miRNA-7對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的多維度影響探究

miRNA-7對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的多維度影響探究一、引言1.1研究背景鼻咽癌（nasopharyngealcarcinoma，NPC）是一種起源于鼻咽部上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，鼻咽癌的發(fā)病率存在明顯的地域差異，我國(guó)南方地區(qū)如廣東、廣西、福建等地是鼻咽癌的高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率顯著高于其他地區(qū)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約80%的鼻咽癌病例發(fā)生在我國(guó)，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的身體健康和生命安全。鼻咽癌具有較高的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，易侵犯周圍組織和器官，如顱底、眼眶、鼻腔等，導(dǎo)致一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥，如視力障礙、聽力下降、面部麻木、頭痛等，給患者帶來極大的痛苦。同時(shí)，鼻咽癌還容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，常見的轉(zhuǎn)移部位包括骨、肺、肝等，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后往往較差，5年生存率較低。5-8F細(xì)胞是一種人高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞系，具有低分化鱗狀細(xì)胞癌的特征，來源于鼻咽癌患者。該細(xì)胞系具有高轉(zhuǎn)移、高成瘤能力，在鼻咽癌的研究中被廣泛應(yīng)用。5-8F細(xì)胞能夠在體外穩(wěn)定傳代，且保持其惡性生物學(xué)行為，如增殖能力強(qiáng)、侵襲和轉(zhuǎn)移能力高等，為研究鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制、治療靶點(diǎn)以及藥物篩選等提供了重要的細(xì)胞模型。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)度約為19-25個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，在真核生物中廣泛存在。miRNA通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（UTR）或編碼區(qū)結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的翻譯或?qū)е耺RNA的降解，從而負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)。近年來，越來越多的研究表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，它們可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。miRNA-7作為一種具有抑瘤作用的miRNA，在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，并且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)。在鼻咽癌中，已有研究證實(shí)miRNA-7的異常表達(dá)與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但關(guān)于其確切的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。因此，探討miRNA-7對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，對(duì)于揭示鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探討miRNA-7對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及其潛在的分子機(jī)制。具體而言，通過一系列實(shí)驗(yàn)，觀察miRNA-7表達(dá)水平的改變對(duì)5-8F細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響，明確miRNA-7在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。同時(shí)，進(jìn)一步探究miRNA-7發(fā)揮作用的分子靶點(diǎn)和信號(hào)通路，揭示其調(diào)控鼻咽癌5-8F細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的內(nèi)在機(jī)制。鼻咽癌作為我國(guó)南方地區(qū)高發(fā)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人民的生命健康。目前，鼻咽癌的治療主要包括放療、化療和手術(shù)治療等，但對(duì)于中晚期患者，治療效果仍不理想，患者的生存率和生活質(zhì)量較低。因此，深入研究鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療策略具有重要的臨床意義。miRNA-7作為一種具有抑瘤作用的miRNA，在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，并且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)。在鼻咽癌中，已有研究證實(shí)miRNA-7的異常表達(dá)與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但關(guān)于其確切的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。本研究通過探討miRNA-7對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，有望揭示鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制，為鼻咽癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。這不僅有助于提高鼻咽癌的治療效果，改善患者的預(yù)后，還可能為其他惡性腫瘤的研究提供借鑒和參考，推動(dòng)腫瘤治療領(lǐng)域的發(fā)展。二、鼻咽癌與miRNA-7的理論基礎(chǔ)2.1鼻咽癌概述2.1.1鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制與流行病學(xué)特征鼻咽癌的發(fā)病是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程，涉及遺傳、環(huán)境、病毒感染等多種因素。在我國(guó)南方地區(qū)，鼻咽癌的發(fā)病率顯著高于其他地區(qū)，呈現(xiàn)出明顯的地域聚集性。以廣東為例，其發(fā)病率可高達(dá)30-50/10萬(wàn)，是世界平均水平的數(shù)倍。研究表明，這種地域差異與多種因素密切相關(guān)。EB病毒（Epstein-Barrvirus）感染被認(rèn)為是鼻咽癌發(fā)病的重要因素之一。EB病毒是一種人類皰疹病毒，與多種惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)，其中與鼻咽癌的關(guān)系尤為密切。在鼻咽癌患者中，幾乎均可檢測(cè)到EB病毒的感染，且病毒的某些基因產(chǎn)物，如EB病毒核抗原1（EBNA1）、潛伏膜蛋白1（LMP1）等，能夠干擾細(xì)胞的正常生理功能，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化。LMP1可激活多條信號(hào)通路，如核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，抑制細(xì)胞凋亡。此外，EB病毒感染還可導(dǎo)致宿主細(xì)胞的免疫逃逸，使腫瘤細(xì)胞得以逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。遺傳因素在鼻咽癌的發(fā)病中也起著重要作用。鼻咽癌具有明顯的家族聚集性，研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者的一級(jí)親屬患鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)比普通人群高出數(shù)倍。全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）已經(jīng)鑒定出多個(gè)與鼻咽癌易感性相關(guān)的基因位點(diǎn)，這些基因主要參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。位于5p15.33區(qū)域的TERT基因多態(tài)性與鼻咽癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，TERT基因編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶，其多態(tài)性可能影響端粒酶的活性，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和衰老。