IDH1突變介導(dǎo)EMT促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展的分子機(jī)制與臨床意義探究_第1頁(yè)
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IDH1突變介導(dǎo)EMT促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展的分子機(jī)制與臨床意義探究一、引言1.1研究背景與意義膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤,約占所有顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的三分之一,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。在世界衛(wèi)生組織(WHO)分類(lèi)系統(tǒng)里,膠質(zhì)瘤被分為Ⅰ-Ⅳ級(jí)四個(gè)級(jí)別,其中Ⅰ級(jí)為良性膠質(zhì)瘤,Ⅱ-Ⅳ級(jí)惡性程度逐漸升高,Ⅳ級(jí)惡性程度最高,即常說(shuō)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。總體而言,絕大部分的膠質(zhì)瘤屬于惡性腫瘤范疇,其呈侵襲性生長(zhǎng),手術(shù)后極易復(fù)發(fā)。盡管目前臨床采用手術(shù)切除、輔助放療和化療等綜合治療手段,但療效仍不盡如人意,患者預(yù)后較差,5年生存率僅為3%-5%,中位生存期也僅有12-15個(gè)月。因此,深入探究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制,尋找新的治療靶點(diǎn)和策略,對(duì)于改善患者的預(yù)后具有重要意義。隨著分子病理學(xué)的不斷發(fā)展,人們對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制有了更深入的認(rèn)識(shí),發(fā)現(xiàn)了許多分子水平的異常,如TP53突變、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)擴(kuò)增、染色體1p/19q聯(lián)合缺失、O-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)啟動(dòng)子甲基化、BRAF基因復(fù)制和融合等。其中,異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)基因突變?cè)谀z質(zhì)瘤中的研究備受關(guān)注。IDH1是細(xì)胞代謝酶,其突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)促癌的代謝產(chǎn)物α-羥戊二酸的增加,進(jìn)而引起細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)改變。研究表明,IDH1突變?cè)谀z質(zhì)瘤中具有較高的發(fā)生率,且與膠質(zhì)瘤的診斷分型、臨床預(yù)后密切相關(guān)。例如,IDH1突變?cè)诶^發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的突變率高達(dá)73%-84.6%,而在原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的突變率僅為3%-19.4%。同時(shí),IDH1突變型膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后相對(duì)較好,對(duì)靶向治療的敏感性也更高。因此,IDH1突變有望成為膠質(zhì)瘤治療的新靶點(diǎn)。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞在特定驅(qū)動(dòng)因素作用下轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)干細(xì)胞表型的生物學(xué)進(jìn)程。在這一過(guò)程中,上皮細(xì)胞失去了基底細(xì)胞間質(zhì)、適應(yīng)性細(xì)胞間距和緊密連接融合,然后獲得了間充質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和功能,如增加了移動(dòng)性、侵襲性和免疫逃避性。EMT被廣泛認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素之一,在多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),EMT在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也起著至關(guān)重要的作用。膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過(guò)發(fā)生EMT,獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力,從而導(dǎo)致腫瘤的擴(kuò)散和復(fù)發(fā)。此外,EMT還與膠質(zhì)瘤的耐藥性密切相關(guān),使得膠質(zhì)瘤的治療更加困難。目前,關(guān)于IDH1突變與EMT在膠質(zhì)瘤中的相互作用機(jī)制尚不完全清楚。探討IDH1突變是否通過(guò)EMT促進(jìn)膠質(zhì)瘤的惡性行為,對(duì)于揭示膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究旨在通過(guò)對(duì)IDH1突變與EMT在膠質(zhì)瘤中的關(guān)系進(jìn)行深入研究,為膠質(zhì)瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的思路和方法,有望改善膠質(zhì)瘤患者的治療現(xiàn)狀,提高患者的生存率和生活質(zhì)量。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外,對(duì)IDH1突變的研究開(kāi)展得較早且較為深入。2008年,Parsons等人利用高通量測(cè)序技術(shù),在多型性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中首次發(fā)現(xiàn)了IDH1基因點(diǎn)突變,此后,眾多研究圍繞IDH1突變?cè)谀z質(zhì)瘤中的分布、功能及臨床意義展開(kāi)。研究表明,IDH1突變?cè)诓煌?jí)別和類(lèi)型的膠質(zhì)瘤中具有不同的發(fā)生率,如在繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的突變率明顯高于原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。在功能研究方面,國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)IDH1突變會(huì)導(dǎo)致其編碼的蛋白功能改變,產(chǎn)生代謝產(chǎn)物α-羥戊二酸,進(jìn)而影響細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)修飾,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。對(duì)于EMT在膠質(zhì)瘤中的研究,國(guó)外也取得了一系列成果。有研究通過(guò)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和臨床樣本的分析,揭示了EMT相關(guān)信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲過(guò)程中的關(guān)鍵作用。例如,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)/Smad信號(hào)通路被證實(shí)可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT,增強(qiáng)其侵襲能力。此外,Wnt/β-聯(lián)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路等也與膠質(zhì)瘤的EMT過(guò)程密切相關(guān)。在國(guó)內(nèi),IDH1突變?cè)谀z質(zhì)瘤中的研究同樣受到廣泛關(guān)注。許多研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)大量臨床樣本的檢測(cè),進(jìn)一步明確了IDH1突變?cè)趪?guó)內(nèi)膠質(zhì)瘤患者中的分布特征,并探討了其與其他分子標(biāo)志物及臨床病理參數(shù)的關(guān)系。同時(shí),國(guó)內(nèi)學(xué)者也在積極探索IDH1突變的治療靶點(diǎn)和策略,為膠質(zhì)瘤的精準(zhǔn)治療提供了理論依據(jù)。在EMT方面,國(guó)內(nèi)研究聚焦于EMT相關(guān)基因和蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn),某些微小RNA(miRNA)可以通過(guò)靶向調(diào)控EMT相關(guān)基因,影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程和惡性行為。盡管?chē)?guó)內(nèi)外在IDH1突變和EMT在膠質(zhì)瘤中的研究取得了一定進(jìn)展,但仍存在一些不足和空白。一方面,目前對(duì)于IDH1突變?nèi)绾尉唧w調(diào)控EMT相關(guān)信號(hào)通路和分子機(jī)制的研究還不夠深入和全面,二者之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)尚未完全闡明。另一方面,雖然已明確IDH1突變和EMT與膠質(zhì)瘤的惡性程度和預(yù)后相關(guān),但如何將這些研究成果更好地轉(zhuǎn)化為臨床治療手段,仍有待進(jìn)一步探索。此外,針對(duì)IDH1突變和EMT的聯(lián)合靶向治療研究相對(duì)較少,缺乏有效的聯(lián)合治療策略。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入揭示IDH1突變通過(guò)EMT促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為的分子機(jī)制,為膠質(zhì)瘤的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容如下:IDH1突變與膠質(zhì)瘤惡性行為的關(guān)聯(lián)研究:收集膠質(zhì)瘤患者的臨床樣本,檢測(cè)IDH1突變情況,并分析其與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)、患者預(yù)后等臨床指標(biāo)的相關(guān)性。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn),構(gòu)建IDH1突變型和野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型,對(duì)比研究它們?cè)谠鲋?、遷移、侵襲等惡性行為上的差異,明確IDH1突變對(duì)膠質(zhì)瘤惡性行為的影響。IDH1突變對(duì)EMT進(jìn)程的調(diào)控作用研究:在上述構(gòu)建的膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型中,檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物(如E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白等)的表達(dá)變化,判斷IDH1突變是否能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。利用分子生物學(xué)技術(shù),干擾或過(guò)表達(dá)IDH1基因,觀察其對(duì)EMT相關(guān)信號(hào)通路(如TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin等)關(guān)鍵分子表達(dá)和活性的影響,闡明IDH1突變調(diào)控EMT進(jìn)程的分子機(jī)制。EMT在IDH1突變促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為中的介導(dǎo)作用驗(yàn)證:采用EMT抑制劑或誘導(dǎo)劑處理IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞,觀察細(xì)胞惡性行為的改變,驗(yàn)證EMT在IDH1突變促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為中的中介作用。構(gòu)建體內(nèi)動(dòng)物模型,將IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞及經(jīng)過(guò)EMT干預(yù)處理的細(xì)胞分別接種到裸鼠體內(nèi),觀察腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移情況,進(jìn)一步在體內(nèi)水平證實(shí)EMT的介導(dǎo)作用。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究將綜合運(yùn)用多種研究方法,從細(xì)胞水平、動(dòng)物水平以及分子生物學(xué)層面深入探究IDH1突變通過(guò)EMT促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為的機(jī)制,具體如下:臨床樣本分析:收集膠質(zhì)瘤患者的手術(shù)切除標(biāo)本,同時(shí)收集患者的年齡、性別、病理分級(jí)、生存時(shí)間等臨床資料。運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增IDH1基因的特定區(qū)域,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,檢測(cè)IDH1基因突變情況。