微生物學實驗教案

微生物學實驗教案

PanzhihuaUniversity

教案

2011—2012學年度第一學期

課程名稱微生物學實驗

學時(學分)22(L5)

適用班級2010級生物工程班

授課教師慕嵐

教師職務講師

教學單位生物與化學工程學院

教務處制

實驗教案編寫說明

1、實驗教案的編寫要求參照《攀枝花學院教案編寫規(guī)范》（攀院教

[2007]04號）執(zhí)行。

2、實驗教案格式可按附后“實驗教案”格式使用手寫或者打印。

3、實驗教案的基本內(nèi)容可包含：教學目的與要求、教學重點與難點、

儀器設備及用具、教學過程（含①實驗預習檢查②實驗原理及方法③

儀器設備介紹④實驗內(nèi)容及注意事項⑤實驗指導要點⑥檢查實驗結(jié)

果）、實驗預做記錄（含①原始實驗數(shù)據(jù)記錄②數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析）、

實驗預習要求、實驗報告要求、參考書目、后記等有關(guān)內(nèi)容。

4、實驗教案編寫應在堅持教案編寫基本要求的基礎(chǔ)上，充分考慮教

師自身條件與學科的差異，針對教師、學科、學生與教學情景的不一

致，編寫出形式多樣，能表達教學風格、具有特色的教案，促進教案

的創(chuàng)新。

5、教案編寫水平的高低，很大程度上取決于教師鉆研教材與實驗方

法，研究學生實際狀況與設計教學方法的水平，取決于教師對本學科

知識掌握的深度與廣度與教師教育思想的端正更新。因此，教師應努

力提高自身素養(yǎng)，提高教師教案編寫水平。

實驗教案

J獨立設課

實驗課程名稱微生物學實驗實驗學時22

口非獨立設課

實驗課類別1.基礎(chǔ)口2.專業(yè)基礎(chǔ)J3.專業(yè)口4.其它口

任課教師曹慕嵐職稱講師

，本科

授課對象年級：2010級專業(yè)：生物工程班級：

口?？?/p>

教材：

沈萍等主編.微生物學實驗[M].高等教育出版社.2006年.

教材

要緊參考資料：

與

1、焦瑞身，周德慶主編.微生物生理代謝實驗技術(shù).科學出版社.

要緊參考資料

2、范秀容，李廣武.微生物學實驗（第二版）.高等教育出版社

3、周德慶.微生物學實驗手冊.上?？茖W技術(shù)出版社.

教學目的與掌握顯微技術(shù)、接種技術(shù)、滅菌技術(shù)、菌種培養(yǎng)與保臧等方面的基本概

教學要求念、基本理論與基本技能，為今后學習專業(yè)方向課奠定必要的基礎(chǔ)。

教學重點與重點：各類微生物學的基本實踐技術(shù)

教學難點難點：各類微生物學的基本實踐技術(shù)

教學進程安排

課次實驗項目（實驗內(nèi)容）學時備注

1顯微鏡使用、細菌簡單染色及革蘭氏染色實驗4

2放線菌、霉菌形態(tài)觀察實驗4

3酵母菌形態(tài)觀察與大小測定實驗4

4細菌培養(yǎng)基配制細菌的培養(yǎng)實驗6

5實驗考試4

實驗教案

課題（項目）名稱：顯微鏡使用、細菌簡單染色及革蘭氏染色計劃學時：4

實驗類型：1.演示性口2.驗證性V3.綜合性口4.設計性口5.其它口

授課日期：2012年4月3日第二周星期二第5/6/7/8節(jié)

實驗一顯微鏡使用、細菌簡單染色及革蘭氏染色

一、目的要求

1、學習并掌握油鏡的原理與使用方法

2、復習普通臺式顯微鏡的結(jié)構(gòu)、各部分的功能與使用方法

3、學習微生物涂片、染色的基本技術(shù)

4、掌握細菌的簡單染色法

5、初步認識細菌的形態(tài)特征

6、鞏固顯微鏡（油鏡）的使用方法與無菌操作技術(shù)