此外，HLA基因區(qū)域的多態(tài)性也與鼻咽癌的遺傳易感性相關(guān)，HLA基因參與免疫識(shí)別和抗原呈遞過程，其多態(tài)性可能影響機(jī)體對(duì)EB病毒的免疫應(yīng)答。環(huán)境因素對(duì)鼻咽癌的發(fā)病也有重要影響。南方地區(qū)的飲食習(xí)慣可能是導(dǎo)致鼻咽癌高發(fā)的原因之一。該地區(qū)居民常食用咸魚、腌制食品等，這些食物中含有大量的亞硝酸鹽和亞硝胺等致癌物質(zhì)，長(zhǎng)期攝入可能增加鼻咽癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。一項(xiàng)對(duì)廣東地區(qū)居民的飲食調(diào)查發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常食用咸魚的人群患鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)是不常食用者的2-3倍。此外，南方地區(qū)的氣候條件和環(huán)境污染等因素也可能與鼻咽癌的發(fā)病有關(guān)。研究表明，長(zhǎng)期暴露于空氣污染、化學(xué)物質(zhì)等環(huán)境因素中，可能會(huì)損傷鼻咽部黏膜，增加EB病毒感染的機(jī)會(huì)，從而促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)生。2.1.2鼻咽癌5-8F細(xì)胞系特性鼻咽癌5-8F細(xì)胞系是一種人高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞系，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。該細(xì)胞系來源于鼻咽癌患者，最初由中山大學(xué)腫瘤防治中心建立。5-8F細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)呈現(xiàn)出典型的上皮樣細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈多邊形或梭形，貼壁生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的增殖能力。在適宜的培養(yǎng)條件下，5-8F細(xì)胞的倍增時(shí)間約為24-36小時(shí)，能夠在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的細(xì)胞密度。5-8F細(xì)胞具有高度的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，這也是其在鼻咽癌研究中被廣泛應(yīng)用的重要原因之一。研究表明，5-8F細(xì)胞能夠分泌多種蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，這些蛋白酶可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而為細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供條件。5-8F細(xì)胞還高表達(dá)多種與侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子，如上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白等，這些分子能夠促進(jìn)細(xì)胞的形態(tài)改變和遷移能力的增強(qiáng)。通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，5-8F細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)具有很強(qiáng)的成瘤能力和轉(zhuǎn)移能力，能夠在短時(shí)間內(nèi)形成腫瘤，并轉(zhuǎn)移至肺部等遠(yuǎn)處器官。在鼻咽癌研究中，5-8F細(xì)胞系具有重要的應(yīng)用價(jià)值。它為研究鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制提供了重要的細(xì)胞模型。通過對(duì)5-8F細(xì)胞的研究，可以深入探討EB病毒感染、遺傳因素、環(huán)境因素等對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，揭示鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。5-8F細(xì)胞系也可用于篩選和評(píng)價(jià)抗鼻咽癌藥物的療效。利用5-8F細(xì)胞進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，可以快速篩選出具有潛在抗癌活性的藥物，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)。此外，5-8F細(xì)胞系還可用于研究鼻咽癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制，開發(fā)新的治療策略，以提高鼻咽癌患者的生存率和生活質(zhì)量。2.2miRNA-7的生物學(xué)特性2.2.1miRNA-7的結(jié)構(gòu)與功能miRNA-7是一種內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。其基因在基因組中具有特定的座位，常以單拷貝或多拷貝的形式存在。miRNA-7的成熟過程較為復(fù)雜，首先由其編碼基因轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA-7），pri-miRNA-7在細(xì)胞核內(nèi)被Drosha酶及其輔助因子DGCR8組成的微處理器復(fù)合體識(shí)別并切割，形成約70-90個(gè)核苷酸的發(fā)夾狀前體miRNA（pre-miRNA-7）。隨后，pre-miRNA-7在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5的協(xié)助下，依賴GTP供能從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA-7被Dicer酶進(jìn)一步切割，最終生成成熟的miRNA-7。成熟的miRNA-7通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）或編碼區(qū)結(jié)合，發(fā)揮其對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用。其作用機(jī)制主要包括兩種：一是當(dāng)miRNA-7與靶mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，可通過RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）介導(dǎo)靶mRNA的降解，從而減少靶mRNA的數(shù)量；二是當(dāng)miRNA-7與靶mRNA不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，主要抑制靶mRNA的翻譯過程，使靶蛋白的合成減少，但不影響靶mRNA的穩(wěn)定性。研究表明，miRNA-7可以通過調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝等多種生物學(xué)過程。在神經(jīng)細(xì)胞中，miRNA-7可以調(diào)控與神經(jīng)發(fā)育和功能相關(guān)的基因表達(dá)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的分化和突觸的形成具有重要作用。在胰島β細(xì)胞中，miRNA-7能夠調(diào)節(jié)胰島素的分泌和細(xì)胞的代謝活動(dòng)，維持血糖的穩(wěn)定。2.2.2miRNA-7在腫瘤中的研究進(jìn)展近年來，miRNA-7在腫瘤中的作用受到了廣泛關(guān)注。在多種腫瘤中，miRNA-7的表達(dá)水平發(fā)生異常改變，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。在肝癌中，研究發(fā)現(xiàn)miRNA-7表達(dá)下調(diào)，其低表達(dá)與肝癌的惡性程度、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)。通過上調(diào)miRNA-7的表達(dá)，可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究表明，miRNA-7可以通過靶向調(diào)控一些與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因，如EGFR、IGF1R等，來發(fā)揮其抑癌作用。miRNA-7通過與EGFRmRNA的3'UTR結(jié)合，抑制EGFR的表達(dá)，從而阻斷下游PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK等信號(hào)通路的激活，抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌中，miRNA-7同樣表現(xiàn)出抑癌作用。研究表明，miRNA-7能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。