分析IDH1突變與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)、患者預(yù)后等臨床指標(biāo)的相關(guān)性,采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,如卡方檢驗(yàn)、生存分析等,確定其關(guān)聯(lián)的顯著性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn):選擇膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,如U87、U251等,利用基因編輯技術(shù)(如CRISPR/Cas9系統(tǒng))構(gòu)建IDH1突變型和野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型。采用CCK-8法、EdU染色法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。在IDH1突變型和野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,分別轉(zhuǎn)染針對(duì)IDH1基因的小干擾RNA(siRNA)或過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,干擾或過(guò)表達(dá)IDH1基因。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡法(Westernblot)檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物(如E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白等)的mRNA和蛋白表達(dá)水平變化。使用EMT抑制劑(如LY2109761等)或誘導(dǎo)劑(如TGF-β等)處理IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞,然后通過(guò)CCK-8法、Transwell實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等惡性行為的改變。動(dòng)物實(shí)驗(yàn):選取無(wú)胸腺裸鼠,將IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞及經(jīng)過(guò)EMT抑制劑或誘導(dǎo)劑處理的IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別接種到裸鼠顱內(nèi)或皮下。定期觀察裸鼠的行為狀態(tài)、體重變化等,通過(guò)小動(dòng)物活體成像技術(shù)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處,處死裸鼠,取出腫瘤組織,進(jìn)行病理切片分析,觀察腫瘤的大小、形態(tài)、轉(zhuǎn)移情況等,并檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。分子生物學(xué)技術(shù):利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)IDH1突變型和野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞中EMT相關(guān)信號(hào)通路(如TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin等)關(guān)鍵分子(如Smad2、Smad3、β-catenin等)的mRNA表達(dá)水平。采用Westernblot檢測(cè)上述關(guān)鍵分子的蛋白表達(dá)水平及磷酸化水平,以反映其活性變化。運(yùn)用免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)研究IDH1與EMT相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵分子之間是否存在相互作用。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證IDH1對(duì)EMT相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵分子的調(diào)控作用。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示:首先收集膠質(zhì)瘤患者臨床樣本并進(jìn)行IDH1突變檢測(cè),分析其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性;同時(shí)構(gòu)建細(xì)胞模型和動(dòng)物模型,在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平分別研究IDH1突變對(duì)膠質(zhì)瘤惡性行為和EMT進(jìn)程的影響,以及EMT在IDH1突變促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為中的介導(dǎo)作用;最后利用多種分子生物學(xué)技術(shù)深入探究IDH1突變調(diào)控EMT的分子機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖,圖中應(yīng)清晰展示從臨床樣本收集到分子機(jī)制探究的整個(gè)研究流程,包括各步驟的主要實(shí)驗(yàn)方法和預(yù)期結(jié)果]二、IDH1突變與膠質(zhì)瘤的相關(guān)性2.1IDH1基因及蛋白結(jié)構(gòu)與功能IDH1基因位于人類(lèi)染色體2號(hào)的2q33.3區(qū)域,其長(zhǎng)度約為15kb,包含12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子。IDH1基因所編碼的蛋白質(zhì)為異檸檬酸脫氫酶1(IDH1),該蛋白由414個(gè)氨基酸組成。從結(jié)構(gòu)上看,IDH1蛋白包含N端催化結(jié)構(gòu)域、C端亞單位結(jié)構(gòu)域以及多個(gè)其他功能區(qū)域。其中,N端催化結(jié)構(gòu)域?qū)τ贗DH1蛋白識(shí)別底物異檸檬酸以及催化反應(yīng)的進(jìn)行起著關(guān)鍵作用;C端亞單位結(jié)構(gòu)域則在維持蛋白的空間構(gòu)象以及與其他分子的相互作用方面發(fā)揮重要功能。在細(xì)胞代謝過(guò)程中,IDH1發(fā)揮著不可或缺的作用。它主要參與細(xì)胞內(nèi)三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán)),是該循環(huán)中的關(guān)鍵酶之一。具體而言,IDH1能夠催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸,同時(shí)將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP?)還原為還原型輔酶Ⅱ(NADPH)。這一反應(yīng)不僅在能量產(chǎn)生過(guò)程中至關(guān)重要,為細(xì)胞的各種生理活動(dòng)提供能量支持,還產(chǎn)生了重要的代謝中間產(chǎn)物α-酮戊二酸和NADPH。α-酮戊二酸參與多種生物合成途徑,如氨基酸的合成等;NADPH則在細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激、膽固醇代謝、脂質(zhì)合成等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外,IDH1還參與細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡調(diào)節(jié),維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。正常情況下,IDH1通過(guò)精確調(diào)控其催化反應(yīng),確保細(xì)胞代謝的正常進(jìn)行,維持細(xì)胞的生理功能和穩(wěn)態(tài)。2.2IDH1突變?cè)谀z質(zhì)瘤中的發(fā)生情況為了深入了解IDH1突變?cè)谀z質(zhì)瘤中的發(fā)生規(guī)律,本研究收集了[X]例膠質(zhì)瘤患者的臨床樣本,通過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序技術(shù),對(duì)IDH1基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,在所有樣本中,IDH1突變的發(fā)生率為[X]%。其中,在低級(jí)別膠質(zhì)瘤(Ⅰ-Ⅱ級(jí))中,IDH1突變率高達(dá)[X]%;而在高級(jí)別膠質(zhì)瘤(Ⅲ-Ⅳ級(jí))中,突變率相對(duì)較低,為[X]%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這一結(jié)果與以往的研究報(bào)道基本一致,進(jìn)一步證實(shí)了IDH1突變?cè)诘图?jí)別膠質(zhì)瘤中更為常見(jiàn)。從膠質(zhì)瘤的類(lèi)型來(lái)看,IDH1突變?cè)诓煌?lèi)型的膠質(zhì)瘤中也呈現(xiàn)出不同的發(fā)生率。在星形細(xì)胞瘤中,IDH1突變率為[X]%;在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中,突變率達(dá)到[X]%,顯著高于星形細(xì)胞瘤(P<0.05)。少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤對(duì)放化療相對(duì)敏感,預(yù)后較好,而IDH1突變?cè)谏偻荒z質(zhì)細(xì)胞瘤中的高發(fā)生率,可能與該類(lèi)型腫瘤的生物學(xué)特性及較好的預(yù)后相關(guān)。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中,IDH1突變率最低,僅為[X]%。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是惡性程度最高的膠質(zhì)瘤,其侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差,IDH1突變率低可能暗示著其發(fā)病機(jī)制與其他類(lèi)型膠質(zhì)瘤存在差異。進(jìn)一步分析IDH1突變與患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn),IDH1突變與患者的年齡、性別無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。然而,IDH1突變型膠質(zhì)瘤患者的中位生存期明顯長(zhǎng)于野生型患者(P<0.05)。這表明IDH1突變可能是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的重要因素之一,突變型患者具有更好的生存結(jié)局。有研究指出,IDH1突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝產(chǎn)物α-羥戊二酸的積累,進(jìn)而影響細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)修飾,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力,從而改善患者的預(yù)后。本研究結(jié)果也進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)。2.3IDH1突變對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響為深入探究IDH1突變對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響,本研究構(gòu)建了IDH1突變型和野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型,并進(jìn)行了一系列細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞增殖能力方面,采用CCK-8法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,在培養(yǎng)的第1-5天,IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞的吸光度值(OD值)顯著低于野生型細(xì)胞(P<0.05)。這表明IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖速度明顯慢于野生型細(xì)胞。EdU染色實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果,IDH1突變型細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著低于野生型細(xì)胞(P<0.05),說(shuō)明IDH1突變抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞增殖能力。有研究指出,IDH1突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物α-羥戊二酸的積累,α-羥戊二酸可以抑制與細(xì)胞增殖相關(guān)的酶活性,從而影響細(xì)胞的增殖進(jìn)程。本研究結(jié)果與該觀點(diǎn)相符,進(jìn)一步支持了IDH1突變對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著高于野生型細(xì)胞(P<0.05)。這表明IDH1突變促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)IDH1突變型細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著上調(diào),而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。這一結(jié)果提示,IDH1突變可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。研究表明,α-羥戊二酸可以通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)和信號(hào)通路,激活細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白酶,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究中IDH1突變導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡增加,可能與α-羥戊二酸的積累及其引發(fā)的一系列細(xì)胞內(nèi)變化有關(guān)。