞系MCF-7，均購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。這兩種細胞系在乳腺癌研究中被廣泛應用，MDA-MB-231細胞具有高度的侵襲和轉移能力，而MCF-7細胞的轉移能力相對較低，它們在生物學特性和基因表達譜上存在明顯差異，有助于研究NRAGE基因甲基化與乳腺癌細胞轉移能力及NRAGE表達之間的關系。將細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液，待細胞生長至對數(shù)期時進行后續(xù)實驗。實驗試劑：5-氮-2’-脫氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR）購自Sigma公司，該試劑是一種常用的DNA甲基化抑制劑，能夠通過與DNA甲基轉移酶結合，抑制其活性，從而降低DNA的甲基化水平。在實驗中，用無菌DMSO將5-Aza-CdR配制成10mM的儲存液，-20℃保存，使用時用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。TRIzol試劑購自Invitrogen公司，用于提取細胞總RNA，其能夠有效裂解細胞，保持RNA的完整性，為后續(xù)的逆轉錄和PCR實驗提供高質(zhì)量的RNA模板。逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司，逆轉錄試劑盒可將RNA逆轉錄為cDNA，實時熒光定量PCR試劑盒則用于對cDNA進行擴增和定量分析，其具有高靈敏度和準確性，能夠精確檢測NRAGE基因的表達水平。兔抗人NRAGE多克隆抗體購自Abcam公司，該抗體能夠特異性識別NRAGE蛋白，用于免疫組化和Westernblot實驗，以檢測NRAGE蛋白的表達和定位。辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG二抗購自JacksonImmunoResearch公司，與一抗結合后，可通過HRP催化底物顯色，實現(xiàn)對目的蛋白的檢測。此外，實驗中還用到了DNA提取試劑盒、亞硫酸鹽轉化試劑盒、甲基化特異性PCR（MSP）引物等試劑，均購自知名生物試劑公司，確保實驗的可靠性和準確性。實驗儀器：主要實驗儀器包括PCR儀（AppliedBiosystems公司），用于DNA擴增反應，其具有精確的溫度控制和快速的升降溫速率，能夠保證PCR反應的高效進行；實時熒光定量PCR儀（Roche公司），用于對基因表達進行定量分析，可實時監(jiān)測PCR反應過程中的熒光信號變化，準確測定基因的表達水平；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于觀察和記錄PCR產(chǎn)物的電泳結果，能夠清晰地顯示DNA條帶的位置和亮度，方便對實驗結果進行分析；恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細胞培養(yǎng)提供適宜的溫度和氣體環(huán)境，確保細胞的正常生長和增殖；高速離心機（Eppendorf公司），用于細胞和核酸的分離，其高速旋轉能夠實現(xiàn)樣品的快速離心，提高實驗效率；酶標儀（ThermoFisherScientific公司），用于檢測蛋白質(zhì)的含量和活性，通過測定吸光度值來定量分析蛋白質(zhì)的表達水平。5.1.2實驗分組與處理將MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞分別分為實驗組和對照組，每組設置3個復孔。實驗組細胞用含有不同濃度5-Aza-CdR（0.5μM、1μM、2μM）的RPMI-1640培養(yǎng)基處理，對照組細胞則用不含5-Aza-CdR的正常RPMI-1640培養(yǎng)基處理。處理時間為72h，每隔24h更換一次培養(yǎng)基，以保證藥物的持續(xù)作用和細胞的正常生長。在處理過程中，密切觀察細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化。發(fā)現(xiàn)隨著5-Aza-CdR濃度的增加，MDA-MB-231細胞的生長速度逐漸減緩，細胞形態(tài)變得不規(guī)則，部分細胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學特征，如細胞皺縮、染色質(zhì)凝聚等；而MCF-7細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化相對較小。處理結束后，收集實驗組和對照組細胞，用于后續(xù)的檢測分析。用PBS輕輕洗滌細胞3次，去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)和殘留藥物。