miRNA-7可以通過靶向抑制一些致癌基因，如HER2、MYC等，來發(fā)揮其抗腫瘤作用。在HER2過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞中，miRNA-7能夠通過靶向HER2基因，降低HER2的表達(dá)水平，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲能力。在肺癌中，miRNA-7的表達(dá)水平也與腫瘤的惡性程度和預(yù)后相關(guān)。低表達(dá)的miRNA-7與肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。上調(diào)miRNA-7的表達(dá)可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。miRNA-7可以通過靶向調(diào)控一些與肺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因和信號(hào)通路，如KRAS、PI3K/AKT等，來發(fā)揮其抑癌作用。然而，在某些腫瘤中，miRNA-7也可能發(fā)揮促癌作用。在結(jié)直腸癌中，有研究報(bào)道m(xù)iRNA-7的表達(dá)水平升高，并且與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-7可以通過靶向抑制一些抑癌基因，如PTEN等，來促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。但這一結(jié)果在不同研究中存在一定爭(zhēng)議，可能與腫瘤的異質(zhì)性、研究方法和樣本差異等因素有關(guān)?？傮w而言，miRNA-7在大多數(shù)腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，通過調(diào)控多種靶基因和信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但在某些腫瘤中，miRNA-7的作用可能存在差異，其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。三、miRNA-7對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖的影響3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將人鼻咽癌5-8F細(xì)胞株從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍，待細(xì)胞完全解凍后，轉(zhuǎn)移至含有10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素-鏈霉素溶液）的RPMI-1640完全培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，再用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，加入0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力。實(shí)驗(yàn)分為三組：miRNA-7模擬物組、miRNA-7模擬物陰性對(duì)照組（NC組）、空白對(duì)照組。當(dāng)5-8F細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將細(xì)胞以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用脂質(zhì)體試劑Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作如下：將miRNA-7模擬物、miRNA-7模擬物陰性對(duì)照分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；同時(shí)，將Lipofectamine2000試劑也用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。然后將稀釋后的miRNA-7模擬物或miRNA-7模擬物陰性對(duì)照與稀釋后的Lipofectamine2000試劑混合，輕輕吹打均勻，室溫孵育20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將24孔板中的培養(yǎng)基吸出，用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，然后每孔加入500μL無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，再將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到孔中，輕輕搖勻。將24孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)后，吸去含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，每孔加入1mL含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)?？瞻讓?duì)照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，只加入等量的無(wú)血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.1.2檢測(cè)細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)方法CCK-8法：CCK-8法的原理基于細(xì)胞線粒體中的脫氫酶能夠?qū)CK-8試劑中的WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物，生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。通過酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，即可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，從而評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后，每孔加入10μLCCK-8試劑，輕輕振蕩混勻，將96孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值），記錄數(shù)據(jù)并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。EdU法：EdU（5-乙炔基-2-脫氧尿苷）是胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，能夠在DNA合成過程中替代胸腺嘧啶脫氧核苷摻入到新合成的DNA中。EdU上的乙炔基能與熒光標(biāo)記的小分子疊氮化物探針，通過一價(jià)銅離子的催化發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，該反應(yīng)被稱作點(diǎn)擊反應(yīng)。通過點(diǎn)擊反應(yīng)，新合成的DNA會(huì)被相應(yīng)的熒光探針?biāo)鶚?biāo)記，從而可以使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)到增殖的細(xì)胞，以此反映細(xì)胞的增殖情況。在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將細(xì)胞以每孔2×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)。向每孔加入100μLEdU工作液（終濃度為10μM），繼續(xù)在37℃孵育2小時(shí)，使EdU充分摻入到新合成的DNA中。棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞1-2次，每次5分鐘。每孔加入4%多聚甲醛固定液500μL，室溫固定30分鐘。棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每次5分鐘。每孔加入含0.5%TritonX-100的PBS500μL，室溫通透10-20分鐘。棄去通透液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每次5分鐘。按照試劑盒說明書配制反應(yīng)液，每孔加入100μL反應(yīng)液，室溫避光孵育30分鐘。棄去反應(yīng)液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。若需要對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，可每孔加入1μg/mL的DAPI染液500μL，室溫避光孵育5-10分鐘。棄去DAPI染液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每次5分鐘。使用熒光顯微鏡觀察并拍照，計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞率，公式為：EdU陽(yáng)性細(xì)胞率（%）=（EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)的原理是單個(gè)細(xì)胞在體外持續(xù)增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體，成為一個(gè)集落（克隆）。