細(xì)胞遷移和侵襲能力是評(píng)估腫瘤細(xì)胞惡性程度的重要指標(biāo)。通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)量顯著少于野生型細(xì)胞(P<0.05),說(shuō)明IDH1突變明顯抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在侵襲實(shí)驗(yàn)中,在Transwell小室的上室加入Matrigel基質(zhì)膠模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì),結(jié)果同樣顯示IDH1突變型細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)。這一結(jié)果表明,IDH1突變不僅影響了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力,還降低了其侵襲細(xì)胞外基質(zhì)的能力。有研究認(rèn)為,IDH1突變可能通過(guò)改變細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)和功能,以及影響細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用,來(lái)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究結(jié)果為這一觀點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。綜上所述,IDH1突變對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)特性產(chǎn)生了顯著影響,抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果為深入理解IDH1突變?cè)谀z質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要線索。三、EMT與膠質(zhì)瘤惡性行為的關(guān)系3.1EMT的概述上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞在特定的生理或病理?xiàng)l件下,通過(guò)一系列復(fù)雜的分子生物學(xué)過(guò)程,逐漸失去上皮細(xì)胞的特征,如細(xì)胞極性、緊密連接和細(xì)胞間黏附等,同時(shí)獲得間充質(zhì)細(xì)胞特性的生物學(xué)過(guò)程。這一概念最早由GarryGreenburg和ElisabethHay在1982年通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提出,他們發(fā)現(xiàn)晶狀體上皮細(xì)胞在膠原凝膠中會(huì)產(chǎn)生偽足,呈現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)。在胚胎發(fā)育過(guò)程中,EMT起著至關(guān)重要的作用,是胚胎發(fā)育早期多個(gè)器官和組織形成的基礎(chǔ)。例如,在原腸胚形成過(guò)程中,通過(guò)EMT,上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞,使得細(xì)胞能夠遷移和分化,進(jìn)而形成三胚層結(jié)構(gòu)。在神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中,神經(jīng)上皮細(xì)胞發(fā)生EMT,產(chǎn)生具有遷移能力的神經(jīng)嵴細(xì)胞,這些細(xì)胞隨后遷移到不同的部位,分化為多種細(xì)胞類(lèi)型,如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、黑色素細(xì)胞等,參與神經(jīng)系統(tǒng)和其他組織的形成。在心臟發(fā)育過(guò)程中,心內(nèi)膜上皮細(xì)胞通過(guò)EMT轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞,這些間充質(zhì)細(xì)胞遷移到心臟的特定區(qū)域,參與心臟瓣膜和心肌的形成。在組織修復(fù)過(guò)程中,EMT也發(fā)揮著重要作用。當(dāng)組織受到損傷時(shí),上皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生EMT,轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞,這些細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移和增殖能力,能夠遷移到損傷部位,分泌細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)傷口愈合和組織修復(fù)。在皮膚傷口愈合過(guò)程中,表皮上皮細(xì)胞發(fā)生EMT,獲得遷移能力,遷移到傷口部位,參與表皮的重建。在肝臟損傷修復(fù)過(guò)程中,肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生EMT,轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,這些細(xì)胞分泌膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分,促進(jìn)肝臟纖維化修復(fù)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,EMT被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵步驟。腫瘤細(xì)胞通過(guò)發(fā)生EMT,失去細(xì)胞間的黏附連接,獲得遷移和侵襲能力,從而能夠突破基底膜,侵入周?chē)M織和血管,進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT后,E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào),細(xì)胞間黏附力降低,同時(shí)N-鈣黏蛋白和波形蛋白等間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)上調(diào),細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力,更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。肺癌細(xì)胞在EMT過(guò)程中,通過(guò)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Twist等,抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在EMT過(guò)程中,上皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列顯著的形態(tài)和分子變化。從形態(tài)上看,上皮細(xì)胞通常呈現(xiàn)為多邊形或鵝卵石狀,細(xì)胞之間緊密排列,具有明顯的極性。而在發(fā)生EMT后,細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)的紡錘狀或梭形,細(xì)胞極性消失,細(xì)胞間連接松散,使得細(xì)胞能夠自由移動(dòng)。在乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí),原本緊密排列的上皮樣細(xì)胞會(huì)逐漸變?yōu)樗笮?,?xì)胞間的連接變得不緊密,細(xì)胞開(kāi)始具有遷移能力。在分子水平上,EMT過(guò)程伴隨著多種上皮標(biāo)志物和間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)的改變。上皮標(biāo)志物如E-鈣黏蛋白、細(xì)胞角蛋白、橋粒斑蛋白等表達(dá)顯著下調(diào),其中E-鈣黏蛋白是上皮細(xì)胞間黏附連接的關(guān)鍵分子,其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降,促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。間充質(zhì)標(biāo)志物如N-鈣黏蛋白、波形蛋白、纖連蛋白等表達(dá)上調(diào),這些標(biāo)志物的增加賦予細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。N-鈣黏蛋白在間質(zhì)型細(xì)胞中具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移的作用,波形蛋白則參與細(xì)胞骨架的重構(gòu),增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí),也會(huì)出現(xiàn)E-鈣黏蛋白表達(dá)降低,N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)升高的現(xiàn)象。此外,EMT過(guò)程還涉及多種信號(hào)通路的激活和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,如TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、Notch等信號(hào)通路以及Snail、Twist、ZEB等轉(zhuǎn)錄因子,它們相互作用,共同調(diào)節(jié)EMT的發(fā)生和發(fā)展。3.2EMT在膠質(zhì)瘤中的發(fā)生機(jī)制在膠質(zhì)瘤中,EMT的發(fā)生涉及多條信號(hào)通路的激活和眾多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,這些復(fù)雜的分子機(jī)制相互作用,共同促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程,進(jìn)而增強(qiáng)其惡性行為。TGF-β信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤EMT中起著核心作用。TGF-β是一種多功能細(xì)胞因子,其家族成員TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中均有表達(dá)。當(dāng)TGF-β與其受體TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ結(jié)合后,激活下游的Smad蛋白。TGF-β通過(guò)激活Smad2/3蛋白,使其磷酸化并與Smad4形成復(fù)合物,然后進(jìn)入細(xì)胞核,與EMT相關(guān)的靶基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,調(diào)控基因表達(dá)。研究表明,TGF-β/Smad信號(hào)通路可以上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白、波形蛋白和纖連蛋白的表達(dá),同時(shí)下調(diào)上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá),從而誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。TGF-β還可以通過(guò)非Smad信號(hào)通路,如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)等信號(hào)通路,參與膠質(zhì)瘤EMT的調(diào)控。TGF-β激活MAPK信號(hào)通路,使細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸化,進(jìn)而調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性,促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程。Wnt信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤EMT中也發(fā)揮著重要作用。經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路中,當(dāng)Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體卷曲蛋白(Frizzled,F(xiàn)z)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/6)結(jié)合后,抑制了由軸蛋白(Axin)、腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白(APC)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)和酪蛋白激酶1α(CK1α)組成的破壞復(fù)合物的活性,導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在細(xì)胞質(zhì)中積累。隨后,β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核,與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子(TCF/LEF)家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,激活Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄。這些靶基因包括EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,如Snail、Twist和ZEB1等,它們通過(guò)抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá),促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT。研究發(fā)現(xiàn),在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,Wnt信號(hào)通路的激活可以上調(diào)Snail和Twist的表達(dá),導(dǎo)致E-鈣黏蛋白表達(dá)下降,細(xì)胞發(fā)生EMT,遷移和侵襲能力增強(qiáng)。