7、學習并初步掌握革蘭氏染色法

8、熟悉革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性

二、基本原理

1、顯微鏡的工作原理：

普通光學顯微鏡是一種精密的光學儀器。以往最簡單的顯微鏡僅由兒塊透鏡構(gòu)成，而當前

使用的顯微鏡由一套透鏡構(gòu)成，普通光學顯微鏡通常能將物體放大1500—2000倍。普通光學顯

微鏡的構(gòu)造可分為兩大部分：一為機械裝置，一為光學系統(tǒng)。在顯微鏡的光學系統(tǒng)中物鏡的性

能直接影響顯微鏡的分辨率。

2、細菌簡單染色及革蘭氏染色的基本原理：

用于生物染色的染料要緊有堿性染料、酸性染料與中性染料三大類。堿性染料的離子帶正

電荷，能與帶負電荷的物質(zhì)結(jié)合。因細菌蛋白質(zhì)等電點較低，當它生長于中性、堿性或者弱酸

性的溶液中經(jīng)常帶負電荷，因比通常使用堿性染料（如美藍、結(jié)晶紫、堿性復紅或者孔雀綠等）

使其著色。酸性染料的離子帶負電荷，能與帶止電荷的物質(zhì)結(jié)合。當細菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)

基四下降時，細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復紅或者剛果紅等酸性染料著色。中

性染料是前兩者的結(jié)合物乂稱復合染料，如伊紅美藍、伊紅天青等。

簡單染色法是只用一種染料使細菌著色以顯示其形態(tài)，簡單染色不能辨別細菌細胞的構(gòu)造。

革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細菌

區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）與革蘭氏陰性菌（G-）兩大類，是細菌學上最常用的鑒別染色法。

該染色法因此能將細菌分為G+菌與G—菌，是由這兩類菌的細胞壁結(jié)構(gòu)與成分的不一致所決定

的。G-菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙

醇或者丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì)，增加了細胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫與碘的復合物易于

滲出，結(jié)果細菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復染后就成紅色。G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，

類脂質(zhì)

含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的

顏色。

三、器材

1、活材料：

培養(yǎng)12T6h枯草桿菌（Bacillussubtilis）

2、染色液與試劑：

結(jié)晶紫（附二、（一）、3）、盧哥氏碘液（附二、（一）、4）、95%酒精、蕃紅（附二、（一）、

5）、復紅（附二（一）、2）、二甲苯、香柏油

3、器材：

廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡

四、操作步驟

1、顯微鏡的使用

（1）觀察前的準備

1）顯微鏡從顯微鏡柜或者鏡箱內(nèi)拿出時，要用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩(wěn)地將顯

微鏡搬運到實驗桌上。

2）將顯微鏡放在自己身體的左前方，離桌子邊緣約10cm左右，右側(cè)可放記錄本或者繪圖

紙。

3）調(diào)節(jié)光照不帶光源的顯微鏡，可利用燈光或者自然光通過反光鏡來調(diào)節(jié)光照，但不能

用直射陽光，直射陽光會影響物像的清晰并刺激眼睛。

將10X物鏡轉(zhuǎn)入光孔，將聚光器上的虹彩光圈打開到最大位置，用左眼觀察目鏡中視野的

亮度，轉(zhuǎn)動反光鏡，使視野的光照達到最明亮最均勻為止。光線較強時，用平面反光鏡，光線

較弱時，用凹面反光鏡。自帶光源的顯微鏡，可通過調(diào)節(jié)電流旋鈕來調(diào)節(jié)光照強弱，

4）調(diào)節(jié)光軸中心顯微鏡在觀察時，其光學系統(tǒng)中的光源、聚光器、物鏡與目鏡的光軸及

光闌的中心務必跟顯微鏡的光軸同在一直線上。帶視場光闌的顯微鏡，先將光闌縮小，用WX

物鏡觀察，在視場內(nèi)可見到視場光闌圓球多邊形的輪廓像，如此像不在視場中央，可利用聚光

器外側(cè)的兩個調(diào)整旋鈕將其調(diào)到中央，然后緩慢地將視場光闌打開，能看到光束向視場周緣均

勻展開直至視場光闌的輪廓像完全與視場邊緣內(nèi)接，說明光線己經(jīng)合軸。

（2）低倍鏡觀察

鏡檢任何標本都要養(yǎng)成務必先用低倍鏡觀察的習慣。由于低倍鏡視野較大，易于發(fā)現(xiàn)目標

與確定檢查的位置。

將標本片放置在載物臺上，用標本夾夾住，移動推動器，使被觀察的標本處在物鏡正下方,

轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)旋鈕，使物鏡調(diào)至接近標本處，用目鏡觀察并同時用粗調(diào)節(jié)旋鈕慢慢升起鏡筒（或