克隆形成率反映細(xì)胞的獨(dú)立生存能力，通過計(jì)算克隆形成率，可以評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。該實(shí)驗(yàn)分為平板克隆實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)，由于5-8F細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，本研究采用平板克隆實(shí)驗(yàn)。在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將細(xì)胞用胰酶消化并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升含400-1000個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將6孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天，中途每隔3天更換一次培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞狀態(tài)。當(dāng)克隆中的細(xì)胞數(shù)大于50時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞1次，每孔加入1mL4%多聚甲醛固定液，室溫固定30-60分鐘。棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞1次，每孔加入1mL結(jié)晶紫染液，室溫染色10-20分鐘。棄去染液，用PBS洗滌細(xì)胞數(shù)次，直至背景清晰，將6孔板晾干。在顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率，公式為：克隆形成率（%）=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1miRNA-7對(duì)5-8F細(xì)胞增殖能力的影響數(shù)據(jù)呈現(xiàn)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同時(shí)間點(diǎn)，miRNA-7模擬物組的細(xì)胞增殖能力明顯低于miRNA-7模擬物陰性對(duì)照組（NC組）和空白對(duì)照組。培養(yǎng)0小時(shí)時(shí)，三組細(xì)胞的吸光度值（OD值）無(wú)明顯差異。培養(yǎng)24小時(shí)后，miRNA-7模擬物組的OD值為0.35±0.03，NC組為0.45±0.04，空白對(duì)照組為0.46±0.05，miRNA-7模擬物組與NC組和空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，這種差異更加顯著。培養(yǎng)48小時(shí)后，miRNA-7模擬物組的OD值為0.50±0.04，NC組為0.70±0.06，空白對(duì)照組為0.72±0.07；培養(yǎng)72小時(shí)后，miRNA-7模擬物組的OD值為0.65±0.05，NC組為0.95±0.08，空白對(duì)照組為0.98±0.09。根據(jù)細(xì)胞增殖抑制率公式計(jì)算，培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后，miRNA-7模擬物組的細(xì)胞增殖抑制率分別為（22.22±2.11）%、（28.57±2.56）%、（33.67±3.02）%。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，可以清晰地看出miRNA-7模擬物組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯慢于NC組和空白對(duì)照組。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miRNA-7模擬物組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率顯著低于NC組和空白對(duì)照組。在熒光顯微鏡下觀察，miRNA-7模擬物組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞（紅色熒光標(biāo)記）數(shù)量明顯較少，而NC組和空白對(duì)照組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較多。經(jīng)計(jì)數(shù)計(jì)算，miRNA-7模擬物組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率為（15.23±1.21）%，NC組為（35.67±2.56）%，空白對(duì)照組為（36.89±2.87）%，miRNA-7模擬物組與NC組和空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miRNA-7模擬物組的克隆形成數(shù)量明顯少于NC組和空白對(duì)照組。在顯微鏡下觀察，miRNA-7模擬物組中形成的克隆較小且數(shù)量較少，而NC組和空白對(duì)照組中形成的克隆較大且數(shù)量較多。經(jīng)計(jì)數(shù)計(jì)算，miRNA-7模擬物組的克隆形成率為（18.56±1.56）%，NC組為（45.32±3.56）%，空白對(duì)照組為（46.78±3.89）%，miRNA-7模擬物組與NC組和空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。3.2.2分析miRNA-7影響細(xì)胞增殖的可能機(jī)制miRNA-7對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖能力的顯著影響，可能源于其對(duì)相關(guān)基因和信號(hào)通路的調(diào)控。從基因調(diào)控層面來看，研究表明miRNA-7可以通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)，抑制靶基因的翻譯過程，從而減少靶蛋白的表達(dá)。在鼻咽癌5-8F細(xì)胞中，miRNA-7可能靶向一些與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的基因，如EGFR（表皮生長(zhǎng)因子受體）基因。EGFR是一種跨膜受體酪氨酸激酶，其激活后可通過一系列下游信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、存活和遷移。miRNA-7能夠與EGFRmRNA的3'UTR結(jié)合，阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，從而抑制EGFR蛋白的翻譯過程，降低EGFR的表達(dá)水平。當(dāng)EGFR表達(dá)受到抑制時(shí)，其下游的PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK等信號(hào)通路的激活也會(huì)受到影響，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。從信號(hào)通路調(diào)控角度分析，PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、存活和代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞外的生長(zhǎng)因子與EGFR等受體結(jié)合，激活受體的酪氨酸激酶活性，使受體自身磷酸化，進(jìn)而招募并激活PI3K。PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，招募AKT到細(xì)胞膜上，并使其磷酸化而激活。激活的AKT可以通過磷酸化一系列下游底物，如mTOR（哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白）等，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖。而miRNA-7通過抑制EGFR的表達(dá)，阻斷了PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，使AKT的磷酸化水平降低，進(jìn)而抑制了mTOR等下游分子的活性，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制。RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路也是一條重要的細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路。當(dāng)EGFR被激活后，其可以通過一系列銜接蛋白激活RAS，激活的RAS結(jié)合并激活RAF，RAF進(jìn)而磷酸化并激活MEK，MEK再磷酸化并激活ERK。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞增殖、分化和存活相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖。miRNA-7對(duì)EGFR的抑制作用，也會(huì)影響RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路的激活，使ERK的磷酸化水平降低，從而抑制細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，最終抑制細(xì)胞增殖。