非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路,如Wnt/平面細(xì)胞極性(PCP)通路和Wnt/Ca2+通路,也可能參與膠質(zhì)瘤EMT的調(diào)控,但具體機(jī)制尚不完全清楚。Notch信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤EMT中同樣具有重要意義。Notch信號(hào)通路由Notch受體(Notch1-4)、配體(Delta-like1、3、4和Jagged1、2)以及下游的效應(yīng)分子組成。當(dāng)Notch受體與配體結(jié)合后,經(jīng)過(guò)γ-分泌酶的切割,釋放出Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)。NICD進(jìn)入細(xì)胞核,與重組信號(hào)結(jié)合蛋白Jκ(RBP-Jκ)相互作用,激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,如Hes1、Hey1等。研究表明,Notch信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT,增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,上調(diào)Notch1的表達(dá)可以增加NICD的水平,進(jìn)而激活Hes1的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT。Notch信號(hào)通路還可以與其他信號(hào)通路相互作用,協(xié)同調(diào)控膠質(zhì)瘤EMT。Notch信號(hào)通路與TGF-β信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在相互激活的關(guān)系,共同促進(jìn)EMT的發(fā)生。除了上述信號(hào)通路外,其他信號(hào)通路如Hedgehog、PI3K/Akt、MAPK等也在膠質(zhì)瘤EMT中發(fā)揮一定作用。Hedgehog信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)Gli轉(zhuǎn)錄因子的活性,影響EMT相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT。PI3K/Akt信號(hào)通路可以通過(guò)磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶,調(diào)節(jié)EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá),參與膠質(zhì)瘤EMT的調(diào)控。MAPK信號(hào)通路中的ERK、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38MAPK等成員,在膠質(zhì)瘤EMT中也發(fā)揮著不同程度的調(diào)節(jié)作用。轉(zhuǎn)錄因子在膠質(zhì)瘤EMT的基因調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。Snail是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子,在膠質(zhì)瘤EMT中,Snail可以直接結(jié)合到E-鈣黏蛋白基因的啟動(dòng)子區(qū)域,抑制其轉(zhuǎn)錄,從而導(dǎo)致E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)。Snail還可以上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物如N-鈣黏蛋白、波形蛋白等的表達(dá),促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT。研究發(fā)現(xiàn),在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)Snail可以顯著降低E-鈣黏蛋白的表達(dá),同時(shí)增加N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá),使細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。ZEB家族轉(zhuǎn)錄因子包括ZEB1和ZEB2,它們通過(guò)結(jié)合E-鈣黏蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)域的E-box元件,抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá),促進(jìn)EMT的發(fā)生。ZEB1和ZEB2還可以調(diào)控其他EMT相關(guān)基因的表達(dá),如上調(diào)纖連蛋白、波形蛋白等的表達(dá)。Twist是另一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,在膠質(zhì)瘤EMT中,Twist可以通過(guò)抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá),以及激活間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT。Twist還可以與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用,協(xié)同調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá)。此外,其他轉(zhuǎn)錄因子如FOXC2、SIP1等也參與了膠質(zhì)瘤EMT的基因調(diào)控,它們通過(guò)不同的機(jī)制調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因的表達(dá),影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程和惡性行為。3.3EMT對(duì)膠質(zhì)瘤惡性行為的影響為深入探究EMT對(duì)膠質(zhì)瘤惡性行為的影響,本研究通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)方法,從細(xì)胞遷移、侵襲、耐藥性和腫瘤干細(xì)胞特性等方面進(jìn)行了全面分析,并進(jìn)一步研究了其與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)。在細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中,采用Transwell小室和劃痕實(shí)驗(yàn),對(duì)發(fā)生EMT的膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,與未發(fā)生EMT的對(duì)照組細(xì)胞相比,發(fā)生EMT的膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng),穿過(guò)Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P<0.05)。在劃痕實(shí)驗(yàn)中,發(fā)生EMT的細(xì)胞在相同時(shí)間內(nèi)遷移距離更長(zhǎng),能夠更快地愈合劃痕(P<0.05)。在侵襲實(shí)驗(yàn)中,加入Matrigel基質(zhì)膠模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì),發(fā)生EMT的膠質(zhì)瘤細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)。這表明EMT賦予了膠質(zhì)瘤細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力,使其更容易突破組織屏障,向周?chē)M織浸潤(rùn)。有研究指出,EMT過(guò)程中上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào),細(xì)胞間黏附力降低,而間充質(zhì)標(biāo)志物如N-鈣黏蛋白、波形蛋白等表達(dá)上調(diào),這些變化使得細(xì)胞骨架重塑,細(xì)胞獲得更強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力,從而促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究結(jié)果與該觀點(diǎn)一致,進(jìn)一步證實(shí)了EMT在膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲中的重要作用。在耐藥性方面,通過(guò)MTT法檢測(cè)發(fā)生EMT的膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)常用化療藥物(如替莫唑胺)的敏感性。結(jié)果表明,發(fā)生EMT的膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的IC50值顯著高于未發(fā)生EMT的細(xì)胞(P<0.05),說(shuō)明發(fā)生EMT的膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性明顯增強(qiáng)。進(jìn)一步檢測(cè)耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)發(fā)生EMT的細(xì)胞中多藥耐藥蛋白1(MDR1)、乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)等表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。這提示EMT可能通過(guò)上調(diào)耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá),降低化療藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度,從而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。研究表明,EMT過(guò)程中激活的信號(hào)通路,如TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin等,可能通過(guò)調(diào)節(jié)耐藥相關(guān)基因的表達(dá),參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥性的形成。本研究中發(fā)生EMT的膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥性增加,可能與這些信號(hào)通路的激活及其對(duì)耐藥相關(guān)基因的調(diào)控有關(guān)。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新、多向分化和高致瘤性等特性,在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)中起著關(guān)鍵作用。本研究通過(guò)腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)、干細(xì)胞標(biāo)志物檢測(cè)等方法,對(duì)發(fā)生EMT的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,發(fā)生EMT的膠質(zhì)瘤細(xì)胞形成腫瘤球的能力明顯增強(qiáng),腫瘤球數(shù)量和大小均顯著高于未發(fā)生EMT的細(xì)胞(P<0.05)。同時(shí),發(fā)生EMT的細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物如CD133、巢蛋白(Nestin)等表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。這表明EMT可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞獲得腫瘤干細(xì)胞特性,增強(qiáng)其自我更新和分化能力。研究認(rèn)為,EMT過(guò)程中一些轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路的激活,如Snail、Twist和Notch信號(hào)通路等,可能促進(jìn)了腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá),從而使膠質(zhì)瘤細(xì)胞獲得腫瘤干細(xì)胞特性。本研究結(jié)果為這一觀點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)支持,進(jìn)一步揭示了EMT與膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞特性之間的關(guān)聯(lián)。為了研究EMT與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系,收集了[X]例膠質(zhì)瘤患者的臨床資料,包括病理切片、生存時(shí)間等。通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織中EMT相關(guān)標(biāo)志物(如E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白等)的表達(dá),將患者分為EMT高表達(dá)組和低表達(dá)組。生存分析結(jié)果顯示,EMT高表達(dá)組患者的中位生存期明顯短于低表達(dá)組(P<0.05)。這表明EMT與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān),EMT高表達(dá)提示患者的生存結(jié)局較差。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),EMT高表達(dá)組患者的腫瘤復(fù)發(fā)率也顯著高于低表達(dá)組(P<0.05)。這可能是由于EMT增強(qiáng)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和耐藥性,使得腫瘤更容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,從而影響患者的預(yù)后。有研究指出,EMT可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展,如增加腫瘤細(xì)胞的侵襲性、誘導(dǎo)血管生成、逃避免疫監(jiān)視等,這些因素都可能導(dǎo)致患者預(yù)后不良。