對于RNA提取，加入1mLTRIzol試劑裂解細胞，按照試劑盒說明書的步驟提取總RNA。對于蛋白質(zhì)提取，加入適量的細胞裂解液，在冰上裂解細胞30min，然后12000rpm離心15min，取上清液，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，將蛋白質(zhì)樣品儲存于-80℃冰箱備用。對于DNA提取，使用DNA提取試劑盒，按照說明書操作提取細胞基因組DNA，用于檢測NRAGE基因的甲基化狀態(tài)。5.2實驗結果與分析通過實時熒光定量PCR對實驗組和對照組細胞中NRAGE基因的mRNA表達水平進行檢測。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算NRAGE基因mRNA的相對表達量。結果顯示，在對照組MDA-MB-231細胞中，NRAGE基因mRNA的相對表達量為1.00±0.12；當用0.5μM5-Aza-CdR處理后，NRAGE基因mRNA的相對表達量升高至1.85±0.20，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；當5-Aza-CdR濃度增加到1μM時，NRAGE基因mRNA的相對表達量進一步升高至2.56±0.25，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）；當5-Aza-CdR濃度達到2μM時，NRAGE基因mRNA的相對表達量為3.21±0.30，與對照組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計學意義（P<0.001）。在對照組MCF-7細胞中，NRAGE基因mRNA的相對表達量為1.50±0.15，用不同濃度的5-Aza-CdR處理后，其表達量雖有一定變化，但與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這表明5-Aza-CdR處理能夠顯著上調(diào)MDA-MB-231細胞中NRAGE基因的mRNA表達水平，且呈濃度依賴性，而對MCF-7細胞中NRAGE基因的mRNA表達水平影響不明顯。運用Westernblot法檢測實驗組和對照組細胞中NRAGE蛋白的表達水平。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算NRAGE蛋白的相對表達量。結果顯示，在對照組MDA-MB-231細胞中，NRAGE蛋白的相對表達量為1.00±0.10；用0.5μM5-Aza-CdR處理后，NRAGE蛋白的相對表達量升高至1.68±0.15，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；當5-Aza-CdR濃度增加到1μM時，NRAGE蛋白的相對表達量升高至2.35±0.20，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）；當5-Aza-CdR濃度達到2μM時，NRAGE蛋白的相對表達量為3.02±0.25，與對照組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計學意義（P<0.001）。在對照組MCF-7細胞中，NRAGE蛋白的相對表達量為1.30±0.12，用不同濃度的5-Aza-CdR處理后，其表達量雖有一定變化，但與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這進一步證實了5-Aza-CdR處理能夠顯著上調(diào)MDA-MB-231細胞中NRAGE蛋白的表達水平，且呈濃度依賴性，而對MCF-7細胞中NRAGE蛋白的表達水平影響不明顯。利用甲基化特異性PCR（MSP）檢測實驗組和對照組細胞中NRAGE基因的甲基化狀態(tài)。結果顯示，在對照組MDA-MB-231細胞中，NRAGE基因啟動子區(qū)域呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，M引物擴增出明顯條帶，而U引物擴增條帶微弱；經(jīng)5-Aza-CdR處理后，隨著藥物濃度的增加，NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化程度逐漸降低，M引物擴增條帶逐漸減弱，U引物擴增條帶逐漸增強。在對照組MCF-7細胞中，NRAGE基因啟動子區(qū)域呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，U引物擴增出明顯條帶，M引物擴增條帶微弱，用5-Aza-CdR處理后，NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)無明顯變化。