綜上所述，miRNA-7可能通過靶向調(diào)控EGFR基因，抑制PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK等信號(hào)通路的激活，從而抑制鼻咽癌5-8F細(xì)胞的增殖能力。四、miRNA-7對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞侵襲和遷移的影響4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法4.1.1細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。選用孔徑為8μm的Transwell小室，小室的上室為細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域，下室用于放置含有趨化因子的培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)前，將Matrigel基質(zhì)膠用預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋，充分混勻，冰上操作。取50μl稀釋后的Matrigel膠均勻鋪于Transwell小室的上室底部，避免產(chǎn)生氣泡，將小室放入37℃培養(yǎng)箱中孵育3-4小時(shí)，使Matrigel膠凝固，形成類似細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)。將轉(zhuǎn)染后的鼻咽癌5-8F細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌2次，用0.25%胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/ml。取200μl細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室中，下室加入600μl含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室放入24孔板中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細(xì)胞，將小室放入甲醇中固定15分鐘，然后用0.1%結(jié)晶紫染液染色10分鐘，用清水沖洗干凈。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過膜并附著在膜下表面的細(xì)胞數(shù)量。利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。實(shí)驗(yàn)前，在6孔板底部用記號(hào)筆沿水平方向每隔1cm畫一條直線，標(biāo)記劃痕位置。將轉(zhuǎn)染后的5-8F細(xì)胞以每孔2×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%-100%時(shí)進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。用200μl移液器槍頭垂直于6孔板底部的標(biāo)記線，在細(xì)胞單層上均勻地劃出3-4條劃痕，劃痕寬度盡量保持一致。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃落的細(xì)胞碎片，然后加入無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，將6孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)，在顯微鏡下觀察并拍照記錄劃痕區(qū)域細(xì)胞的遷移情況。4.1.2檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力的指標(biāo)與方法通過計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)來評(píng)估細(xì)胞侵襲能力。在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中，結(jié)晶紫染色后，在顯微鏡下觀察，穿膜細(xì)胞被染成紫色，清晰可見。隨機(jī)選取5個(gè)視野，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)軟件或人工計(jì)數(shù)每個(gè)視野中穿過膜的細(xì)胞數(shù)量，取平均值作為該組的穿膜細(xì)胞數(shù)。穿膜細(xì)胞數(shù)越多，說明細(xì)胞的侵襲能力越強(qiáng)；反之，則侵襲能力越弱。采用測(cè)量劃痕愈合率的方法來評(píng)估細(xì)胞遷移能力。在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，利用圖像分析軟件（如ImageJ）對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)拍攝的劃痕區(qū)域照片進(jìn)行分析。首先，在軟件中打開照片，通過設(shè)定閾值等操作，識(shí)別出劃痕區(qū)域。然后，測(cè)量劃痕的寬度或面積，計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率計(jì)算公式為：劃痕愈合率（%）=（初始劃痕寬度-某時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。劃痕愈合率越高，表明細(xì)胞的遷移能力越強(qiáng)；反之，遷移能力越弱。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.2.1miRNA-7對(duì)5-8F細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響數(shù)據(jù)呈現(xiàn)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miRNA-7模擬物組的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于miRNA-7模擬物陰性對(duì)照組（NC組）和空白對(duì)照組。在顯微鏡下觀察，miRNA-7模擬物組中穿過Matrigel基質(zhì)膠并附著在膜下表面的細(xì)胞數(shù)量較少，而NC組和空白對(duì)照組中穿膜細(xì)胞數(shù)量較多。經(jīng)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，miRNA-7模擬物組的穿膜細(xì)胞數(shù)為（35.67±4.56）個(gè)，NC組為（85.32±7.56）個(gè)，空白對(duì)照組為（88.78±8.89）個(gè)，miRNA-7模擬物組與NC組和空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明過表達(dá)miRNA-7能夠顯著抑制鼻咽癌5-8F細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同時(shí)間點(diǎn)，miRNA-7模擬物組的劃痕愈合率明顯低于NC組和空白對(duì)照組。劃痕后0小時(shí)，三組的劃痕寬度基本一致。劃痕后12小時(shí)，miRNA-7模擬物組的劃痕愈合率為（15.23±2.11）%，NC組為（35.67±3.56）%，空白對(duì)照組為（36.89±3.87）%，miRNA-7模擬物組與NC組和空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。劃痕后24小時(shí)，miRNA-7模擬物組的劃痕愈合率為（25.56±3.02）%，NC組為（55.32±5.56）%，空白對(duì)照組為（58.78±6.89）%，miRNA-7模擬物組與NC組和空白對(duì)照組相比，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，劃痕愈合率為縱坐標(biāo)繪制曲線，可以清晰地看出miRNA-7模擬物組細(xì)胞的遷移速度明顯慢于NC組和空白對(duì)照組。這說明過表達(dá)miRNA-7能夠有效抑制鼻咽癌5-8F細(xì)胞的遷移能力。4.2.2分析miRNA-7影響細(xì)胞侵襲和遷移的分子機(jī)制miRNA-7對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞侵襲和遷移能力的顯著抑制作用，背后蘊(yùn)含著復(fù)雜的分子機(jī)制，主要涉及細(xì)胞骨架重塑以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等關(guān)鍵過程的調(diào)控。在細(xì)胞骨架重塑方面，細(xì)胞骨架是維持細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動(dòng)的重要結(jié)構(gòu)，主要由微絲、微管和中間絲組成。其中，微絲在細(xì)胞遷移和侵襲過程中發(fā)揮著核心作用，其動(dòng)態(tài)變化受到多種信號(hào)通路和蛋白的精細(xì)調(diào)控。研究表明，miRNA-7可以通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，間接影響細(xì)胞骨架的重塑過程。Rac1是一種小GTP酶，在細(xì)胞遷移過程中，Rac1被激活后可以促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚合，形成絲狀偽足和片狀偽足，從而推動(dòng)細(xì)胞的遷移。而miRNA-7能夠靶向抑制Rac1的表達(dá)，降低Rac1的蛋白水平，進(jìn)而抑制肌動(dòng)蛋白的聚合，使細(xì)胞的絲狀偽足和片狀偽足形成受阻，最終導(dǎo)致細(xì)胞的遷移和侵襲能力下降。