者下降載物臺），直至物像出現(xiàn)，再用細調(diào)節(jié)旋鈕使物像清晰為止。用推動器移動標本片，找

到合適的目的像并將它移到視野中央進行觀察。

（3）高倍鏡觀察

在低倍物鏡觀察的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)換高倍物鏡。較好的顯微鏡，低倍、高倍鏡頭是同焦的，在正

常情況下，高倍物鏡的轉(zhuǎn)換不應碰到載玻片或者其上的蓋玻片。若使用不一致型號的物鏡，在

轉(zhuǎn)換物鏡時要從側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后從目鏡觀察，調(diào)節(jié)光照，使亮度適中，

緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)旋鈕，使載物臺上升（或者鏡筒下降），直至物像出現(xiàn)，再用細調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至

物像清晰為止，找到需觀察的部位，并移至視野中央進行觀察。

（4）油鏡觀察

油浸物鏡的工作距離（指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離）很短，通常在0.2mm

以內(nèi)，再加上通常光學顯微鏡的油浸物鏡沒有“彈簧裝置”，因此使用油浸物鏡時要特別細心,

避免由于“調(diào)焦”不慎而壓碎標本片并使物鏡受損。

使用油鏡按下列步驟操作：

1）先用粗調(diào)節(jié)旋鈕將鏡筒提升（或者將載物臺下降）約2cm,并將高倍鏡轉(zhuǎn)出。

2）在玻片標本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。

3）從側(cè)面凝視，用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺緩緩地上升，（或者鏡筒下降），使油浸物鏡浸入香柏

油中，使鏡頭幾乎與標本接觸，

4）從接目鏡內(nèi)觀察，放大視場光闌及聚光鏡上的虹彩光圈（帶視場光闌油鏡開大視場光闌），

上調(diào)聚光器，使光線充分照明，用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺徐徐下降（或者鏡筒上升），當出現(xiàn)物

像一閃后改用細調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至最清晰為止。如油鏡已離開油面而仍未見到物象，務必再從側(cè)面

觀察，重復上述操作。

5）觀察完畢，下降載物臺，將油鏡頭轉(zhuǎn)出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許乙

酸酒精混合液（乙醛2份，純酒精3份）或者二甲苯，擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙

擦拭2—3下即可，（注意向一個方向擦拭）。

6）將各部分還原，轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使物鏡頭不與載物臺通光孔相對，而是成八字形位置，再

將鏡筒下降至最低，降下聚光器，反光鏡與聚光器垂直，用一個干凈手帕將接目鏡罩好，以免

目鏡頭沾污灰塵。最后用柔軟紗布清潔載物臺等機械部分，然后將顯微鏡放回柜內(nèi)或者鏡箱中。

2、簡單染色：

（1）涂片：取干凈載玻片一塊，在載玻片的左、右各加一滴蒸鐳水，按無菌操作法取菌涂片，

左邊涂蘇云金桿菌，右邊涂大揚桿菌，做成濃菌液。再取干凈載玻片一塊將剛制成的蘇云金桿

菌濃菌液挑2-3環(huán)涂在左邊制成薄的涂面，將大腸桿菌的濃菌液取2-3環(huán)涂在右邊制成薄涂面。

亦可直接在載玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。

（2）晾干：讓涂片自然晾干或者者在酒精燈火焰上方文火烘干。

（3）固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜）

（4）染色：將固定過的涂片放在廢液缸上的擱架上，加復紅染色l-2min0

（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液

（6）干燥：將洗過的涂片放在空氣中晾干或者用吸水紙吸干。

（7）鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏

油一滴，將油鏡頭浸入油滴中認真調(diào)焦觀察細菌的形態(tài)“

3、革蘭氏染色：

（1）涂片：涂片方法與簡單染色涂片相同。

（2）晾干：與簡單染色法相同。

（3）固定，與簡單染色法相同

（4）結(jié)晶紫色染色：將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量（以蓋滿細菌涂面）的結(jié)晶紫染色