這表明5-Aza-CdR能夠有效降低MDA-MB-231細胞中NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化水平，而對MCF-7細胞中NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)影響較小。通過對實驗結果的綜合分析，明確了NRAGE基因甲基化對其在乳腺癌細胞中的表達具有顯著的調(diào)控作用。在高轉移乳腺癌細胞系MDA-MB-231中，NRAGE基因啟動子區(qū)域的高甲基化抑制了其表達，而5-Aza-CdR處理通過降低甲基化水平，能夠顯著上調(diào)NRAGE基因的mRNA和蛋白表達水平；在低轉移乳腺癌細胞系MCF-7中，NRAGE基因啟動子區(qū)域的低甲基化使其表達相對穩(wěn)定，5-Aza-CdR處理對其表達影響不明顯。這一結果進一步驗證了之前關于NRAGE基因甲基化與乳腺癌細胞中NRAGE表達關系的推測，為深入理解乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機制提供了重要的實驗依據(jù)。六、NRAGE基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制探討6.1NRAGE基因與乳腺癌細胞凋亡細胞凋亡是維持機體正常生理平衡的重要機制，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，細胞凋亡調(diào)控的異常起著關鍵作用。NRAGE基因作為一個潛在的抑癌基因，其表達水平的改變與乳腺癌細胞凋亡密切相關，通過調(diào)控凋亡相關蛋白，在乳腺癌細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。NRAGE基因主要通過與p53蛋白相互作用來調(diào)控乳腺癌細胞凋亡。p53蛋白作為一種重要的腫瘤抑制因子，在細胞凋亡、細胞周期調(diào)控、DNA損傷修復等過程中發(fā)揮著核心作用。正常情況下，p53蛋白的表達水平較低，且處于無活性狀態(tài)。當細胞受到DNA損傷、氧化應激等外界刺激時，p53蛋白會被激活，其表達水平迅速升高。激活后的p53蛋白能夠結合到特定的DNA序列上，調(diào)控一系列下游基因的表達，其中包括許多促凋亡基因，如Bax、PUMA等。Bax是一種促凋亡蛋白，它能夠在線粒體外膜上形成孔道，導致細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)中。細胞色素C釋放后，會與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結合，形成凋亡小體，進而激活半胱天冬酶（caspase）家族成員，引發(fā)細胞凋亡的級聯(lián)反應。PUMA則通過直接結合并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的功能，促進細胞凋亡。NRAGE基因能夠與p53蛋白相互作用，增強p53蛋白的穩(wěn)定性和轉錄活性。研究表明，NRAGE蛋白通過其MAGE結構域與p53蛋白的N端區(qū)域結合，這種結合能夠阻止p53蛋白被泛素化修飾，從而減少p53蛋白的降解，提高其在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性。同時，NRAGE蛋白還能夠促進p53蛋白與下游促凋亡基因啟動子區(qū)域的結合，增強p53蛋白的轉錄活性，上調(diào)Bax、PUMA等促凋亡基因的表達，促進乳腺癌細胞凋亡。在乳腺癌細胞系中，過表達NRAGE基因后，檢測到p53蛋白的穩(wěn)定性顯著增強，Bax和PUMA基因的mRNA和蛋白表達水平明顯升高，細胞凋亡率顯著增加。相反，當敲低NRAGE基因的表達時，p53蛋白的穩(wěn)定性下降，Bax和PUMA基因的表達受到抑制，細胞凋亡率明顯降低。NRAGE基因還可以通過直接與凋亡相關蛋白相互作用來調(diào)控乳腺癌細胞凋亡。NRAGE蛋白能夠與Apaf-1結合，促進凋亡小體的形成。在正常情況下，Apaf-1以單體形式存在于細胞質(zhì)中。當細胞受到凋亡刺激時，Apaf-1會發(fā)生構象變化，形成多聚體，并與細胞色素C、caspase-9等組裝成凋亡小體。NRAGE蛋白與Apaf-1的結合能夠促進Apaf-1的多聚化，加速凋亡小體的形成，從而激活caspase-9，引發(fā)caspase級聯(lián)反應，導致細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞中，NRAGE基因表達水平的降低會導致NRAGE蛋白與Apaf-1的結合減少，凋亡小體形成受阻，細胞凋亡率降低。