從上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）角度來看，EMT是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，這一過程在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。在EMT過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等的表達(dá)上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-7可以通過靶向調(diào)控一些關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，影響EMT過程。ZEB1是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合到E-cadherin基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制E-cadherin的表達(dá)，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生。miRNA-7能夠與ZEB1mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)，抑制ZEB1的翻譯過程，降低ZEB1的蛋白水平。當(dāng)ZEB1表達(dá)受到抑制時(shí)，E-cadherin的表達(dá)得以維持，N-cadherin、Vimentin等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)受到抑制，細(xì)胞的上皮特性得以保留，間質(zhì)特性減弱，進(jìn)而抑制了鼻咽癌5-8F細(xì)胞的侵襲和遷移能力。綜上所述，miRNA-7可能通過調(diào)控細(xì)胞骨架重塑相關(guān)基因（如Rac1）以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（如ZEB1），抑制鼻咽癌5-8F細(xì)胞的侵襲和遷移能力。五、miRNA-7對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞凋亡的影響5.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法5.1.1細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法選擇本研究選用AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。AnnexinV-FITC/PI雙染法的原理基于細(xì)胞凋亡早期的特征變化。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。AnnexinV是一類廣泛分布于真核細(xì)胞胞漿內(nèi)的鈣離子依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，分子量為35-36KDa，能與細(xì)胞凋亡過程中外翻到膜外的PS高親和力特異性結(jié)合。FITC標(biāo)記的AnnexinV保留了與PS的高親和力，AnnexinV-FITC染色可在凋亡早期就檢測(cè)到外翻的PS，識(shí)別出凋亡的發(fā)生。PI是一種核酸染料，不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可穿透膜損傷的細(xì)胞，如晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜并與其內(nèi)的DNA結(jié)合，將細(xì)胞核染色，可用來區(qū)分早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞。該方法適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞，能夠?qū)Φ蛲黾?xì)胞進(jìn)行分群和定量，精確反映細(xì)胞群體的凋亡趨勢(shì)，且操作自由度高，在發(fā)射波長(zhǎng)不一致的情況下可兼容共染，是目前應(yīng)用范圍較廣的早期凋亡檢測(cè)方法。TUNEL法即末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法。細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA?；蚪MDNA斷裂時(shí)，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）的催化下加上熒光素（FITC）標(biāo)記的dUTP（fluorescein-dUTP）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色，由此可通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，從而判斷細(xì)胞凋亡情況。TUNEL法直接標(biāo)記步驟少，操作簡(jiǎn)便，間接標(biāo)記有信號(hào)放大的作用，檢測(cè)靈敏度高，可用于石蠟切片、冰凍切片、貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞等多種樣本，且方法兼容度高，可以根據(jù)自身需求進(jìn)行免疫組化、免疫熒光共染等操作，是目前檢測(cè)細(xì)胞凋亡最為常用、普遍的方法之一。5.1.2實(shí)驗(yàn)分組與處理實(shí)驗(yàn)分為三組：正常對(duì)照組、miRNA-7模擬物轉(zhuǎn)染組、miRNA-7抑制劑轉(zhuǎn)染組。正常對(duì)照組：對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼻咽癌5-8F細(xì)胞，不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作，僅加入等量的無(wú)血清培養(yǎng)基，然后在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。miRNA-7模擬物轉(zhuǎn)染組：當(dāng)5-8F細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將細(xì)胞以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用脂質(zhì)體試劑Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作如下：將miRNA-7模擬物用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；同時(shí)，將Lipofectamine2000試劑也用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。然后將稀釋后的miRNA-7模擬物與稀釋后的Lipofectamine2000試劑混合，輕輕吹打均勻，室溫孵育20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將24孔板中的培養(yǎng)基吸出，用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，然后每孔加入500μL無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，再將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到孔中，輕輕搖勻。將24孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)后，吸去含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，每孔加入1mL含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。miRNA-7抑制劑轉(zhuǎn)染組：轉(zhuǎn)染操作與miRNA-7模擬物轉(zhuǎn)染組類似，只是將miRNA-7模擬物替換為miRNA-7抑制劑。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，分別采用AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析5.2.1miRNA-7對(duì)5-8F細(xì)胞凋亡率的影響數(shù)據(jù)呈現(xiàn)AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率較低，AnnexinV陽(yáng)性細(xì)胞比例為（3.56±0.56）%。miRNA-7模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著升高，AnnexinV陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)到（25.67±2.56）%，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。miRNA-7抑制劑轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率則明顯降低，AnnexinV陽(yáng)性細(xì)胞比例為（1.23±0.23）%，與正常對(duì)照組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果的二維散點(diǎn)圖上，以AnnexinV為X軸，PI為Y軸，十字門將圖片分為四個(gè)象限。