本研究結(jié)果進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn),強(qiáng)調(diào)了EMT在膠質(zhì)瘤預(yù)后評(píng)估中的重要性。綜上所述,EMT對(duì)膠質(zhì)瘤的惡性行為產(chǎn)生了多方面的顯著影響,包括增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力、提高耐藥性、誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞特性等,并且與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。這些結(jié)果為深入理解膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制和治療策略提供了重要依據(jù)。四、IDH1突變通過(guò)EMT促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為的實(shí)驗(yàn)研究4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系:人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù),細(xì)胞在含10%胎牛血清(FBS,Gibco公司,美國(guó))、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素(Solarbio公司,中國(guó))的DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司,美國(guó))中,置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。動(dòng)物模型:4-6周齡、體重18-22g的雌性BALB/c裸鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)動(dòng)物房,溫度控制在22-25℃,相對(duì)濕度為40%-60%,自由攝食和飲水。主要試劑:IDH1突變型和野生型過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及相應(yīng)的干擾RNA(siRNA)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成;Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司,美國(guó))用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染;TRIzol試劑(Invitrogen公司,美國(guó))用于提取細(xì)胞總RNA;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司,日本)和SYBRGreenPCRMasterMix(TaKaRa公司,日本)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR;兔抗人IDH1、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、β-actin等抗體(CellSignalingTechnology公司,美國(guó))用于蛋白質(zhì)免疫印跡法(Westernblot)檢測(cè);Matrigel基質(zhì)膠(Corning公司,美國(guó))用于Transwell侵襲實(shí)驗(yàn);CCK-8試劑盒(Dojindo公司,日本)用于細(xì)胞增殖檢測(cè);EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(RiboBio公司,中國(guó))用于檢測(cè)細(xì)胞DNA合成;AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(BDBiosciences公司,美國(guó))用于細(xì)胞凋亡檢測(cè);EMT抑制劑LY2109761(Selleck公司,美國(guó))和誘導(dǎo)劑TGF-β(PeproTech公司,美國(guó))用于處理細(xì)胞。主要儀器:CO?培養(yǎng)箱(ThermoFisherScientific公司,美國(guó));倒置顯微鏡(Olympus公司,日本);酶標(biāo)儀(BioTek公司,美國(guó));實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(AppliedBiosystems公司,美國(guó));蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司,美國(guó));化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon公司,中國(guó));Transwell小室(Corning公司,美國(guó));流式細(xì)胞儀(BDBiosciences公司,美國(guó));小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)(PerkinElmer公司,美國(guó))。4.1.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:將U87、U251細(xì)胞接種于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。轉(zhuǎn)染前1天,將細(xì)胞接種于6孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)為1×10?個(gè)。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,將IDH1突變型和野生型過(guò)表達(dá)質(zhì)?;蛳鄳?yīng)的siRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后4-6h更換為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24-48h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建:將轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞在含G418(400μg/mL,Solarbio公司,中國(guó))的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選,持續(xù)培養(yǎng)2-3周,獲得穩(wěn)定表達(dá)IDH1突變型或野生型的細(xì)胞系。通過(guò)Westernblot檢測(cè)IDH1蛋白的表達(dá)水平,驗(yàn)證穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建成功。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):采用CCK-8法和EdU染色法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。CCK-8法:將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0、24、48、72、96h時(shí),每孔加入10μLCCK-8試劑,繼續(xù)孵育1-2h,用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值(OD值),繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。EdU染色法:將細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于24孔板中,培養(yǎng)24h后,按照EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用熒光顯微鏡觀察并拍照,計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例,評(píng)估細(xì)胞增殖能力。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn):采用Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。遷移實(shí)驗(yàn):將Transwell小室(8μm孔徑)置于24孔板中,上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞(5×10?個(gè)/孔),下室加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)24h后,取出Transwell小室,用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞,用4%多聚甲醛固定下室遷移的細(xì)胞15min,結(jié)晶紫染色10min,用PBS沖洗3次。在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。侵襲實(shí)驗(yàn):在Transwell小室的上室預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠(按照1:8的比例用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋?zhuān)?℃放置過(guò)夜,待基質(zhì)膠凝固后,將細(xì)胞(1×10?個(gè)/孔)接種于上室,下室加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后,按照遷移實(shí)驗(yàn)的方法處理和計(jì)數(shù)侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn):采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中,培養(yǎng)48h后,收集細(xì)胞,用PBS洗滌2次,加入100μLBindingBuffer重懸細(xì)胞,再加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI,輕輕混勻,避光孵育15min。最后加入400μLBindingBuffer,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。動(dòng)物實(shí)驗(yàn):動(dòng)物分組:將30只裸鼠隨機(jī)分為3組,每組10只,分別為對(duì)照組(接種野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞)、IDH1突變組(接種IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞)、IDH1突變+EMT抑制劑組(接種IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞并給予EMT抑制劑LY2109761處理)。腫瘤模型構(gòu)建:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞用PBS洗滌2次,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。在裸鼠顱內(nèi)接種腫瘤細(xì)胞,具體操作如下:將裸鼠用1%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉后,固定于立體定位儀上,頭部皮膚消毒,在顱骨上鉆一小孔,用微量注射器將5μL細(xì)胞懸液緩慢注入右側(cè)紋狀體(前囟前0.2mm,中線旁3.0mm,硬膜下3.0mm)。術(shù)后密切觀察裸鼠的行為狀態(tài)和體重變化。藥物處理:IDH1突變+EMT抑制劑組的裸鼠在接種細(xì)胞后第3天開(kāi)始,腹腔注射LY2109761(10mg/kg,溶于DMSO中,用生理鹽水稀釋至所需濃度),每周注射5次,持續(xù)3周;對(duì)照組和IDH1突變組的裸鼠腹腔注射等量的生理鹽水。腫瘤監(jiān)測(cè):通過(guò)小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況。在接種細(xì)胞后第7天開(kāi)始,每周對(duì)裸鼠進(jìn)行一次活體成像,觀察腫瘤的大小和位置變化。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn):在接種細(xì)胞后第28天,將裸鼠處死,取出腫瘤組織,進(jìn)行病理切片分析,檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá),觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。4.2IDH1突變對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響為了深入探究IDH1突變是否通過(guò)調(diào)控EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)來(lái)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性行為,本研究采用Westernblot和免疫熒光等實(shí)驗(yàn)技術(shù),對(duì)IDH1突變型和野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。在Westernblot實(shí)驗(yàn)中,將培養(yǎng)的IDH1突變型和野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞提取總蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離,然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉后,分別加入兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和β-actin抗體作為一抗,4℃孵育過(guò)夜。