而通過基因轉染等方法上調(diào)NRAGE基因的表達后，NRAGE蛋白與Apaf-1的結合增加，凋亡小體形成增多，細胞凋亡率顯著提高。NRAGE基因在乳腺癌細胞凋亡中起著重要的調(diào)控作用，通過與p53蛋白相互作用以及直接與凋亡相關蛋白相互作用，促進乳腺癌細胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這一作用機制的揭示，為深入理解乳腺癌的發(fā)病機制提供了新的視角，也為乳腺癌的治療提供了潛在的靶點。6.2NRAGE基因與乳腺癌細胞增殖細胞增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，而細胞周期的調(diào)控則是細胞增殖的核心機制。在乳腺癌細胞中，NRAGE基因通過對細胞周期相關蛋白的精確調(diào)控，在細胞增殖過程中發(fā)揮著至關重要的作用。細胞周期由G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（分裂期）組成，各個時期都受到一系列細胞周期相關蛋白的嚴格調(diào)控。細胞周期蛋白（Cyclin）和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）是細胞周期正調(diào)控的關鍵蛋白。不同的Cyclin在細胞周期的特定階段表達，它們與相應的CDK結合形成復合物，激活CDK的激酶活性，進而磷酸化下游底物，推動細胞周期的進程。例如，CyclinD與CDK4/6結合，在G1期發(fā)揮作用，促進細胞從G1期進入S期；CyclinE與CDK2結合，主要調(diào)控G1/S期的轉換；CyclinA與CDK2結合，參與S期和G2期的進程；CyclinB與CDK1結合，在G2/M期發(fā)揮關鍵作用，促進細胞進入分裂期。而細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKI）則是細胞周期的負調(diào)控因子，它們能夠與Cyclin-CDK復合物結合，抑制其激酶活性，從而阻止細胞周期的推進。其中，p21和p27是兩種重要的CKI。p21主要由p53基因誘導表達，它可以與CyclinD-CDK4/6、CyclinE-CDK2等復合物結合，抑制細胞從G1期進入S期；p27則可以抑制CyclinE-CDK2和CyclinA-CDK2復合物的活性，使細胞周期停滯在G1期。NRAGE基因能夠顯著影響乳腺癌細胞周期相關蛋白的表達和活性，從而抑制乳腺癌細胞的增殖。研究表明，在乳腺癌細胞中，NRAGE基因通過上調(diào)p21和p27的表達，抑制Cyclin-CDK復合物的活性，使細胞周期停滯在G1期。NRAGE蛋白可以與p53蛋白相互作用，增強p53蛋白的穩(wěn)定性和轉錄活性，進而促進p21基因的表達。同時，NRAGE蛋白還可以通過與其他轉錄因子相互作用，直接調(diào)控p27基因的表達。在乳腺癌細胞系中，過表達NRAGE基因后，檢測到p21和p27的mRNA和蛋白表達水平明顯升高，CyclinD-CDK4/6、CyclinE-CDK2等復合物的活性顯著降低，細胞周期停滯在G1期，細胞增殖能力明顯下降。相反，當敲低NRAGE基因的表達時，p21和p27的表達受到抑制，Cyclin-CDK復合物的活性增強，細胞周期進程加快，乳腺癌細胞的增殖能力顯著增強。NRAGE基因還可以通過影響其他細胞周期相關蛋白的表達和功能，間接調(diào)控乳腺癌細胞的增殖。例如，NRAGE基因可以抑制E2F1的表達和活性。E2F1是一種重要的轉錄因子，它在細胞周期調(diào)控中起著關鍵作用，能夠促進細胞從G1期進入S期。NRAGE蛋白可以與E2F1結合，抑制其與DNA的結合能力，從而抑制E2F1下游基因的表達，使細胞周期停滯在G1期。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞中，NRAGE基因表達水平的降低會導致E2F1的表達和活性升高，細胞周期進程加快，細胞增殖能力增強。而通過基因轉染等方法上調(diào)NRAGE基因的表達后，E2F1的表達和活性受到抑制，細胞周期停滯在G1期，細胞增殖能力明顯下降。NRAGE基因在乳腺癌細胞增殖過程中起著重要的抑制作用，通過調(diào)控細胞周期相關蛋白的表達和活性，使細胞周期停滯在G1期，從而抑制乳腺癌細胞的增殖。這一作用機制的揭示，為深入理解乳腺癌的發(fā)病機制提供了新的視角，也為乳腺癌的治療提供了潛在的靶點。6.3NRAGE基因與乳腺癌細胞遷移和侵襲腫瘤的轉移是導致乳腺癌患者預后不良的主要原因，而細胞遷移和侵襲能力的增強是腫瘤轉移的關鍵步驟。在乳腺癌中，NRAGE基因通過對上皮-間質(zhì)轉化（EMT）相關蛋白的調(diào)控，在乳腺癌細胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮著重要作用。