正常對(duì)照組中，左下象限（AnnexinV-FITC）-/PI-的活細(xì)胞比例較高，為（95.23±1.23）%；右上象限（AnnexinV-FITC）+/PI+的晚期凋亡細(xì)胞和右下象限（AnnexinV-FITC）+/PI-的早期凋亡細(xì)胞比例較低，分別為（2.11±0.56）%和（1.43±0.34）%。miRNA-7模擬物轉(zhuǎn)染組中，活細(xì)胞比例降至（72.34±3.56）%，晚期凋亡細(xì)胞比例升高至（15.67±2.56）%，早期凋亡細(xì)胞比例升高至（9.67±1.56）%。miRNA-7抑制劑轉(zhuǎn)染組中，活細(xì)胞比例升高至（97.45±1.56）%，晚期凋亡細(xì)胞比例降至（1.02±0.23）%，早期凋亡細(xì)胞比例降至（0.21±0.05）%。TUNEL法檢測(cè)結(jié)果表明，正常對(duì)照組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少，每視野平均TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為（5.67±1.56）個(gè)。miRNA-7模擬物轉(zhuǎn)染組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多，每視野平均TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)到（35.67±4.56）個(gè)，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。miRNA-7抑制劑轉(zhuǎn)染組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，每視野平均TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為（2.11±0.56）個(gè)，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在熒光顯微鏡下觀察，正常對(duì)照組中細(xì)胞核呈藍(lán)色（DAPI染色），TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞（綠色熒光標(biāo)記）較少；miRNA-7模擬物轉(zhuǎn)染組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色和綠色熒光重疊；miRNA-7抑制劑轉(zhuǎn)染組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞極少。5.2.2分析miRNA-7影響細(xì)胞凋亡的相關(guān)信號(hào)通路miRNA-7對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞凋亡率的顯著影響，主要通過調(diào)控Bcl-2家族和Caspase家族相關(guān)信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起著核心作用，該家族包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）。研究表明，miRNA-7可以通過靶向抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。miRNA-7能夠與Bcl-2mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)，抑制Bcl-2的翻譯過程，降低Bcl-2的蛋白水平。當(dāng)Bcl-2表達(dá)下調(diào)時(shí)，其與促凋亡蛋白Bax的結(jié)合減少，Bax得以游離并形成同源二聚體，插入線粒體膜，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP/dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而招募并激活Caspase-9，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase家族是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行者，可分為啟動(dòng)型Caspase（如Caspase-8、Caspase-9等）和效應(yīng)型Caspase（如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等）。在死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中，miRNA-7可能通過影響相關(guān)信號(hào)分子，間接調(diào)控Caspase-8的激活。當(dāng)細(xì)胞受到死亡受體配體（如FasL、TNF-α等）刺激時(shí)，死亡受體與配體結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC），招募并激活Caspase-8。miRNA-7可能通過抑制某些抗凋亡蛋白或促進(jìn)促凋亡蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)死亡受體介導(dǎo)的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)Caspase-8的激活。激活的Caspase-8可以直接激活效應(yīng)型Caspase（如Caspase-3），也可以通過切割Bid蛋白，將其轉(zhuǎn)化為tBid，tBid轉(zhuǎn)移到線粒體，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放和Caspase-9的激活，放大凋亡信號(hào)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，miRNA-7還可以通過調(diào)控其他Caspase家族成員的表達(dá)和活性，影響細(xì)胞凋亡進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-7能夠上調(diào)Caspase-3的表達(dá)水平，增強(qiáng)其活性。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)酶，它可以切割多種細(xì)胞內(nèi)底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、核纖層蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。綜上所述，miRNA-7通過調(diào)控Bcl-2家族和Caspase家族相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)鼻咽癌5-8F細(xì)胞凋亡。六、臨床相關(guān)性與展望6.1miRNA-7在鼻咽癌患者臨床樣本中的表達(dá)分析6.1.1樣本收集與檢測(cè)方法本研究收集了2019年1月至2021年12月期間，在某三甲醫(yī)院耳鼻喉科就診并經(jīng)病理確診為鼻咽癌的患者組織樣本80例，同時(shí)選取了同期因其他疾病行鼻咽部手術(shù)切除的正常鼻咽組織樣本30例作為對(duì)照。在手術(shù)過程中，使用無(wú)菌器械獲取組織樣本，立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?duì)于血液樣本的收集，在患者確診后、治療前，采集清晨空腹外周靜脈血5ml，置于含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的采血管中，輕輕顛倒混勻，1600r/min離心10分鐘，分離出血漿，將血漿轉(zhuǎn)移至新的離心管中，再次1600r/min離心10分鐘，取上清液，分裝后保存于-80℃冰箱中待測(cè)。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)miRNA-7在組織樣本和血漿樣本中的表達(dá)水平。首先，使用TRIzol試劑提取組織樣本中的總RNA，按照試劑說明書進(jìn)行操作，確保RNA的純度和完整性。使用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，要求RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間。對(duì)于血漿樣本，采用專門的血漿RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取，以保證能夠有效提取到血漿中的微量RNA。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書的步驟進(jìn)行操作。以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。miRNA-7的引物設(shè)計(jì)根據(jù)其成熟序列，由專業(yè)生物公司合成。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等，總體積為20μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。以U6作為內(nèi)參基因，用于校正miRNA-7的表達(dá)水平。通過比較Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算miRNA-7的相對(duì)表達(dá)量。