次日,用TBST洗滌膜3次,每次10分鐘,然后加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗,室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌膜3次后,使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯色,通過(guò)ImageJ軟件分析條帶灰度值,以β-actin作為內(nèi)參,計(jì)算各標(biāo)志物的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示,與野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比,IDH1突變型細(xì)胞中E-cadherin的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),而N-cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)水平則顯著升高(P<0.05)。這表明IDH1突變導(dǎo)致了膠質(zhì)瘤細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào),間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin表達(dá)上調(diào),提示IDH1突變可能誘導(dǎo)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果。將IDH1突變型和野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中,培養(yǎng)24小時(shí)后,用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘,然后用0.1%TritonX-100破膜5分鐘。用5%BSA封閉30分鐘后,分別加入兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗體作為一抗,4℃孵育過(guò)夜。次日,用PBS洗滌細(xì)胞3次,每次5分鐘,然后加入AlexaFluor488或AlexaFluor594標(biāo)記的山羊抗兔二抗,室溫避光孵育1小時(shí)。再次用PBS洗滌細(xì)胞3次后,用DAPI染核5分鐘,最后用抗熒光淬滅封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察并拍照,通過(guò)ImageJ軟件分析熒光強(qiáng)度,以評(píng)估各標(biāo)志物的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,在野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,E-cadherin呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),主要分布在細(xì)胞膜上,形成清晰的細(xì)胞邊界;而在IDH1突變型細(xì)胞中,E-cadherin的熒光強(qiáng)度明顯減弱,細(xì)胞膜上的表達(dá)減少。相反,N-cadherin和Vimentin在野生型細(xì)胞中表達(dá)較弱,而在IDH1突變型細(xì)胞中表達(dá)顯著增強(qiáng),呈現(xiàn)出明顯的絲狀結(jié)構(gòu),分布于細(xì)胞質(zhì)中。這一結(jié)果與Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,進(jìn)一步證實(shí)了IDH1突變促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的改變,誘導(dǎo)了細(xì)胞發(fā)生EMT。為了明確IDH1突變對(duì)EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響是否具有特異性,本研究還檢測(cè)了其他上皮標(biāo)志物(如細(xì)胞角蛋白)和間充質(zhì)標(biāo)志物(如纖連蛋白)的表達(dá)。結(jié)果顯示,在IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,細(xì)胞角蛋白的表達(dá)水平顯著降低,而纖連蛋白的表達(dá)水平顯著升高,與E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)變化趨勢(shì)一致。這表明IDH1突變對(duì)EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響具有一定的普遍性,進(jìn)一步支持了IDH1突變誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的觀點(diǎn)。綜上所述,本研究通過(guò)Westernblot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí),IDH1突變導(dǎo)致了膠質(zhì)瘤細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的顯著改變,誘導(dǎo)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT,為進(jìn)一步研究IDH1突變通過(guò)EMT促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為的機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.3IDH1突變對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響為探究IDH1突變對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響,以及其與EMT的關(guān)聯(lián),本研究運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)展開(kāi)深入分析。在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中,將IDH1突變型和野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別接種于Transwell小室的上室,下室加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基作為趨化因子。經(jīng)過(guò)24小時(shí)的培養(yǎng)后,取出小室,對(duì)遷移到下室的細(xì)胞進(jìn)行固定和染色。在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),結(jié)果顯示,野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移到下室的平均細(xì)胞數(shù)為[X]個(gè),而IDH1突變型細(xì)胞遷移到下室的平均細(xì)胞數(shù)僅為[X]個(gè),二者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這表明IDH1突變顯著抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力。在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中,預(yù)先在Transwell小室的上室包被Matrigel基質(zhì)膠,模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)。將IDH1突變型和野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于上室,下室加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時(shí)后,對(duì)侵襲到下室的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色和計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示,野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲到下室的平均細(xì)胞數(shù)為[X]個(gè),IDH1突變型細(xì)胞侵襲到下室的平均細(xì)胞數(shù)為[X]個(gè),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這進(jìn)一步證實(shí)了IDH1突變降低了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。劃痕實(shí)驗(yàn)同樣驗(yàn)證了上述結(jié)果。將IDH1突變型和野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞融合至80%-90%時(shí),用無(wú)菌槍頭在細(xì)胞單層上劃一條直線,形成劃痕。隨后用PBS沖洗細(xì)胞,去除劃下的細(xì)胞,加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后的0小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí),在倒置顯微鏡下觀察并拍照,測(cè)量劃痕寬度。結(jié)果顯示,在0小時(shí)時(shí),兩組細(xì)胞的劃痕寬度無(wú)明顯差異;在24小時(shí)和48小時(shí),野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞的劃痕寬度明顯小于IDH1突變型細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這表明野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力更強(qiáng),能夠更快地愈合劃痕,而IDH1突變抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力,導(dǎo)致劃痕愈合緩慢。為了明確IDH1突變對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響是否與EMT相關(guān),本研究檢測(cè)了EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)與細(xì)胞遷移、侵襲能力之間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),E-cadherin的表達(dá)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-[X],P<0.05),即E-cadherin表達(dá)越高,細(xì)胞的遷移和侵襲能力越弱;N-cadherin和Vimentin的表達(dá)與細(xì)胞遷移和侵襲能力呈顯著正相關(guān)(r=[X],P<0.05;r=[X],P<0.05),即N-cadherin和Vimentin表達(dá)越高,細(xì)胞的遷移和侵襲能力越強(qiáng)。這表明IDH1突變通過(guò)調(diào)節(jié)EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá),影響了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。綜上所述,本研究通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí),IDH1突變顯著抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力,且這種抑制作用與EMT相關(guān),IDH1突變可能通過(guò)誘導(dǎo)EMT,改變EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá),進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這一結(jié)果為深入理解IDH1突變促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為的機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.4阻斷EMT對(duì)IDH1突變膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性行為的影響為了進(jìn)一步明確EMT在IDH1突變促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為中的介導(dǎo)作用,本研究采用EMT抑制劑LY2109761和RNA干擾技術(shù),對(duì)IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程進(jìn)行阻斷,然后檢測(cè)細(xì)胞在增殖、凋亡、遷移、侵襲等方面的能力變化,以此研究阻斷EMT對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞分為三組:對(duì)照組、LY2109761處理組和RNA干擾組。對(duì)照組不做任何處理;LY2109761處理組加入終濃度為[X]μM的LY2109761進(jìn)行處理;RNA干擾組則轉(zhuǎn)染針對(duì)EMT關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail的siRNA,以干擾Snail的表達(dá),從而阻斷EMT進(jìn)程。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中,采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示,LY2109761處理組和RNA干擾組的細(xì)胞增殖速度明顯低于對(duì)照組,在培養(yǎng)的第1-5天,LY2109761處理組和RNA干擾組的吸光度值(OD值)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。這表明阻斷EMT抑制了IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力。EdU染色實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果,LY2109761處理組和RNA干擾組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明阻斷EMT減少了細(xì)胞的DNA合成和增殖。研究認(rèn)為,EMT過(guò)程中激活的信號(hào)通路可以促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá),阻斷EMT后,這些信號(hào)通路被抑制,從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制。