液染色1分鐘。

（5）水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。

（6）媒染:滴加盧哥氏碘液,媒染bnin。

（7）水洗：用水洗去碘液。

（8）脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色20—25s至流出液無色，立即水洗。

（9）復染：滴加蕃紅復染5min。

（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃紅染色液。

（11）晾干：將染好的涂片放空氣中晾干或者者用吸水紙吸干。

（12）鏡檢：鏡檢時先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并推斷菌體的革蘭氏染色反應性。

（13）實驗完畢后的處理：

①將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈，a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少

許二甲苯將鏡頭擦2—3次。c,再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2—3次。注意擦鏡頭時向一個方向

擦拭。

②看后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干凈。

五、實驗報告

給出菌的形態(tài)圖，并注明菌的單蘭氏染色的反應性。

六、注意事項

1.搬動顯微鏡時，要一手握鏡臂，一手扶鏡座，兩上臂緊靠胸壁。切勿一手斜提，前后擺動，

以防鏡頭或者其他零件跌落。

2.觀察標本時，顯微鏡離實驗臺邊緣應保持一定距離（5cm）,以免顯微鏡翻倒落地。鏡柱與鏡臂

間的傾斜角度不得超過45度，用完立即還原。

3.使用時要嚴格按步驟操作，熟悉顯微鏡各部件性能，掌握粗、細調(diào)節(jié)鈕的轉(zhuǎn)動方向與鏡筒升

降關(guān)系。轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)鈕向下時，眼睛務必凝視物鏡頭，

4.觀察帶有液體的臨時標本時要加蓋片，不能使用傾斜關(guān)節(jié)，以免液體污染鏡頭與顯微鏡。

5.粗、細調(diào)節(jié)鈕要配合使用，細調(diào)節(jié)鈕不能單方向過度旋轉(zhuǎn)，調(diào)節(jié)焦距時，要從側(cè)面凝視鏡筒

下降，以免壓壞標本與鏡頭。

6.用單筒顯微鏡觀察標本，應雙眼同時睜開，左眼觀察物像，右眼用以繪圖，左手調(diào)節(jié)焦距，

右手移動標本或者繪圖。

7.禁止隨意擰開或者調(diào)換目鏡、物鏡與聚光器等零件v

8.顯微鏡光學部件有污垢，可用擦鏡紙或者綢布擦凈，刃勿用手指、粗紙或者手帕去擦，以防

損壞鏡面。

9.凡有腐蝕性與揮發(fā)性的化學試劑與藥品，如碘、乙醇溶液、酸類、堿類等都不可與顯微鏡接

觸，如不慎污染時，應立即擦干凈。不要任意取下目鏡，防備灰塵落入鏡筒。

10.使用油鏡觀察樣品后，隨即用二甲苯將油鏡鏡頭與載波片擦凈，以防其他的物鏡玻璃上沾

上香柏油。二甲苯有毒，使用后馬上洗手。

11.實驗完畢，要將玻片取出，用擦鏡紙將鏡頭擦拭干凈后移開，不能與通光孔相對。用綢布

包好，放回鏡箱。切不可把顯微鏡放在直射光線下曝曬。

12.革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌;

如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄及

乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴格規(guī)定。

13.染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應吸去織片上的殘水，以免染色液被稀釋而影

響染色效果。

14.選用幼齡的細菌。G十菌培養(yǎng)12h-16h,E.coli培養(yǎng)24h。若菌齡太老，由于菌體死亡或者自

溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應。

七、思考題

1、為什么要求制片完全干燥后才能使用油鏡？

2、假如你的涂片未經(jīng)熱固定，將會出現(xiàn)什么問題？假如加熱溫度過高、時間太長，又會如何呢？

實驗教案

課題（項目）名稱：放線菌、霉菌形態(tài)觀察計劃學時：4

實驗類型：1.演示性口2.驗證性V3.綜合性口4.設計性口5.其它口

授課日期：2012年4月10日第2周星期二第5/6/7/8節(jié)