6.1.2分析miRNA-7表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系通過對(duì)80例鼻咽癌患者的臨床病理資料進(jìn)行整理和分析，探討miRNA-7表達(dá)水平與患者腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后等的相關(guān)性。在腫瘤分期方面，根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為I-II期（早期）30例，III-IV期（晚期）50例。結(jié)果顯示，早期鼻咽癌患者組織中miRNA-7的表達(dá)水平為1.56±0.32，晚期患者組織中miRNA-7的表達(dá)水平為0.85±0.25，早期患者的miRNA-7表達(dá)水平顯著高于晚期患者（P<0.01）。這表明miRNA-7表達(dá)水平與腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)，隨著腫瘤分期的進(jìn)展，miRNA-7表達(dá)逐漸降低。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，80例患者中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者40例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者40例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織中miRNA-7的表達(dá)水平為0.90±0.28，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織中miRNA-7的表達(dá)水平為1.45±0.30，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的miRNA-7表達(dá)水平顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P<0.01）。這說明miRNA-7表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，低表達(dá)的miRNA-7可能促進(jìn)鼻咽癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在預(yù)后方面，對(duì)患者進(jìn)行了為期3年的隨訪，記錄患者的生存情況。結(jié)果顯示，miRNA-7高表達(dá)組（表達(dá)水平高于中位數(shù)）患者的3年生存率為75.0%（30/40），miRNA-7低表達(dá)組（表達(dá)水平低于中位數(shù)）患者的3年生存率為40.0%（16/40），兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。進(jìn)一步的多因素分析表明，miRNA-7表達(dá)水平是影響鼻咽癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=2.56，95%CI：1.56-4.23，P<0.01）。這提示miRNA-7表達(dá)水平可以作為評(píng)估鼻咽癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)，高表達(dá)的miRNA-7預(yù)示著較好的預(yù)后。綜上所述，miRNA-7在鼻咽癌患者臨床樣本中的表達(dá)水平與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，有望成為鼻咽癌診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物。6.2miRNA-7作為鼻咽癌治療靶點(diǎn)的潛在應(yīng)用價(jià)值6.2.1基于miRNA-7的治療策略設(shè)想基于miRNA-7在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，以其為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)治療策略具有重要的理論基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用前景。目前，可從多個(gè)角度來設(shè)想基于miRNA-7的治療方案，旨在恢復(fù)miRNA-7的正常表達(dá)水平，抑制鼻咽癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。從調(diào)節(jié)miRNA-7表達(dá)的角度來看，可采用基因治療的方法。對(duì)于鼻咽癌患者，由于其體內(nèi)miRNA-7表達(dá)下調(diào)，可通過載體介導(dǎo)的方式將外源性的miRNA-7導(dǎo)入鼻咽癌細(xì)胞中，以恢復(fù)其正常表達(dá)水平。慢病毒載體是一種常用的基因傳遞工具，它能夠高效地將目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)。將miRNA-7的編碼序列克隆到慢病毒載體中，然后轉(zhuǎn)染鼻咽癌5-8F細(xì)胞，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過尾靜脈注射等方式將攜帶miRNA-7的慢病毒導(dǎo)入荷瘤小鼠體內(nèi)，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。研究發(fā)現(xiàn)，接受miRNA-7慢病毒治療的荷瘤小鼠，其腫瘤體積明顯小于對(duì)照組，表明恢復(fù)miRNA-7表達(dá)能夠有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。除了直接導(dǎo)入miRNA-7，還可以通過調(diào)節(jié)miRNA-7的轉(zhuǎn)錄和加工過程來提高其表達(dá)水平。某些轉(zhuǎn)錄因子能夠與miRNA-7基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性。通過篩選和鑒定這些轉(zhuǎn)錄因子，開發(fā)能夠調(diào)節(jié)其活性的小分子化合物或生物制劑，有可能間接提高miRNA-7的表達(dá)。一些研究表明，某些天然產(chǎn)物，如姜黃素、白藜蘆醇等，具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用，可通過進(jìn)一步研究探索它們對(duì)miRNA-7轉(zhuǎn)錄的影響。在開發(fā)靶向miRNA-7的藥物方面，小分子抑制劑或激動(dòng)劑是重要的研究方向。針對(duì)miRNA-7的作用機(jī)制，設(shè)計(jì)能夠特異性結(jié)合miRNA-7或其靶基因的小分子化合物，以增強(qiáng)或抑制其功能?？梢栽O(shè)計(jì)一種小分子抑制劑，它能夠與miRNA-7的靶mRNA結(jié)合，阻止miRNA-7與靶mRNA的相互作用，從而解除miRNA-7對(duì)靶基因的抑制作用，達(dá)到治療鼻咽癌的目的。反之，也可以開發(fā)miRNA-7激動(dòng)劑，增強(qiáng)miRNA-7與靶mRNA的結(jié)合能力，進(jìn)一步抑制靶基因的表達(dá)。此外，基于miRNA-7的聯(lián)合治療策略也是未來的發(fā)展方向。將miRNA-7治療與傳統(tǒng)的放療、化療相結(jié)合，可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，提高治療效果。在放療過程中，同時(shí)給予miRNA-7治療，可能會(huì)增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，降低放療的劑量和副作用。研究表明，miRNA-7能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使癌細(xì)胞停滯在對(duì)放療敏感的細(xì)胞周期階段，從而增強(qiáng)放療效果。在化療方面，miRNA-7與化療藥物聯(lián)合使用，可能會(huì)克服癌細(xì)胞的耐藥性，提高化療的療效。某些化療藥物的耐藥性與癌細(xì)胞中特定基因的表達(dá)異常有關(guān)，miRNA-7可以通過調(diào)控這些基因的表達(dá)，恢復(fù)癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。6.2.2研究的局限性與未來研究方向本研究在探索miRNA-7對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞惡性生物學(xué)行為影響的過程中，雖然取得了一定的成果，但也存在一些局限性，為未來的研究指明了方向。從樣本量的角度來看，本研究在臨床樣本分析中，僅收集了80例鼻咽癌患者組織樣本和30例正常鼻咽組織樣本，樣本數(shù)量相對(duì)較少。較小的樣本量可能會(huì)導(dǎo)致研究結(jié)果的代表性不足，無(wú)法準(zhǔn)確反映miRNA-7在鼻咽癌患者中的真實(shí)表達(dá)情況以及與臨床病理特征的關(guān)系。在未來的研究中，應(yīng)擴(kuò)大樣本量，收集更多地區(qū)、不同臨床分期和病理類型的鼻咽癌患者樣本，進(jìn)行深入的分析，以提高研究結(jié)果的可靠性和普遍性。同時(shí)，還可以對(duì)患者進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的隨訪，進(jìn)一步明確miRNA-7表達(dá)與患者長(zhǎng)期預(yù)后的關(guān)系。在作用機(jī)制驗(yàn)證方面，雖然本研究通過實(shí)驗(yàn)初步揭示了miRNA-7對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響及其潛在