本研究中,阻斷EMT對(duì)IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用,可能與EMT相關(guān)信號(hào)通路的阻斷有關(guān)。在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),LY2109761處理組和RNA干擾組的細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。這表明阻斷EMT促進(jìn)了IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)LY2109761處理組和RNA干擾組中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著上調(diào),而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。這一結(jié)果提示,阻斷EMT可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),誘導(dǎo)IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。研究表明,EMT相關(guān)信號(hào)通路可以抑制細(xì)胞凋亡,阻斷EMT后,這種抑制作用被解除,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。本研究中,阻斷EMT導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡增加,可能與EMT相關(guān)信號(hào)通路對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。細(xì)胞遷移和侵襲能力是評(píng)估腫瘤細(xì)胞惡性程度的重要指標(biāo)。通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),LY2109761處理組和RNA干擾組穿過(guò)Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)量顯著少于對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明阻斷EMT明顯抑制了IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在侵襲實(shí)驗(yàn)中,在Transwell小室的上室加入Matrigel基質(zhì)膠模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì),結(jié)果同樣顯示LY2109761處理組和RNA干擾組穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)。這一結(jié)果表明,阻斷EMT不僅影響了IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力,還降低了其侵襲細(xì)胞外基質(zhì)的能力。有研究認(rèn)為,EMT過(guò)程中上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào),細(xì)胞間黏附力降低,而間充質(zhì)標(biāo)志物如N-鈣黏蛋白、波形蛋白等表達(dá)上調(diào),這些變化使得細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。阻斷EMT后,上皮標(biāo)志物表達(dá)上調(diào),間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)下調(diào),細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到抑制。本研究結(jié)果為這一觀點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。為了研究阻斷EMT對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響,本研究構(gòu)建了裸鼠皮下移植瘤模型。將IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞及經(jīng)過(guò)EMT阻斷處理的細(xì)胞分別接種到裸鼠皮下,每組接種[X]只裸鼠。定期觀察裸鼠的行為狀態(tài)、體重變化等,并通過(guò)小動(dòng)物活體成像技術(shù)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示,接種經(jīng)過(guò)EMT阻斷處理細(xì)胞的裸鼠腫瘤生長(zhǎng)速度明顯慢于對(duì)照組,腫瘤體積和重量均顯著小于對(duì)照組(P<0.05)。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處,處死裸鼠,取出腫瘤組織進(jìn)行病理切片分析,發(fā)現(xiàn)接種經(jīng)過(guò)EMT阻斷處理細(xì)胞的裸鼠腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著少于對(duì)照組(P<0.05)。這表明阻斷EMT抑制了IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。綜上所述,本研究通過(guò)使用EMT抑制劑和RNA干擾技術(shù)阻斷EMT,發(fā)現(xiàn)阻斷EMT能夠顯著抑制IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并且抑制了腫瘤在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了EMT在IDH1突變促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為中的介導(dǎo)作用,為膠質(zhì)瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。4.5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IDH1突變通過(guò)EMT促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為為了進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證IDH1突變通過(guò)EMT促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為的機(jī)制,本研究構(gòu)建了IDH1突變膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型,并對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行了詳細(xì)觀察,同時(shí)分析了EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá),以及阻斷EMT對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。選取4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠30只,隨機(jī)分為3組,每組10只。分別為對(duì)照組(接種野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞)、IDH1突變組(接種IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞)、IDH1突變+EMT抑制劑組(接種IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞并給予EMT抑制劑LY2109761處理)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞用PBS洗滌2次,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。在裸鼠顱內(nèi)接種腫瘤細(xì)胞,具體操作如下:將裸鼠用1%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉后,固定于立體定位儀上,頭部皮膚消毒,在顱骨上鉆一小孔,用微量注射器將5μL細(xì)胞懸液緩慢注入右側(cè)紋狀體(前囟前0.2mm,中線旁3.0mm,硬膜下3.0mm)。術(shù)后密切觀察裸鼠的行為狀態(tài)和體重變化。IDH1突變+EMT抑制劑組的裸鼠在接種細(xì)胞后第3天開(kāi)始,腹腔注射LY2109761(10mg/kg,溶于DMSO中,用生理鹽水稀釋至所需濃度),每周注射5次,持續(xù)3周;對(duì)照組和IDH1突變組的裸鼠腹腔注射等量的生理鹽水。通過(guò)小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況。在接種細(xì)胞后第7天開(kāi)始,每周對(duì)裸鼠進(jìn)行一次活體成像,觀察腫瘤的大小和位置變化。結(jié)果顯示,IDH1突變組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯快于對(duì)照組,腫瘤體積和重量均顯著大于對(duì)照組(P<0.05)。而IDH1突變+EMT抑制劑組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯慢于IDH1突變組,腫瘤體積和重量均顯著小于IDH1突變組(P<0.05)。這表明IDH1突變促進(jìn)了膠質(zhì)瘤在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng),而阻斷EMT則抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處,將裸鼠處死,取出腫瘤組織,進(jìn)行病理切片分析,觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移情況,并檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),IDH1突變組裸鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著多于對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明IDH1突變促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移。而IDH1突變+EMT抑制劑組裸鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著少于IDH1突變組(P<0.05),表明阻斷EMT抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移。通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá),結(jié)果顯示,IDH1突變組腫瘤組織中E-cadherin的表達(dá)顯著低于對(duì)照組,N-cadherin和Vimentin的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05),這與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,進(jìn)一步證實(shí)了IDH1突變誘導(dǎo)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。而在IDH1突變+EMT抑制劑組腫瘤組織中,E-cadherin的表達(dá)顯著高于IDH1突變組,N-cadherin和Vimentin的表達(dá)顯著低于IDH1突變組(P<0.05),說(shuō)明阻斷EMT逆轉(zhuǎn)了IDH1突變誘導(dǎo)的EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)變化。綜上所述,本研究通過(guò)構(gòu)建IDH1突變膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型,在體內(nèi)驗(yàn)證了IDH1突變通過(guò)EMT促進(jìn)膠質(zhì)瘤的惡性行為,包括促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,而阻斷EMT則能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。這一結(jié)果為深入理解IDH1突變?cè)谀z質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為膠質(zhì)瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)和理論支持。五、IDH1突變通過(guò)EMT促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為的分子機(jī)制探討5.1IDH1突變影響EMT相關(guān)信號(hào)通路的激活為深入探究IDH1突變通過(guò)EMT促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為的分子機(jī)制,本研究重點(diǎn)研究了IDH1突變對(duì)TGF-β、Wnt、Notch等信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)和活性的影響,分析其在EMT中的作用。在TGF-β信號(hào)通路中,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡法(Westernblot)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比,IDH1突變型細(xì)胞中TGF-β1、TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)。進(jìn)一步檢測(cè)下游Smad蛋白的磷酸化水平,結(jié)果顯示IDH1突變型細(xì)胞中p-Smad2/3的蛋白表達(dá)水平明顯升高,而總Smad2/3的表達(dá)無(wú)明顯變化(P<0.05)。這表明IDH1突變激活了TGF-β/Smad信號(hào)通路。為了驗(yàn)證TGF-β信號(hào)通路在IDH1突變誘導(dǎo)EMT中的作用,使用TGF-β受體抑制劑SB431542處理IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)抑制劑處理后,細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)顯著上調(diào),N-cadherin和Vimentin的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),細(xì)胞的遷移和侵襲能力也明顯受到抑制(P<0.05)。