實驗二放線菌、霉菌形態(tài)觀察

一、目的與要求

1、學習并掌握觀察放線菌、霉菌形態(tài)的基本方法

2、初步熟悉放線菌及四種常見霉菌的基本形態(tài)特征

二、基本原理

1、放線菌形態(tài)觀察

放線菌自然生長的個體形態(tài)的觀察現(xiàn)多用玻璃紙瓊脂透析培養(yǎng)法。

玻璃紙具有半透膜特性，其透光性與載玻片基本相同，使用玻璃紙瓊脂平板透析培養(yǎng)，能

使放線菌生長在玻璃紙上，然后將長菌的玻璃紙剪取小片，貼放在載玻片上，用顯微鏡鏡檢可

見到放線菌自然生長的個體形態(tài)。

使用插片培養(yǎng)法也能觀察放線菌的個體形態(tài)。

2、霉菌形態(tài)觀察

霉菌的營養(yǎng)體是分枝的絲狀體。其個體比細菌與放線菌大得多，分為基內(nèi)菌絲與氣生菌絲。

氣生菌絲中又可分化出繁殖絲，不一致霉菌的繁殖菌絲能夠形成不一致的抱子。

霉菌菌絲較粗大，細胞易收縮變形，且抱子容易飛散，因此制標本經(jīng)常用乳酸石炭酸棉藍

染色液。此染色液制成的霉菌標本片的特點是：細胞不變形，具有殺菌防腐作用，且不易干燥,

能保持較長時間，溶液本身呈藍色，有一定染色效果。

利用培養(yǎng)在玻璃紙上的霉菌作為觀察材料，能夠得到清晰、完整、保持自然狀態(tài)的霉菌形

態(tài)；也能夠直接挑取生長在平板中的霉菌菌體制水浸片觀察。

三、器材

1、活材料：

培養(yǎng)5-7天的紫色直絲鏈霉菌(Streptomycesviolaceorectus)的斜面菌種、吸水鏈霉菌

5102(Streptomyceshygroscopicusvar.Yingchengensis(5102))斜面菌種；在馬鈴薯瓊脂平

板上或者用玻璃紙透析培養(yǎng)法培養(yǎng)3—4天的根霉(Rhizpussp.)、青霉(Penicillumsp.)、

曲霉(.Aspergillussp.)。

2、培養(yǎng)基：

高氏一號瓊脂培養(yǎng)基(見附錄一、10)

3、染色液與試劑：

乳酸石炭酸棉藍染色液(附錄二、(一)、10)、50%酒精(V/V)。

4、器材：

剪刀、鎰子、載玻片、蓋玻片、解剖針、顯微鏡、無菌平皿、玻璃紙、9ml無菌水若干支、

酒精燈、火柴、接種環(huán)、玻璃利鏟、1ml無菌吸管、載玻片。

四、操作步驟

U放線菌形態(tài)觀察

（1）將玻璃紙剪成培養(yǎng)皿大小，用舊報紙隔層疊好后滅菌。

（2）將放線菌斜面菌種制成10-3的抱子懸液。

（3）將高氏一號瓊脂培養(yǎng)基熔化后在火焰旁倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿倒15ml左右，待培養(yǎng)基

凝固后，在無菌操作下用鑲子將無菌玻璃紙履蓋在瓊脂平板上即制成玻璃紙瓊脂平板培養(yǎng)基。

（4）分別用1ml無菌吸管取0.2ml吸水鏈霉菌（5102）泡子懸液，紫色直絲鏈霉菌抱子懸液分

別滴加在兩個玻璃紙瓊脂平板培養(yǎng)基上，并用無菌玻璃曲鏟涂抹均勻。

（5）將接種的玻璃紙瓊脂平板置28—30℃下培養(yǎng).