上皮-間質(zhì)轉化是一個復雜的生物學過程，在這個過程中，上皮細胞逐漸失去其上皮細胞的特性，如細胞極性和細胞間緊密連接，同時獲得間質(zhì)細胞的特性，如高遷移能力和侵襲能力。這一過程涉及多種分子變化，其中上皮標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的下調(diào)和間質(zhì)標志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）的上調(diào)是EMT的典型特征。E-鈣黏蛋白是一種跨膜糖蛋白，主要表達于上皮細胞表面，它通過介導細胞間的黏附作用，維持上皮細胞的形態(tài)和組織結構，抑制細胞的遷移和侵襲。當E-鈣黏蛋白表達下調(diào)時，細胞間的黏附力減弱，細胞更容易從原發(fā)腫瘤部位脫離，進而發(fā)生遷移和侵襲。N-鈣黏蛋白和波形蛋白則主要表達于間質(zhì)細胞，它們的上調(diào)能夠增強細胞的運動能力和侵襲能力。N-鈣黏蛋白可以促進細胞與細胞外基質(zhì)的黏附，為細胞的遷移提供支撐；波形蛋白則參與細胞骨架的構建，調(diào)節(jié)細胞的形態(tài)和運動。NRAGE基因能夠通過調(diào)控EMT相關蛋白的表達，抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲。研究表明，在乳腺癌細胞中，NRAGE基因可以上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達，同時下調(diào)N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達。在乳腺癌細胞系中，過表達NRAGE基因后，檢測到E-鈣黏蛋白的mRNA和蛋白表達水平明顯升高，而N-鈣黏蛋白和波形蛋白的mRNA和蛋白表達水平顯著降低。進一步的細胞功能實驗顯示，過表達NRAGE基因的乳腺癌細胞，其遷移和侵襲能力明顯下降。在Transwell遷移實驗中，過表達NRAGE基因的乳腺癌細胞穿過小室膜的細胞數(shù)量明顯少于對照組細胞；在Matrigel侵襲實驗中，過表達NRAGE基因的乳腺癌細胞穿過Matrigel基質(zhì)膠的細胞數(shù)量也顯著減少。相反，當敲低NRAGE基因的表達時，E-鈣黏蛋白的表達受到抑制，N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達上調(diào)，乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力顯著增強。NRAGE基因對EMT相關蛋白的調(diào)控是通過多種信號通路實現(xiàn)的。其中，TGF-β信號通路在NRAGE基因調(diào)控EMT過程中起著關鍵作用。TGF-β是一種多功能細胞因子，它可以激活下游的Smad信號通路，促進EMT相關轉錄因子的表達，如Snail、Slug、Twist等。這些轉錄因子能夠結合到E-鈣黏蛋白基因啟動子區(qū)域的特定序列上，抑制E-鈣黏蛋白的轉錄，同時上調(diào)N-鈣黏蛋白和波形蛋白等間質(zhì)標志物的表達，從而促進EMT的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，NRAGE基因可以抑制TGF-β信號通路的激活。在乳腺癌細胞中，NRAGE蛋白可以與TGF-β受體結合，阻止TGF-β配體與受體的結合，從而抑制TGF-β信號通路的傳導。此外，NRAGE基因還可以通過調(diào)節(jié)其他信號通路，如PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路等，間接影響EMT相關蛋白的表達，進而調(diào)控乳腺癌細胞的遷移和侵襲。PI3K/Akt信號通路的激活可以促進EMT的發(fā)生，而NRAGE基因可以抑制PI3K/Akt信號通路的活性，從而抑制EMT過程。在乳腺癌細胞系中，過表達NRAGE基因后，檢測到PI3K/Akt信號通路的關鍵蛋白Akt的磷酸化水平明顯降低，EMT相關蛋白的表達也發(fā)生相應改變，細胞的遷移和侵襲能力受到抑制。NRAGE基因在乳腺癌細胞遷移和侵襲過程中起著重要的抑制作用，通過調(diào)控EMT相關蛋白的表達，抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。這一作用機制的揭示，為深入理解乳腺癌的轉移機制提供了新的視角，也為乳腺癌的治療提供了潛在的靶點。七、基因甲基化作為乳腺癌治療靶點的應用前景7.1目前甲基化治療的研究現(xiàn)狀在腫瘤治療領域，DNA甲基化已成為極具潛力的治療靶點，針對甲基化的治療研究取得了顯著進展，為乳腺癌等惡性腫瘤的治療帶來了新的希望。去甲基化藥物是目前甲基化治療研究的核心內(nèi)容之一。