這說(shuō)明TGF-β信號(hào)通路在IDH1突變誘導(dǎo)的EMT過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,IDH1突變可能通過(guò)激活TGF-β/Smad信號(hào)通路,上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá),下調(diào)上皮標(biāo)志物的表達(dá),從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。在Wnt信號(hào)通路中,研究發(fā)現(xiàn)IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Wnt3a、Frizzled-7等Wnt信號(hào)通路配體和受體的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。同時(shí),細(xì)胞中β-catenin的蛋白表達(dá)水平明顯增加,且β-catenin在細(xì)胞核中的積累也顯著增多(P<0.05),這表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Wnt信號(hào)通路的作用,使用Wnt信號(hào)通路抑制劑XAV939處理IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞。結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)抑制劑處理后,細(xì)胞中β-catenin的核轉(zhuǎn)位受到抑制,E-cadherin的表達(dá)上調(diào),N-cadherin和Vimentin的表達(dá)下調(diào)(P<0.05),細(xì)胞的遷移和侵襲能力也顯著降低(P<0.05)。這說(shuō)明Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與了IDH1突變誘導(dǎo)的EMT過(guò)程,IDH1突變可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,促進(jìn)β-catenin的核轉(zhuǎn)位,進(jìn)而調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。在Notch信號(hào)通路中,檢測(cè)結(jié)果顯示IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Notch1、Jagged1等Notch信號(hào)通路相關(guān)分子的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于野生型細(xì)胞(P<0.05)。同時(shí),細(xì)胞中NICD的蛋白表達(dá)水平明顯升高,Hes1、Hey1等下游靶基因的表達(dá)也顯著上調(diào)(P<0.05),這表明Notch信號(hào)通路被激活。為了驗(yàn)證Notch信號(hào)通路在IDH1突變誘導(dǎo)EMT中的作用,使用γ-分泌酶抑制劑DAPT處理IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞,抑制Notch信號(hào)通路的激活。結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)抑制劑處理后,細(xì)胞中NICD的表達(dá)降低,Hes1、Hey1的表達(dá)下調(diào),E-cadherin的表達(dá)上調(diào),N-cadherin和Vimentin的表達(dá)下調(diào)(P<0.05),細(xì)胞的遷移和侵襲能力也明顯下降(P<0.05)。這說(shuō)明Notch信號(hào)通路在IDH1突變誘導(dǎo)的EMT過(guò)程中發(fā)揮重要作用,IDH1突變可能通過(guò)激活Notch信號(hào)通路,促進(jìn)NICD的產(chǎn)生和下游靶基因的表達(dá),從而誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。綜上所述,本研究表明IDH1突變通過(guò)激活TGF-β、Wnt、Notch等信號(hào)通路,影響這些信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)和活性,進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT,為深入理解IDH1突變通過(guò)EMT促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為的分子機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。5.2IDH1突變與EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控關(guān)系在明確IDH1突變對(duì)EMT相關(guān)信號(hào)通路激活的影響后,進(jìn)一步探究其與EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控關(guān)系。通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),將含有Snail、ZEB1、Twist等轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子區(qū)域的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至IDH1突變型和野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞中。結(jié)果顯示,在IDH1突變型細(xì)胞中,Snail、ZEB1、Twist的熒光素酶活性顯著高于野生型細(xì)胞(P<0.05),表明IDH1突變促進(jìn)了這些轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活。采用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證IDH1與這些轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),IDH1能夠與Snail、ZEB1、Twist的啟動(dòng)子區(qū)域直接結(jié)合,且在IDH1突變型細(xì)胞中,這種結(jié)合能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)。這說(shuō)明IDH1突變可能通過(guò)直接結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子區(qū)域,促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。為了進(jìn)一步明確IDH1突變對(duì)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響,利用RNA干擾技術(shù),分別干擾IDH1突變型和野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞中IDH1的表達(dá),然后檢測(cè)Snail、ZEB1、Twist的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示,干擾IDH1表達(dá)后,IDH1突變型細(xì)胞中Snail、ZEB1、Twist的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05),而野生型細(xì)胞中變化不明顯。這表明IDH1突變對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)調(diào)控具有特異性,依賴(lài)于IDH1的表達(dá)。為了探究IDH1突變是否通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子來(lái)影響EMT相關(guān)基因的表達(dá),在IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,分別過(guò)表達(dá)和干擾Snail、ZEB1、Twist,然后檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)Snail、ZEB1、Twist后,E-cadherin的表達(dá)顯著下調(diào),N-cadherin和Vimentin的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng);而干擾Snail、ZEB1、Twist后,E-cadherin的表達(dá)上調(diào),N-cadherin和Vimentin的表達(dá)下調(diào)(P<0.05),細(xì)胞的遷移和侵襲能力降低。這說(shuō)明IDH1突變通過(guò)調(diào)控Snail、ZEB1、Twist等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),影響EMT相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT和惡性行為。綜上所述,本研究表明IDH1突變通過(guò)與Snail、ZEB1、Twist等EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄表達(dá),進(jìn)而調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá),在IDH1突變通過(guò)EMT促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。5.3下游效應(yīng)分子在IDH1突變促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為中的作用在明確IDH1突變對(duì)EMT相關(guān)信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用后,進(jìn)一步探究下游效應(yīng)分子在IDH1突變促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為中的作用?;|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族是一類(lèi)鋅依賴(lài)性的內(nèi)肽酶,在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解和重塑中發(fā)揮關(guān)鍵作用,與腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),在IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,MMP2、MMP9等MMPs家族成員的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。通過(guò)明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MMP2、MMP9的活性,結(jié)果顯示IDH1突變型細(xì)胞中MMP2、MMP9的酶活性明顯增強(qiáng)(P<0.05)。為了驗(yàn)證MMPs在IDH1突變促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲中的作用,使用MMPs抑制劑GM6001處理IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)抑制劑處理后,細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.05),表明MMPs在IDH1突變促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用,IDH1突變可能通過(guò)上調(diào)MMPs的表達(dá)和活性,促進(jìn)ECM的降解,從而增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子,在腫瘤血管生成中起著關(guān)鍵作用。研究檢測(cè)了IDH1突變型和野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞中VEGF的表達(dá)水平,結(jié)果顯示IDH1突變型細(xì)胞中VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于野生型細(xì)胞(P<0.05)。為了探究VEGF在IDH1突變促進(jìn)膠質(zhì)瘤血管生成中的作用,將IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種到裸鼠皮下,同時(shí)給予抗VEGF抗體進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),給予抗VEGF抗體后,腫瘤組織中的微血管密度顯著降低(P<0.05),腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制(P<0.05)。這表明VEGF在IDH1突變促進(jìn)膠質(zhì)瘤血管生成中發(fā)揮重要作用,IDH1突變可能通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá),促進(jìn)腫瘤血管生成,為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣。此外,研究還發(fā)現(xiàn)其他下游效應(yīng)分子如趨化因子、細(xì)胞黏附分子等也在IDH1突變促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性行為中發(fā)揮一定作用。趨化因子如CXCL12、CCL2等可以招募免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。細(xì)胞黏附分子如整合素、鈣黏蛋白等參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與ECM之間的黏附,影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,CXCL12、CCL2等趨化因子的表達(dá)顯著上調(diào),整合素

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