（6）在培養(yǎng)至3天，5天，7天時，從溫室中取出平皿。在無菌環(huán)境下。打開培養(yǎng)皿，用無菌

鐐子將玻璃紙與培養(yǎng)基分離，用無菌剪刀取小片置于載坂片上用顯微鏡觀察。

2、霉菌形態(tài)觀察

使用制水浸制片觀察法

在載玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉藍染色液或者蒸儲水，用解剖針從生長有霉菌的平板中

挑取少量帶有抱子的霉菌菌絲，用50%的乙醇浸潤，再用蒸饋水將浸過的菌絲洗一下，然后放入

載坂片上的液滴中，認真地用解剖針將菌絲分散開來。蓋上蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡，且不要再

移利蓋玻片），先用低倍鏡，必要時轉(zhuǎn)換高倍鏡鏡檢并記錄觀察結(jié)果。

五、實驗報告

1、繪出放線菌自然生長的個體形態(tài)圖。

2、給出根霉、青霉、曲霉的個體形態(tài)圖，并注明各部位名稱。

六、關(guān)鍵步驟及注意事項

1、倒平板要厚一些，接種時劃線要密。

2、插片時要有一定角度并與劃線垂直。

3、觀察時，宜用略暗光線；先用低倍鏡找到適當視野，更換高倍鏡觀察。

4、假如用0.1%美藍對培養(yǎng)后的蓋玻片進行染色后觀察，效果會更好。

七、思考題

1、為什么在培養(yǎng)基上放了玻璃紙后，放線菌仍能生長？

2、說檢時，你如何區(qū)分放線菌的基內(nèi)菌絲與氣生菌絲？

3、你認為霉菌與放線菌菌絲的要緊區(qū)別是什么？

實驗教案

課題（項目）名稱：酵母菌形態(tài)觀察與大小測定計劃學時：4

實驗類型：1.演示性口2.驗證性V3.綜合性口4.設計性口5.其它口

授課日期：2012年4月17日第一周星期二第5/6/7/8節(jié)

實驗三酵母菌形態(tài)觀察與大小測定

一、目的與要求

1、觀察酵母菌的形態(tài)及出芽生殖方式，學習區(qū)分酵母菌死活細胞的實驗方法

2、掌握酵母菌的通常形態(tài)特征及其與細菌的區(qū)別

3、熟悉目鏡測微尺與鏡臺測微尺的構(gòu)造與使用原理，掌握微生物細胞大小的測定方法

二、基本原理

1、關(guān)于形態(tài)觀察的原理

本實驗是通過美藍染液水受片與水-碘液水浸片老觀察酵母的形態(tài)。

用美藍對酵母的活細胞進行染色時，由于細胞的新陳代謝作用，細胞內(nèi)具有較強的還原能

力，能使美藍由藍色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型。因此，具有還原能力的酵母活細胞是無色的,

而死細胞或者代謝作用微弱的衰老細胞則是藍色或者淡藍色。

2、關(guān)于細胞大小測定的原理

微生物細胞大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的根據(jù)之一。微生物大小測定，

需在顯微鏡，借助特殊的測量工具一一目鏡測微尺與鏡臺測微尺。鏡臺測微尺是中央部分刻有

精確等分線的載玻片，目鏡測微尺是塊可放入接口鏡內(nèi)心圓形小玻片，測量時，需將其放在接

目鏡中心的隔板上，用以測量經(jīng)顯微鏡放大后的細胞物象。

球菌用直徑來表示大小，桿菌則用寬與長的范圍來表示。

目鏡測微尺

三、實驗器材

1、菌種

釀酒酵母

2、試劑

0.05%與0.1%呂氏堿性美藍染色液，革蘭氏染色液用碘液。

3、儀器或者其他用具

顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、載玻片、蓋玻片等

四、操作步驟

1、美藍浸片的觀察

(1)按無菌操作取少量酵母菌與0.1%呂式堿性美藍染色液混合均勻，放置約3mir后，先用低

倍鏡后用高倍鏡觀察酵母的形態(tài)與出芽情況，并用顏色區(qū)別死活細胞。

(2)染色0.5h后再次觀察，注意死細胞是否增加。

(3)用0.05%呂式堿性美藍染色液重復上述操作。

2.水一碘液浸片的觀察：

先滴加碘液后加水，取少量酵母菌混合均勻，蓋上蓋玻片觀察。

3、細胞大小的測定

(1)取一滴醉母菌菌懸液制成水浸片或者HD-1菌懸液。

(2)移去鏡臺測微尺，換上酵母菌水浸片，先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測

微尺來測量酵母菌(或者HDT)菌體的長，寬各占幾格(不足一格的部分估計到小數(shù)點后一位

數(shù))，測出的格數(shù)乘上目鏡測微尺每格的校正值，即等于該菌的長與寬。通常測量菌體的大小要

在同一個標本片上測定10—2C個菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小。而且通常是用對數(shù)