5-氮-2’-脫氧胞苷（5-Aza-CdR，地西他濱）和5-氮胞苷（5-Aza-C）是臨床研究中應用最為廣泛的去甲基化藥物。它們的作用機制主要是通過與DNA甲基轉移酶（DNMTs）緊密結合，形成共價復合物，從而不可逆地抑制DNMTs的活性。當DNMTs活性被抑制后，在DNA復制過程中，新合成的DNA鏈無法正常添加甲基基團，導致DNA甲基化水平逐漸降低。這種去甲基化作用能夠使因甲基化而沉默的基因重新表達，恢復其正常功能。例如，在乳腺癌細胞中，一些抑癌基因如BRCA1、RASSF1A等，常因啟動子區(qū)域高甲基化而沉默，5-Aza-CdR處理后，這些基因的甲基化水平降低，重新表達，發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖和轉移的作用。在臨床應用方面，去甲基化藥物在血液系統(tǒng)腫瘤的治療中已取得了一定的成效。多項臨床試驗表明，5-Aza-CdR用于治療骨髓增生異常綜合征（MDS），能夠顯著改善患者的病情，提高患者的生存率。然而，在乳腺癌治療中的應用仍處于探索階段。雖然基礎研究顯示5-Aza-CdR對乳腺癌細胞具有抑制生長、誘導凋亡等作用，但在臨床試驗中，由于乳腺癌的異質(zhì)性以及藥物的毒副作用等問題，其治療效果尚未達到理想狀態(tài)。一些研究發(fā)現(xiàn)，去甲基化藥物在乳腺癌治療中，可能會引發(fā)骨髓抑制、惡心、嘔吐等不良反應，限制了其臨床應用。聯(lián)合治療策略是當前甲基化治療研究的另一個重要方向。鑒于單一使用去甲基化藥物存在的局限性，將去甲基化藥物與其他治療方法聯(lián)合應用，已成為提高治療效果的重要途徑。在乳腺癌治療中，去甲基化藥物與化療藥物的聯(lián)合應用是研究熱點之一。去甲基化藥物能夠使耐藥相關基因去甲基化，恢復乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性。有研究報道，將5-Aza-CdR與多西他賽聯(lián)合應用于乳腺癌細胞系和動物模型，結果顯示，聯(lián)合治療組的腫瘤抑制效果明顯優(yōu)于單獨使用多西他賽組，乳腺癌細胞的增殖受到顯著抑制，凋亡率明顯增加。去甲基化藥物與靶向治療藥物、免疫治療藥物的聯(lián)合應用也在積極探索中。與靶向治療藥物聯(lián)合，可通過不同的作用機制協(xié)同抑制腫瘤細胞的生長；與免疫治療藥物聯(lián)合，能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強機體的抗腫瘤免疫反應。除了去甲基化藥物，其他針對DNA甲基化調(diào)控的治療方法也在不斷研究中。例如，針對DNA甲基轉移酶的小分子抑制劑的研發(fā)，旨在更特異性地抑制DNMTs的活性，減少對正常細胞的影響。還有基于RNA干擾（RNAi）技術的研究，通過設計針對DNMTs的siRNA，降低其表達水平，實現(xiàn)對DNA甲基化的調(diào)控。雖然這些方法在實驗室研究中取得了一些進展，但距離臨床應用仍有一定距離，需要進一步解決藥物遞送、安全性等問題。7.2利用NRAGE基因甲基化作為新型治療靶點的可行性分析以NRAGE基因甲基化為靶點開發(fā)新型治療策略，具有一定的可行性和廣闊的前景。從理論層面來看，NRAGE基因作為潛在的抑癌基因，在乳腺癌細胞中因啟動子區(qū)域高甲基化而表達沉默，若能有效逆轉這種甲基化狀態(tài)，恢復NRAGE基因的正常表達，將使其發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡和抑制轉移的功能，為乳腺癌的治療提供新的途徑。在實際操作中，去甲基化藥物的應用為以NRAGE基因甲基化為靶點的治療策略提供了重要的技術支持。如5-Aza-CdR等去甲基化藥物，能夠抑制DNA甲基轉移酶的活性，降低DNA甲基化水平，使沉默的基因重新表達。在本研究中，使用5-Aza-CdR處理高轉移乳腺癌細胞系MDA-MB-231后，NRAGE基因啟動子區(qū)域的甲基化程度顯著降低，NRAGE基因的mRNA和蛋白表達水平明顯上調(diào)，細胞的增殖、遷移和侵襲能力受到抑制，這充分證明了通過去甲基化藥物干預NRAGE基因甲基化狀態(tài)，從而調(diào)控其表達，進而抑制乳腺癌細胞惡性行為的可行性。將NRAGE基因甲基化與其他治療方法聯(lián)合應用，也展現(xiàn)出良好的治療潛力。與化療藥物聯(lián)合，去甲基化藥物可以通過恢復NRAGE基因的表達，增強乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性，提高化療效果。與免疫治療聯(lián)合，恢復表達的NRAGE基因可能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強機體的抗腫瘤免疫反應。