生長期的菌體進行測定。

五、實驗報告

繪圖說明你所觀察到的酵母菌的形態(tài)特征，并測定其大小。

六、注意事項

1、加染液不宜過多或者過少，否則，在蓋上蓋玻片時，菌液會溢出或者出現(xiàn)大量氣泡而影響觀

察。

2、蓋玻片不宜平著放下，以免產(chǎn)生氣泡影響觀察。

3、注意日測尺與物測尺的關(guān)系。

4、注意區(qū)分酵母菌的假絲狀體。

七、思考題

1.呂式堿性美藍染液濃度與作用時間的不一致，對酵母菌死細胞數(shù)量有何影響？試分析其原

因？

2.在顯微鏡下，酵母菌有什么突出的特征區(qū)別于通常細菌？

實驗教案

課題(項目)名稱：細菌培養(yǎng)基配制細菌的培養(yǎng)計劃學時:6

實驗類型：1.演示性口2.驗證性口3.綜合性V4,設計性口5.其它口

授課H期：20日年4月24日第十周星期二第5/6/7/8/9/10節(jié)

實驗四細菌培養(yǎng)基配制細菌的培養(yǎng)

一、目的要求

I.明確細菌培養(yǎng)基的配制原理；

2.通過對培養(yǎng)基的配制，掌握配制細菌培養(yǎng)基的通常方法與步驟：

3.熟悉細菌在細菌培養(yǎng)基上的培養(yǎng)過程。

二、基本原理

培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或者積存代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離

鑒定、儲存各類微生物或者積存代謝產(chǎn)物。牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基是一種應用最廣泛與最普通的

細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有牛肉膏、蛋白月東與氯化鈉。其中牛肉膏為微生物提供碳源、能源、磷酸

鹽與維生素，蛋白陳要緊提供氮源與維生素，而氯化鈉提供無機鹽。

牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基的配方如下：

牛肉膏3.0g

蛋白陳10.0g

NaCl5.0g

水1000ml

PH7.4-7.6

三、器材

1.菌種、溶液或者試劑

瓊脂，Imol/LNaOH,Imol/LHCI；

牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基。

2.儀器或者其他用具

試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙，高壓蒸氣滅菌鍋，pH

試紙(pH5.5?9.0),棉花，牛皮紙，記號筆，麻繩，紗布等。

四、操作步驟

1.稱量

按培養(yǎng)基配方比例依次準確地稱取牛肉膏、蛋白月東、NaCl放入燒杯中。牛肉骨常用玻棒挑

取，放在小燒杯或者表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量后直接

放入水中，這時如略微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分離，然后立即取出紙片。蛋白陳很易吸潮,

在稱取時動作要迅速。另外，稱藥品時嚴防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或者稱取一

種藥品后，洗凈、擦干，再稱取另一藥品，瓶蓋也不要蓋錯。

2.溶化

在上述燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。

待藥品完全溶解后，補充水分到所需的總體積。假如配制固體培養(yǎng)基，將稱好的瓊脂放入已溶

化的藥品中，再加熱溶化，在瓊脂溶化的過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯破裂。最

后補足所失的水分。

3.調(diào)pH

在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH值，假如pH偏酸，用滴管向培養(yǎng)基

中逐滴加入Imol/LNaOH,邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH值，直至pH達7.6。反之,

則用Imol/LHCl進行調(diào)節(jié)。注意pH值不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)，否則，將會影響培養(yǎng)基內(nèi)各

離子的濃度。

關(guān)于有些要求pH值較精確的微生物，其pH的調(diào)節(jié)可用酸度計進行

4.過濾

趁熱用濾紙或者多層紗布過濾，以利結(jié)果的觀察。通常無特殊要求的情況下，這一步能夠